Fabricação dos canais microfluídicos Termoplásticos

Resumo

Aqui demonstramos como fabricar chips microfluídicos termoplástico usando estampagem a quente e selagem a quente. Então demonstrar como usar a luz na superfície situ dirigido enxertia e polimerização através do chip lacrado para formar o composto colunas fase sólida.

Resumo

Em nosso laboratório, conseguimos isolados ácidos nucléicos diretamente microlitro e submicroliter volumes de sangue humano, urina e fezes utilizando polímero / composto de nanopartículas de lise micro e colunas de extração em fase sólida. As amostras recuperadas estão concentradas, as amostras de pequeno volume que são PCRable, sem qualquer limpeza adicional. Aqui, demonstramos como fabricar chips microfluídicos termoplástico usando estampagem a quente e selagem a quente. Então, demonstrar como usar a luz na superfície situ dirigido enxertia e polimerização através do chip lacrado para formar o composto colunas fase sólida. Demonstramos enxertia e de polimerização de um nanotubo de carbono coluna / polímero para a lise celular bacteriana. Em seguida, mostrar o processo de lise seguido por extração em fase sólida de ácidos nucléicos a partir da amostra no chip usando um sílica / polímero coluna composta. Os protocolos anexos contêm instruções detalhadas sobre como fazer tanto lise e colunas de extração em fase sólida.

Protocolo

Os canais microfluídicos são fabricados em uma poliolefina cíclico (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex tem uma temperatura de transição vítrea (T _g) de 136 ° C e é UV transparente, o que é essencial para a química de luz dirigido usado na formação porosa monólito. Os microcanais são fabricados por micro-hot-relevo com um eletroformada Nico mestre-mofo, que tem a negativa (inversa) os recursos da plataforma microfluídica. A estampagem a quente é feito da seguinte forma:

1. O molde eo substrato de polímero são colocados entre duas Placas metálicas paralelas.
2. Os pratos são aquecidos até a temperatura embossing (166 ° C), que é de 30 º C acima da T _g de Zeonex.
3. Os pratos são então pressionados juntos por cerca de 5 min ea pressão é mantida em 250 psi.
4. O molde eo substrato são então removidos da platens aquecida, deixou esfriar por 1-2 min, e depois manualmente separados uns dos outros.
5. Poços de 1,5 mm de diâmetro são perfurados nas extremidades dos canais para a introdução da amostra e coleta.
6. O substrato plástico é, então, em relevo termicamente ligado com outro pedaço de Zeonex fechado para formar canais microfluídicos. O substrato em relevo e a peça de tampa pode ser de ozônio UV ou plasma tratados antes da colagem térmica para melhorar a eficiência de vedação e garantir a fidelidade da estrutura de canal fechado (Bhattacharyya e Klapperich, 2007).

Fabricação de extração de fase sólida coluna (SPE) dentro dos canais microfluídicos de plástico

Fabricação da fase sólida é um processo de duas etapas. Na primeira, os microcanais fabricados são superfície modificada, a fim de melhorar a aderência da coluna SPE para o dispositivo de plástico. Enxertia via fotopolimerização de superfície é usado para funcionalizar as paredes dos microcanais poliméricos.

O procedimento de enxerto é a seguinte:

1. Os microcanais são preenchidos com uma mistura 1:1 de diacrilato de etileno (EDA) e metacrilato de metila (MMA) com benzofenona 3%, que é um fotoiniciador hidrogênio abstrair. A EDA, MMA e benzofenona forem comprados de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. O chip é então UV-irradiado por 10 min a 254 nm de comprimento de onda UV e 200 mJ / cm ² de energia em um instrumento exposição aos raios ultravioleta (CL-1000 Agente de crosslinking UV, UPV Inc., Upland, CA). A enxertia ocorre via abstração H-polimerização e resulta em correntes de superfície amarrados polímero, que são incorporadas dentro da mistura de polimerização utilizado para a preparação do monolito na segunda etapa.
3. O monômero em excesso é removido os canais de lavagem com 15 mL de metanol por meio de aspiração a vácuo.

Após o processo de photografting, um polímero microporoso monólito é formada dentro da microcanais que prender as partículas de sílica para extração de DNA. O monólito poroso é preparado in situ da seguinte forma:

1. Os canais de superfície modificada são preenchidos com uma mistura de precursor monólito consistindo de Buma (15% em peso), EDMA (10% em peso), 1-dodecanol (52,5% em peso), ciclohexanol (22,5% em peso), DMPAP (wt 1% com relação de monômeros) e 0,7 mM partículas de sílica (15% em relação ao volume total da mistura pré-polímero). A sílica microesferas foram adquiridos da Polysciences, Inc. (Warrington, PA) e os monômeros e solventes porogenic forem comprados de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. O chip é irradiada com UV no reticulador UV a 200 mJ / cm ² para 1,1 min para iniciar a polimerização e do monômero em excesso é removido os canais de lavagem com 15 mL de metanol por meio de aspiração a vácuo.
3. As conexões fluídicas ^(TM NanoPorts conexões, Upchurch Científico, Oak Harbor, WA) são fixadas sobre a introdução e poços de captação dos canais microfluídicos.
4. O monólito poroso é lavada novamente com metanol por pelo menos 30 min usando a bomba de seringa a uma vazão de 100mL/hour.

Fabricação de CNT lise monólito dentro dos canais microfluídicos de plástico

Fabricação do (nanotubos de carbono) lise CNT monólito é um processo de duas etapas. Primeiro, os microcanais fabricados são superfície modificada (enxertada) da mesma maneira como para as colunas SPE no dispositivo de plástico.

Após o processo de photografting, um polímero microporoso monólito é formada dentro da microcanais que está impregnada com nanotubos de carbono de paredes múltiplas. O monólito poroso é preparado in situ da seguinte forma:

1. Multi-walled nanotubos são ressuspenso em ciclohexanol em uma concentração de 2.27M. Esta é a ressuspensão ultrasonicated durante 30 minutos a amplitude de 50% e 50% ciclo de trabalho com uma célula sonifier disruptor (Sonifier S-250D, fabricado pela Branson Ultrasonic, Danbury, CT). A sonicação desde uma suspensão eficaz e estável 0.5M de nanotubos de carbono. Os nanotubos de carbono foram comprados da Nanolabs (Brighton, MA).
2. Os canais de superfície modificada são preenchidos com uma mistura semelhante precursor monólito exceto que agora a solução de ciclohexanol + nanotubos de carbono é utilizado. A mistura monólito consiste em Buma (15% em peso), EDMA (10% em peso), 1-dodecanol (52,5% em peso), e + ciclohexanol CNTs (22,5% em peso). Para esta solução a DMPAP fotoiniciador é adicionado (1,13% em peso com respeito ao monômeros). Os monômeros, solventes e porogenic DMPAPA forem comprados de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
3. O chip é irradiada com UV no reticulador UV a 120 mJ / cm ² para 0,9 min para iniciar a polimerização. O dispositivo é girado 180 graus no crossliker e irradiado para uma outra min 0,9 a 120 mJ / cm ^2. O monômero em excesso é removido os canais de lavagem com 50 mL de metanol por meio de aspiração a vácuo.
4. As conexões fluídicas ^(TM NanoPorts conexões, Upchurch Científico, Oak Harbor, WA) são fixadas sobre a introdução e poços de captação dos canais microfluídicos.

Preparação de amostras de bactérias para uso com CNT lise monólito

A preparação da amostra para uma amostra bacteriana envolve tomar uma medida de densidade óptica a 600nm para garantir que a amostra não é extremamente concentrado, de modo a evitar o entupimento do canal.

1. Tome uma leitura de OD 600nm com as bactérias na mídia, isso é feito com um biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Diluir a amostra até que as leituras OD estão dentro do intervalo 0,18-0,25 A.
2. Centrifugar a amostra a 6.500 rpm por 5 minutos e decantar o sobrenadante.

Lise

1. Ressuspender as bactérias em GuSCN * + 0,01% SDS + 4% Proteinase K (0.8mg/ml). Brevemente Vortex (1ml de bactérias em meios de comunicação deve ser ressuspenso em 1ml GuSCN). Proteinase K foi adicionada à solução para ajudar com desnaturação de proteínas que estão ligadas ao DNA bacteriano e inibir DNAases e RNAases. Um benefício adicional do K proteinase é que ele também ajuda com a quebra das proteínas da parede celular que é desejável uma vez que tanto bactérias gram-positivas e gram-negativas paredes celulares de bactérias contêm grandes quantidades de proteína (embora bactérias gram-negativas geralmente têm mais proteínas ). O buffer caotrópicos adicionalmente auxilia o K proteinase com desnaturação de proteínas, enquanto o detergente rompe a parede celular. Proteinase K e tiocianato guanidinium (GuSCN) foram adquiridos da Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (dodecil sulfato de sódio) foi comprado de Pierce (Rockford, IL).
2. Imediatamente carga da amostra em uma seringa conectada ao tubo de PEEK. Aspirar a seringa de modo que nenhum ar é no sistema. Conecte o tubo à nanoport e canal.

A bomba de seringa KDS100 (fabricado pela KD Scientific, Holliston, MA) foi utilizado para os experimentos ea vazão utilizada é de 450 mL / hora para todas as etapas. Fluxo do canal lise da amostra em 450ul/hr.

1. Coletar a amostra e proceder à extracção de DNA através de SPE (ver protocolo de extração de DNA). Observação: Este exemplo bacteriana não precisará seguir passo de carga 2, desde a suspensão é GuSCN *.

Extração de DNA Protocolo

O procedimento de extração consiste em 3 passos:

1. Carga.
2. Washington
3. Eluir.

KDS100 bomba de seringa (fabricado pela KD Scientific, Holliston, MA) foi utilizado para os experimentos ea vazão utilizada foi de 300 mL / hora para todas as etapas.

Carga

1. Condição de canal com tampão caotrópicos (GuSCN ^*, tiocianato guanidinium) por 1-2 min antes de iniciar o experimento.
2. Misturar a amostra com tampão caotrópicos na relação de 1:1.
3. Fluxo de mistura da amostra através do canal durante 3 min.

Lavar

1. Lavar o canal com etanol 70% por 2 min.
2. Lavar o canal com etanol 100% por 2 min.

Eluir

1. Eluir o DNA extraído em água millipore por 3 min. Colete 15 mL de purificado, pronto PCR-DNA.

* O GuSCN do kit Qiagen (buffer RLT) foi utilizado.