Pesquisa Aplicação de Onda de Choque Induzida por Laser para Estudo de Lesão Coclear Induzida por Explosão

Resumo

Aqui, descrevemos protocolos experimentais para a criação de um modelo animal de lesão coclear induzida por explosão usando onda de choque induzida por laser (LISW). A exposição do osso temporal ao LISW permite a reprodução da fisiopatologia coclear induzida por blasto. Este modelo animal pode ser uma plataforma para elucidar a patologia coclear e explorar possíveis tratamentos para lesões por explosão.

Resumo

O ouvido é o órgão mais suscetível à sobrepressão de explosão, e as lesões cocleares ocorrem frequentemente após a exposição à explosão. A exposição à explosão pode levar à perda auditiva neurossensorial (PASN), que é uma perda auditiva irreversível que afeta negativamente a qualidade de vida. Patologias cocleares detalhadas induzidas por blastos, como perda de células ciliadas, neurônios ganglionares espirais, sinapses cocleares e ruptura de estereocílios, foram documentadas anteriormente. No entanto, determinar a deterioração neurossensorial coclear após uma lesão por explosão é um desafio, pois os animais expostos à sobrepressão da explosão geralmente apresentam perfuração da membrana timpânica (TMP), que causa perda auditiva condutiva concomitante. Para avaliar a disfunção coclear neurossensorial pura, desenvolvemos um modelo animal experimental de lesão coclear induzida por blasto usando uma onda de choque induzida por laser. Esse método evita TMP e lesões sistêmicas concomitantes e reproduz o declínio funcional do componente PASN de maneira dependente de energia após a exposição ao LISW. Este modelo animal pode ser uma plataforma para elucidar os mecanismos patológicos e explorar possíveis tratamentos para a disfunção coclear induzida por blasto.

Introdução

A perda auditiva e o zumbido estão entre as deficiências mais prevalentes, relatadas em até 62% dos veteranos¹. Várias complicações auditivas induzidas por blastos, incluindo perda auditiva neurossensorial (PASN) e perfuração da membrana timpânica (PTM), têm sido relatadas em indivíduos expostos à sobrepressão blástica². Além disso, pesquisas em indivíduos expostos a blastos sugerem que a exposição ao blasto freqüentemente resulta em defeitos na resolução temporal auditiva, mesmo quando os limiares auditivos estão dentro da normalidade, o que é conhecido como "perda auditiva oculta (HHL)^"3. Está bem estabelecido que há uma perda substancial de sinapses cocleares entre as células ciliadas internas (CCIs) e os neurônios auditivos (NAs) na patologia coclear relacionada à explosão⁴. A degeneração sináptica resulta em comprometimento do processamento auditivo e é um dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento da HHL⁵. Assim, os órgãos auditivos são componentes frágeis contendo estruturas complexas e altamente organizadas. No entanto, o mecanismo preciso pelo qual as ondas de choque afetam o ouvido interno no nível celular permanece obscuro. Isso se deve aos desafios em replicar as complexidades clínicas e mecânicas precisas das lesões por explosão em ambientes de laboratório e à complexidade das patologias cocleares induzidas por blasto.

O principal componente de uma lesão por explosão é a onda de choque (SW), caracterizada por um aumento rápido e alto na pressão de pico⁶. A complexidade das lesões por explosão tem sido extensivamente investigada em vários estudos retrospectivos ^7,8,9. Existem vários dispositivos para geração de explosões, como gás comprimido¹⁰, tubos de choque¹¹ e explosivos de pequena magnitude¹², em diferentes níveis de pressão. A forma de onda de pressão do SW gerada por dispositivos desenvolvidos recentemente se assemelhava muito à de uma explosão real. Um conceito importante no estabelecimento de um modelo animal de perda auditiva neurossensorial induzida por explosão é minimizar lesões concomitantes, além de danos auditivos, para reduzir a morte animal. Assim, estudos de lesões por explosão foram desenvolvidos nos quais os tubos de choque foram miniaturizados e a saída pode ser controlada com precisão para que os animais expostos raramente morram. No entanto, embora esses modelos animais geralmente desenvolvam complicações, como a PTM, a avaliação da função coclear é difícil devido à perda auditiva condutiva concomitante². Anteriormente, realizamos um estudo em animais com orelha protegida sobre lesão por explosão usando tampões de ouvido e não encontramos incidência de TMP¹³. Os tampões auditivos podem atenuar parcialmente os danos cocleares graves, mas não a neurodegeneração auditiva central ou o desenvolvimento do zumbido. Assim, os tampões de ouvido protegem a cóclea, bem como a membrana timpânica. No entanto, um modelo animal de dano coclear puro induzido por explosão sem TMP é necessário para estudar a fisiopatologia coclear causada por lesões por blasto.

Anteriormente, desenvolvemos um modelo de lesão por explosão tópica da orelha interna em ratos e camundongos usando uma onda de choque induzida por laser (LISW)^14,15. Este método pode ser realizado com segurança e facilidade em nível laboratorial padrão e tem sido usado para gerar modelos de lesões pulmonares e por explosão craniana^16,17. A energia do LISW pode ser ajustada alterando o tipo e a potência do laser, permitindo o controle sobre o grau de dano coclear. O modelo de lesão coclear induzida por LISW é valioso para estudar os mecanismos de PASN causados por lesões por explosão e investigar possíveis tratamentos. Neste estudo, descrevemos protocolos experimentais detalhados para criar um modelo de camundongo de dano coclear induzido por explosão usando LISW e demonstramos a degeneração coclear, incluindo a perda de células ciliadas (HCs), sinapses cocleares e neurônios ganglionares espirais (SGNs), de maneira dependente de energia em camundongos após a exposição ao LISW.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Defesa Nacional (aprovação # 18050) e realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e seu sofrimento.

1. Animais

1. Use camundongos CBA/J machos de 8 semanas de idade para seguir este protocolo. Antes do experimento, submeta os camundongos a um teste de função auditiva e observação endoscópica da membrana timpânica para garantir a normalidade.
2. Divida 27 camundongos CBA/J em três grupos: (1) 2,0 J/cm² grupo exposto (n = 9 camundongos); (2) grupo exposto a 2,25 J/^cm2 (n = 9 camundongos); e (3) grupo exposto a 2,5 J/^cm2 (n = 9 camundongos). Remova todas as orelhas para avaliação 1 mês após a exposição ao LISW.

2. Configurações experimentais de exposição LISW

1. O alvo do laser é um disco preto de borracha natural, com 10 mm de diâmetro e 0,5 mm de espessura. Para aumentar o impulso LISW, use um adesivo de soldagem de resina acrílica para colar uma folha de tereftalato de polietileno transparente (PET) de 1,0 mm de espessura na parte superior da área alvo. Irradie um laser Nd:YAG Q-switched de 532 nm para gerar o LISW atrás do alvo (Figura 1A).
2. Focalize o pulso de laser com uma lente plano-convexa em um ponto de 3,0 mm de diâmetro no alvo do laser.
3. Use a irradiação LISW para gerar plasma na superfície de ligação dos dois materiais e vaporize a borracha (ablação mediada por plasma), deixando a borracha vaporizada na cavidade.
4. Use um hidrofone para medir a onda de pressão de LISW a 1,0 mm debaixo d'água, não em tecido vivo. Coloque um hidrofone de fibra óptica de 0,25 mm de diâmetro sob a borracha preta 1,0 mm abaixo da superfície da água para registrar as formas de onda de pressão LISW e medi-las usando um osciloscópio digital.
   NOTA: As formas de onda de pressão mostraram características estáveis com pressão e impulso máximos semelhantes, conforme mostrado na Figura 1B.
5. Realize todos os procedimentos em animais sob anestesia geral usando injeções intraperitoneais de cloridrato de medetomidina 1 mg / kg e 75 mg / kg de cetamina. Aplique uma pomada oftálmica em ambos os olhos do camundongo para evitar o ressecamento e fornecer suporte térmico.
6. Depile cuidadosamente as regiões pós-auriculares para evitar reter o ar preso no pelo. Fixe os mouses em uma placa e posicione as regiões pós-auriculares na área focal do LISW verticalmente para cima.
7. Prenda um alvo de borracha preta percutaneamente na região pós-auricular da orelha do rato. Para garantir a correspondência de impedância acústica, use um gel condutor de ultrassom entre o alvo do laser e a superfície da pele.
8. Aplique um único pulso LISW na cóclea através do osso temporal. Defina as saídas dos pulsos de laser para três densidades de energia: 2.0 J/cm² , 2.25 J/cm² e 2.5 J/cm².

3. Teste de função coclear

NOTA: Os testes de potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE) foram realizados conforme relatado anteriormente^14,15.

1. Realize a medição do ABR 1 dia antes e 1 dia e 1 mês após a exposição ao LISW.
2. O PEATE é um potencial evocado auditivo em resposta a estímulos auditivos e é comumente utilizado para avaliar os limiares auditivos em quatro frequências (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz).
3. Apresente o som de estimulação em um fone de ouvido pequeno e meça o nível de pressão sonora próximo à membrana timpânica do mouse usando um pequeno microfone colocado próximo ao fone de ouvido. Emite estímulos de explosão de um gerador de som a 37 ciclos/s e amplifica a pressão sonora de um nível de pressão sonora (SPL) de 20 dB para 80 dB SPL em passos de 5 dB SPL.
4. Insira um eletrodo de agulha de aço inoxidável para registro de eletroencefalograma sob o canal auditivo e a região frontal da orelha e insira um eletrodo de aterramento sob a região caudal da cauda.
5. Avaliar as funções cocleares medindo a amplitude do PEATE pico I (P1). Analisar automaticamente as formas de onda do PEATE em relação aos limiares auditivos e à amplitude do PEATE P1 usando o software de análise de pico do PEATE conforme relatado anteriormente¹⁸.
6. Calcule as mudanças do limiar do ABR subtraindo os limiares obtidos antes da exposição. Comparar os desvios do limiar do PEATE nos três grupos expostos com os das orelhas contralaterais não expostas (controle). Meça as amplitudes do ABR usando a forma de onda do ABR durante a estimulação de 80 dB SPL.

4. Avaliação histológica

NOTA: A avaliação histológica foi realizada conforme descrito anteriormente ^14,15.

1. HCs e sinapse coclear
   1. Realize o exame patológico da cóclea 1 mês após a exposição ao LISW.
   2. Confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé antes da perfusão. Após hemoperfusão com solução de Ringer com lactato, realizar perfusão transcardíaca com 1 mL/g de paraformaldeído (PFA) a 4%. Após a decapitação, remova a cóclea e perfunda diretamente com PFA a 4%, seguido de fixação a 4 °C durante a noite.
   3. Após a fixação, descalcifique a cóclea agitando em solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mol/L por 2 dias.
   4. Divida a cóclea desmineralizada em quatro partes. Após congelar cada pedaço de cóclea em gelo seco por 10 min, execute o bloqueio em temperatura ambiente por 1 h em soro de cavalo normal a 5% simplesmente conjugado com Triton X a 0,3% para permeabilização.
   5. Use anticorpos antimiosina 7a (Myo7A), proteína de ligação anti-C-terminal (CtBP2) e antineurofilamento (NF) como anticorpos primários e incubados a 37 ° C durante a noite. Use anticorpos Myo7A, CtBP2 e NF para avaliar HCs, fitas pré-sinápticas e fibras nervosas cocleares, respectivamente.
   6. Lave o anticorpo primário não ligado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 x 3 min. Incubar as amostras com os anticorpos secundários apropriados a 37 °C durante 2 h. Após a coloração, lave as amostras por 3 x 5 min com PBS e encapsule as amostras no vidro deslizante com um encapsulante solúvel em água usando vidro de cobertura.
   7. Para avaliação, adquira a imagem inteira da cóclea (dividida em quatro partes) com ampliação de 10x e calcule o mapa de frequência coclear usando o plug-in do software ImageJ referenciado para localizar com precisão as regiões cocleares específicas nas frequências de 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz e 24,0 kHz.
   8. Calcule as taxas de sobrevivência do HC e o número de sinapses em cada frequência.
      1. Para calcular as taxas de sobrevivência dos HCs, conte o número de HCs sobreviventes e ausentes por 200 μm de comprimento em cada frequência e calcule a taxa de sobrevivência dos HCs usando a equação (1) mostrada abaixo:
         Taxa de sobrevivência do HC (%) = (Número de HCs sobreviventes / Número de HCs sobreviventes e ausentes) × 100 (1)
      2. Para calcular o número de sinapses, obtenha imagens de pilha z de alta resolução da área interna do HC usando uma lente objetiva de imersão em óleo (63×) com zoom digital de 3,1x e tamanho de passo de 0,25 μm sob microscopia de fluorescência confocal. Importe as pilhas de imagens para o ImageJ e conte automaticamente os pontos CtBP2 por IHC dentro de uma faixa de 50 μm em cada pilha de imagens. Calcule a taxa de sobrevivência das fitas sinápticas usando a equação (2):
         Taxa de sobrevivência das fitas sinápticas (%) = (Número de fitas sinápticas nas orelhas expostas LISW / Número de fitas sinápticas nas orelhas de controle) × 100 (2)
   9. Para microscopia eletrônica de varredura (MEV), remova a cóclea, conforme descrito anteriormente, e fixe com PFA a 2% e glutaraldeído a 2,5% juntos a 4 ° C durante a noite. Após a descalcificação da cóclea agitando em solução de EDTA 0,5 mol/L a 4 °C durante 7 dias, dissecar as cócleas em quatro pedaços para preparação de montagem completa.
   10. Fixar os tecidos com tetróxido de ósmio a 1% a 4 °C durante 30 min, desidratar em etanol a 50% à temperatura ambiente durante 10 min, repetir com etanol a 70 %, 80 %, 95 % e, em seguida, etanol a 100 %, revestir por pulverização catódica com ósmio e examinar ao microscópio eletrónico a 5,0 kV, conforme relatado anteriormente¹⁴.
   11. Realize uma análise quantitativa da ruptura do feixe estereociliar nas células ciliadas externas (OHCs) calculando a proporção de estereocílios interrompidos (número de estereocílios OHC interrompidos / número total de estereocílios OHC) em cada grupo de energia usando as imagens SEM¹⁴. Conte o número de estereocílios por 100 μm no centro das regiões de 16,0 e 24,0 kHz. Designe uma ou mais fileiras de feixes de CCE que estão dobrados para o lado lateral, emaranhados ou sem a base como interrompida.
2. SGNs
   1. Para avaliar quantitativamente o número de SGNs 1 mês após a exposição ao LISW, realizar perfusão transcardíaca com PBS a 4%, decapitar, remover a cóclea e realizar fixação posterior nas mesmas condições descritas acima. Descalcifique a cóclea em EDTA 0,5 M por 1 semana.
   2. Após a descalcificação, mergulhar as cócleas em sacarose a 30% durante a noite, incorporá-las no composto de criossecção, congelar em nitrogênio líquido para preparar cortes próximos ao canal de Rosenthal com espessura de 15 μm, corar com hematoxilina e eosina e visualizá-las ao microscópio óptico¹⁴.
   3. Para medição de densidade de SGN, conte o número de SGNs na volta média do canal de Rosenthal e calcule a sobrevivência do SGN por controle.

5. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando o software de sua escolha.
2. Analise as diferenças estatísticas no deslocamento do limiar do ABR, HC, SGN e contagens sinápticas usando ANOVA de medidas repetidas de duas vias ["frequência ou partes cocleares (apical/média/base)" × "grupos de animais"], análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguida de teste de comparação múltipla de Tukey post-hoc.
3. Apresentar todos os dados como média ± erro padrão e definir o nível de significância estatística em p < 0,05.

Resultados

Forma de onda LISW
A reprodutibilidade da forma de onda de pressão LISW foi medida 5x a 2,0 J/^cm2 da seguinte forma. As formas de onda foram geralmente semelhantes e estáveis e mostraram um aumento acentuado com largura de tempo, pressão de pico e impulso de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa e 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± DP), o que corresponde às características do SW (Figura 1B). Os LISWs são caracterizados por um tempo de subida rápido, alta pressão de pico, curta duração e dominância de pressão positiva. Quando aplicado ao tecido biológico, o alvo é colocado diretamente no tecido vivo através da geléia, e pode-se considerar que o SW tem quase as mesmas características do SW medido aplicado ao tecido. Após a exposição ao LISW, a ocorrência de TMP foi avaliada usando um pequeno endoscópio digital. Nenhum dos camundongos do grupo de energia LISW exibiu TMP após a exposição (Figura 1C).

Avaliação auditiva
Um exame de PEATE foi realizado para determinar a função auditiva. O PEATE é uma medida do potencial evocado pelo som na via auditiva, e o PEATE P1 representa a atividade neural acumulada no nervo coclear. Um dia após a exposição ao LISW, a orelha exposta mostrou uma diferença significativa no desvio do limiar do PEATE entre os diferentes grupos LISW (ANOVA de duas vias, p < 0,0001; Figura 2A). Esse aumento na mudança do limiar do PEATE persistiu por até 1 mês após a exposição ao LISW nos grupos de 2,25 e 2,5 J/^cm2 (ANOVA de duas vias, 2,25 J/^cm2, p < 0,0001; 2,5 J/^cm2, p < 0,0001). Em particular, a região de alta frequência exibiu um aumento notável na mudança do limiar do ABR. No entanto, os limiares do PEATE se recuperaram para um nível que não foi significativamente diferente da pré-irradiação no grupo 2,0 J (ANOVA de duas vias, 2,0 J / cm², p = 0,76), indicando que a elevação do limiar era dependente de energia. Em relação às amplitudes do PEATE P1, todos os grupos irradiados com LISW apresentaram uma diminuição significativa nas amplitudes do PEATE P1 em todas as frequências 1 dia e 1 mês após a exposição ao LISW (ANOVA bidirecional, p < 0,0001; Figura 2B). A orelha não exposta (controle; orelha esquerda) não apresentou alterações perceptíveis no limiar auditivo do PEATE após a exposição ao LISW (dados não mostrados).

Sobrevida de HCs e SGN
A observação microscópica das orelhas expostas ao LISW não revelou danos mecânicos à cóclea, como fratura e luxação dos ossículos, ruptura da membrana da janela redonda ou hemorragia intracoclear, após a exposição ao LISW (dados não mostrados), o que é consistente com achados anteriores ^6,14.

A imunomarcação fluorescente de HCs com Myo7A, fitas sinápticas com CtBP2 e nervo coclear com NF é mostrada na Figura 3A. Nenhum dano coclear grave, como perda de HCs ou fibras nervosas, foi observado em nenhum dos grupos. No entanto, a avaliação quantitativa da sobrevida positiva para OHCs Myo7A diferiu significativamente entre os grupos (ANOVA de duas vias, p = 0,002; Figura 3B). O grupo 2,5 J/^cm2 apresentou taxas de sobrevida significativamente menores de CCEs do que o grupo controle, especialmente na região de alta frequência (ANOVA de duas vias, 2,5 J/^cm2, p = 0,0002). No entanto, as taxas de sobrevida das CCIs foram comparáveis entre os grupos, indicando que as CCE são vulneráveis ao LISW de alta energia (ANOVA de duas vias, p = 0,76). Uma avaliação quantitativa da sobrevivência da fita sináptica é mostrada na Figura 3C. As fitas sinápticas foram significativamente reduzidas nos grupos 2,25 e 2,5 J/^cm2 em comparação com o controle (ANOVA de duas vias, 2,25 J/^cm2, p < 0,0001; 2,5 J/^cm2, p < 0,0001), e as frequências mais altas exibiram uma tendência mais forte de diminuição, semelhante à mudança do limiar do PEATE e sobrevida das CCE.

Em seguida, foi avaliada a densidade do SGN, conforme mostrado na Figura 3D. Houve uma diferença significativa na densidade do GSN entre os grupos (ANOVA de duas vias, p = 0,76), e o grupo de 2,5 J/^cm2 apresentou taxas de sobrevida significativamente menores de SGN em comparação com os grupos controle (ANOVA de duas vias, 2,5 J/^cm2, p = 0,007). No entanto, os grupos 2,0 e 2,25 J/^cm2 apresentaram sobrevida comparável ao SGN em comparação com os controles. Esse resultado indica que a gravidade da degeneração coclear e da disfunção auditiva depende da exposição à energia LISW, o que é consistente com os resultados de sobrevida do PEATE e do PCR.

Feixe estereociliar
Observamos um aumento notável no limiar do PEATE, aproximadamente 30 dB, nos grupos 2,25 e 2,5 J/^cm2 nas frequências acima de 20 kHz, que persistiu até 1 mês após a exposição ao LISW (como mostrado na Figura 2A). No entanto, o deslocamento do limiar de 30 dB que observamos não pode ser atribuído apenas à perda de CCEs, degeneração das sinapses cocleares ou redução do número de CCGs (Figura 3). Um estudo anterior indicou que os desvios do limiar do PEATE foram mínimos quando o número de fitas sinápticas diminuiu em 50%¹⁹. Portanto, realizamos MEV para investigar a causa da elevação do limiar do PEATE. Após a exposição ao LISW a uma intensidade de 2,5 J / cm², alguns feixes estereociliares de OHCs pareceram ser interrompidos, particularmente em regiões de alta frequência (Figura 4A), o que pode ser uma das causas do aumento do limiar ABR após a exposição ao LISW. A avaliação quantitativa da ruptura estereociliar revelou que a taxa de ruptura tendia a ser maior na região de frequência mais alta de maneira dependente de energia (Figura 4B).

Figura 1: Configurações experimentais e perfil de pressão do LISW. (A) Configuração experimental para gerar LISW em animais. (B) Características das formas de onda de pressão LISW definidas em 2,0 J/cm². (C) Imagens representativas da membrana timpânica. As PTMs não foram observadas em nenhuma das orelhas expostas ao LISW. Como referência, a TMP induzida por explosão representativa (pontas de setas amarelas) é mostrada usando um tubo de explosão. Abreviaturas: LISW = onda de choque induzida por laser; PET = tereftalato de polietileno; TMP = perfuração da membrana timpânica; YAG = granada de ítrio e alumínio; SHG = segunda geração harmônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados do PEATE após a exposição ao LISW. (A) Mudanças significativas no limiar do PEATE foram observadas em todos os grupos 1 dia após a exposição ao LISW. As mudanças no limiar do ABR nos grupos de 2,25 e 2,5 J/^cm2 permaneceram significativamente elevadas por até 1 mês após a exposição ao LISW. (B) A amplitude do PEATE P1 1 dia e 1 mês após a exposição ao LISW diminuiu significativamente em todos os grupos. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos em comparação com os valores pré-exposição (**p < 0,001, ****p < 0,0001). As barras de erro indicam o erro padrão da média. Abreviaturas: PEATE = resposta auditiva do tronco encefálico; LISW = onda de choque induzida por laser; P1 = pico 1; NPS = nível de pressão sonora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Patologia coclear após exposição ao LISW. (A) Imagens de fluorescência confocal do órgão de Corti na região de 20 kHz coradas com Myo7A (azul), CtBP2 (vermelho) e NF (verde) após exposição ao LISW. (B) As porcentagens médias de HCs sobreviventes são mostradas nos citococleogramas. A avaliação quantitativa revelou uma perda significativa de CCE a 2,5 J/^cm2, embora não tenha havido diferença significativa na sobrevida das CCI entre os grupos. (C) A taxa de sobrevivência das fitas pré-sinápticas em comparação com os valores pré-exposição diminuiu significativamente nos grupos de 2,25 e 2,5 J / cm² . (D) Fotomicrografias representativas de SGNs em todos os grupos 1 mês após a exposição ao LISW. A taxa de sobrevivência do SGN diminuiu significativamente em 2,5 J/^cm2. Os asteriscos indicam diferenças significativas em comparação com os valores pré-exposição (**p < 0,001, ****p < 0,0001). As barras de erro indicam o erro padrão da média. Barras de escala = 5 μm (A), 100 μm (D). Abreviaturas: LISW = onda de choque induzida por laser; IHQ = célula ciliada interna; NF = neurofilamento; CCE = célula ciliada externa; SGN = neurônio do gânglio espiral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estruturas de superfície de OHCs. (A) Imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura de estereocílios OHC nas regiões de 16 kHz e 24 kHz do órgão de Corti um mês após a exposição ao LISW. A ruptura estereociliar é observada em imagens ampliadas da área encaixotada no grupo de 2,5 J/^cm2 (área de 24 kHz). Barra de escala -= 2 μm. (B) A taxa de ruptura estereociliar foi maior com o aumento da sobrepressão LISW. Abreviaturas: LISW = onda de choque induzida por laser; OHC = células ciliadas externas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este estudo teve como objetivo validar um modelo de camundongo de dano coclear induzido por blasto usando LISW. Nossos achados demonstraram que, após a aplicação do LISW através do osso temporal, a orelha dos camundongos expostos exibiu um declínio patológico e fisiológico consistente na cóclea, que foi acompanhado por um aumento na sobrepressão do LISW. Esses resultados indicam que este modelo de camundongo é apropriado para replicar várias patologias cocleares, ajustando a saída LISW. Especificamente, este modelo de camundongo com disfunção coclear induzida por LISW pode servir como um bom modelo de lesão coclear devido à sua natureza controlada, reprodutível e quantificável, bem como sua capacidade de reproduzir o declínio coclear fisiopatológico sob condições controladas.

Nosso estudo anterior usou um modelo de rato e observou degeneração coclear induzida por LISW, incluindo elevação dos limiares auditivos, perda de fitas sinápticas e ruptura do feixe estereociliar¹⁴. Outro estudo investigou a degeneração coclear fisiopatológica após lesão blástica em camundongos usando dois tipos de blastos com características diferentes: dominante de baixa frequência usando um tubo de explosão e dominante de alta frequência usando LISW¹⁵. Eles determinaram que a frequência dominante do espectro de potência do blasto foi o principal fator na determinação da região do dano coclear, conforme relatado anteriormente¹⁵. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a demonstrar a metodologia detalhada da exposição coclear LISW e a degeneração coclear induzida por LISW dependente de energia e frequência.

Utilizamos a exposição LISW para danificar a cóclea através do osso temporal pós-auricular em vez de através do canal auditivo externo para criar um modelo que envolvesse apenas danos cocleares sem qualquer TMP ou descontinuação da cadeia ossicular. Nossos achados implicam que a deficiência auditiva demonstrada neste estudo foi decorrente da deterioração dos componentes neurossensoriais da via auditiva. Estudos recentes indicaram que o TMP pode servir como um amortecedor contra danos à cóclea, absorvendo a energia SW ^2,20,21. Este modelo LISW foi incapaz de induzir TMP, mesmo com LISW de alta intensidade, porque o SW foi irradiado diretamente para a orelha interna e não através da membrana timpânica. Portanto, para analisar a perda auditiva mista com TMP e PASN, uma explosão de alta intensidade gerada usando uma explosão real ou tubo de choque é ideal. A escolha do tipo de explosão depende do uso específico ou do objetivo do estudo. Portanto, este modelo de lesão animal baseado em LISW é útil para elucidar a fisiopatologia coclear induzida por explosão pura sem TMP, resultando em perda auditiva condutiva. De outra perspectiva, a irradiação LISW necessitou de 1 h/animal, incluindo a montagem do equipamento e a verificação da membrana timpânica após a irradiação. Portanto, se vários animais foram expostos ao LISW em uma fileira dentro de 1 dia, é difícil medir a irradiação LISW e o ABR no mesmo dia com uma única dose de anestésico. Devido ao risco de morte do animal ao aumentar a dose do anestésico, neste estudo, optou-se por realizar as medidas do PEATE no dia seguinte, e não imediatamente após a irradiação no mesmo dia.

Na lesão por explosão, a fase primária é causada pelas forças físicas da explosão e rápida transmissão de SW com alterações significativas na densidade tecidual, como junções tecido-ar²². Portanto, considera-se que a maioria das lesões cocleares induzidas por explosão surge do SW durante a fase primária⁶, sugerindo que estudos sobre lesões cocleares expostas ao SW são cruciais para a compreensão dos mecanismos da disfunção coclear induzida por blasto. A criação de um SW usando um pulso de laser de alta energia em um material sólido é conhecida como LISW. Estudos anteriores usaram LISW para desenvolver modelos animais de lesões cerebrais e pulmonares traumáticas induzidas por explosão^16,17. Os benefícios do uso do LISW para estudos relacionados à explosão incluem seu modelo de dano repetível dependente da intensidade do laser e direcionamento específico do órgão lesionado porque o LISW não afeta áreas fora da área-alvo.

Neste estudo, descobrimos que o LISW provoca alterações patológicas nos HCs cocleares, SGNs, suas sinapses e no feixe estereociliar, semelhante ao dano causado pela lesão por explosão real¹². Os danos infligidos por várias formas de insultos cocleares, como a perda auditiva induzida por ruído, podem ser atribuídos a dois fatores fundamentais: estresse mecânico direto e ruptura metabólica secundária. Propomos que a ruptura do feixe estereociliar é a patologia primária resultante do estresse mecânico direto do LISW. Os distúrbios estereociliares são patologias comuns associadas à disfunção auditiva relacionada à idade e induzida por^ruído23,24. O mecanismo exato subjacente a essa ruptura estereociliar ainda não foi elucidado. Um estudo anterior revelou que a ruptura estereociliar foi observada 1 semana após a exposição à explosão¹². Uma possível razão para essa mudança morfológica única pode ser a desconexão das ligações da ponta e das ligações laterais entre os estereocílios da fileira mais externa perturbada e os estereocílios da fileira do meio¹⁴. Além disso, as radículas da fileira mais externa de estereocílios, que consistem em actina e proteínas de agrupamento, como o TRIOPP, também são danificadas mecanicamente¹⁵.

Insultos cocleares geralmente levam a uma maior interrupção dos processos metabólicos que podem persistir por dias ou até meses¹⁹. Em particular, as sinapses na cóclea, responsáveis pelo processamento do som auditivo, são altamente vulneráveis à exposição a blastos²⁵. Nossos modelos animais mostraram que a degeneração da função dos NAs, demonstrada pelo declínio nas amplitudes do PEATE P1, foi causada por dano coclear induzido por LISW. Um possível mecanismo de sinaptopatia coclear induzida por LISW é a liberação excessiva de glutamato pelas CCI, como a ototoxicidade do glutamato²⁶. A exposição ao LISW faz com que a membrana basilar vibre violentamente, causando liberação excessiva de glutamato da IHQ, o que resulta em degeneração da AN. O LISW pode replicar o tipo de toxicidade do glutamato que afeta a cóclea, levando à sinapopatia coclear e a um declínio no número de sinapses sem danificar os HCs. Outro mecanismo possível é que a exposição ao LISW pode danificar as células de suporte cocleares, o que contribui para a sobrevivência dos ANFs dependendo da liberação de neurotrofinas²⁷. Além disso, o LISW pode ser transmitido diretamente aos ANFs e causar danos neurais. Consequentemente, nossos modelos de dano coclear induzido por LISW podem ser valiosos tanto para a pesquisa de blastos quanto para o exame de diversas formas de degeneração coclear que envolvem sinaptopatia coclear.

Há uma necessidade urgente de intervenções terapêuticas para lidar com a perda auditiva induzida por blasto, destacando a importância de estratégias de tratamento com foco na sinaptopatia coclear ou ruptura do feixe estereociliar em CCE. Essas abordagens também podem ser aplicadas a outros tipos de distúrbios auditivos com mecanismos patológicos semelhantes. A sinaptopatia coclear foi observada em nosso modelo de disfunção coclear induzida por blasto, sugerindo que pode ser um alvo terapêutico promissor. O LISW pode ser usado para criar modelos de camundongos que replicam com precisão a fisiopatologia coclear causada por blastos, e esses modelos podem ser usados para estudar vários tipos de disfunções cocleares.

Nosso estudo tem várias limitações. Primeiro, medimos os limiares do PEATE em 12-24 kHz. De acordo com um estudo anterior, o dano coclear induzido por LISW resulta em perda auditiva de alta frequência em animais devido às características do SW e à vulnerabilidade da base coclear. Mais estudos de PEATE são necessários em regiões de frequência mais amplas (>24 kHz). Em segundo lugar, neste estudo, realizamos apenas uma avaliação histológica da cóclea e não avaliamos a via auditiva central. A deficiência auditiva na lesão blástica não se limita apenas à cóclea, mas é uma deficiência complicada do tronco encefálico e do sistema auditivo central. No futuro, seria desejável avaliar o centro auditivo em modelos animais expostos ao LISW.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laser Q-switched Nd:YAG de 532 nm	Quantel	Brilliant b
Software de análise de pico ABR	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Adesivo de soldagem de resina acrílica	Acrysunday Co., Ltd	N/A
microscopia de fluorescência confocal	Leica	TCS SP8
composto de crioseccionamento	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2	anticorpo BD Transdução	# 612044
Espelhos multicamadas dielétricos	SIGMAKOKI CO., LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Osciloscópio	digitalFone	de ouvido Tektronix DPO4104B
	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.
Image J software plug-in	NIH	linha de medição	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
microscópio óptico	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A anticorpo	Proteus Biosciences	#25– 6790
Anticorpo de neurofilamento	Sigma	#AB5539
lente plano-convexa	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Software de prisma	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Microscópio eletrônico de varredura	JEOL Ltd	JSM-6340F
Pequeno endoscópio digital	AVS Co. Ltd	AE-C1
Geléia ultrassônica	Hitachi Aloka Medical	N/A
Atenuador variável	Showa Optronics Co.	N/A	Sucessor atualmente disponível: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Encapsulante solúvel em água	Dako	#S1964