A lesão por constrição crônica do nervo infraorbital distal em camundongos induz mudanças no comportamento espontâneo (aumento da atividade de limpeza facial) e no comportamento nocifensivo em resposta à estimulação tátil (hiperresponsividade à estimulação capilar de von Frey) que são sinais de dor contínua e alodinia e serve como modelo para a dor neuropática do trigêmeo.
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Artigo de método
Lesão por Constrição Crônica do Nervo Infraorbital Distal (DIoN-CCI) em Camundongos para Estudo da Dor Neuropática do Trigêmeo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os modelos animais continuam sendo ferramentas necessárias para estudar a dor neuropática. Este manuscrito descreve o modelo de lesão por constrição crônica do nervo infraorbital distal (DIoN-CCI) para estudar a dor neuropática do trigêmeo em camundongos. Isso inclui os procedimentos cirúrgicos para realizar a lesão de constrição crônica e os testes comportamentais pós-operatórios para avaliar as mudanças no comportamento espontâneo e evocado que são sinais de dor contínua e alodinia mecânica. Os métodos e leituras comportamentais são semelhantes ao modelo de lesão por constrição crônica do nervo infraorbital (IoN-CCI) em ratos. No entanto, mudanças importantes são necessárias para a adaptação do modelo IoN-CCI a camundongos. Primeiro, a abordagem intraorbital é substituída por uma abordagem mais rostral com uma incisão entre o olho e a almofada do bigode. O IoN é, portanto, ligado distalmente fora da cavidade orbital. Em segundo lugar, devido à maior atividade locomotora em camundongos, permitir que os ratos se movam livremente em pequenas gaiolas é substituído pela colocação de camundongos em dispositivos de retenção projetados e construídos sob medida. Após a ligadura DIoN, os camundongos exibem mudanças no comportamento espontâneo e em resposta à estimulação capilar de von Frey que são semelhantes às dos ratos IoN-CCI, ou seja, aumento da limpeza facial direcionada e hiperresponsividade à estimulação capilar de von Frey do território IoN.
Introdução
A dor neuropática surge de danos ao sistema nervoso somatossensorial, levando à transmissão anormal de sinais sensoriais ao cérebro. O dano do nervo somatossensorial nem sempre leva à dor neuropática, mas a prevalência aumenta com a gravidade da neuropatia clínica 1,2. Pacientes com dor neuropática apresentam sintomas específicos, como sensações espontâneas (queimação, formigamentos, sensações elétricas) e dor anormalmente intensa ou prolongada a estímulos inócuos ou nocivos que tendem a se tornar crônicos e resistentes ao tratamento com analgésicos convencionais3. Um progresso significativo no campo da pesquisa da dor neuropática decorre da descoberta de que ligaduras frouxamente constritivas ao redor do nervo ciático em ratos levam a comportamentos semelhantes às condições de dor neuropática humana4. Os animais exibem limiares reduzidos ao calor, frio e estimulação mecânica e exibem comportamentos nocifensivos. Apesar das diferenças biológicas inerentes ao processamento da dor entre humanos e roedores, os modelos animais são uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos subjacentes no desenvolvimento da dor neuropática e testar estratégias de tratamento recém-propostas.
Os paradigmas de teste de dor baseados em reflexos sensoriais têm sido amplamente utilizados em modelos de dor neuropática, mas medir a dor contínua ou outros distúrbios frequentemente acompanhados (distúrbio do sono, depressão, ansiedade) não recebeu atenção suficiente, considerando que esses são sintomas clínicos comuns que afetam a qualidade de vida 5,6,7,8 . O comportamento de higiene facial em ratos foi documentado como uma medida de dor neuropática espontânea após lesão por constrição crônica (CCI) do nervo infraorbital (IoN)9,10. Além disso, os ratos também desenvolvem hiperresponsividade à estimulação tátil leve do território IoN, o que é indicativo de alodinia mecânica.
Em comparação com os camundongos, devido ao seu tamanho maior, os ratos são mais adequados para lesões cirúrgicas. No entanto, os camundongos oferecem eficiência de custo e espaço e requerem quantidades menores de medicamentos. Além disso, o advento da tecnologia transgênica impulsionou ainda mais o uso de camundongos11,12. Portanto, o objetivo geral deste procedimento é realizar uma lesão cirúrgica do nervo infraorbital em camundongos, semelhante à de ratos, que induza alterações no comportamento espontâneo e evocado para o estudo da dor neuropática do trigêmeo.
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Protocolo
Os animais são tratados e cuidados de acordo com as diretrizes para pesquisa da dor em animais conscientes da Associação Internacional para o Estudo da DOR e de acordo com os regulamentos flamengos e europeus para pesquisa animal e as diretrizes ARRIVE. O protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética institucional.
1. Animais
- Use camundongos C57BL / 6J machos e fêmeas (Janvier, 10 semanas de idade na chegada).
- Alojar camundongos machos e fêmeas separadamente em gaiolas de camundongos padrão de fundo sólido em uma sala de colônia com umidade de 40% a 60% e temperatura ambiente (RT) de 21 ± 1 °C.
- Forneça água e comida ad libitum.
- Mantenha os ratos em um ciclo normal de 12:12 h escuro/claro (luzes acesas às 08:00).
2. Cirurgia
- Por rato, prepare um pedaço de ligadura intestinal crômica (6-0) com aproximadamente 6 cm de comprimento e coloque-o em solução salina estéril para evitar que seque e fique rígido e quebradiço.
- Anestesiar o camundongo com cetamina/xilazina (75/15 mg/kg, intraperitoneal, volume de injeção de 10 mL/kg). Verifique a profundidade da anestesia beliscando a pele entre os dedos. Certifique-se de que o mouse não flexione a perna. Se necessário, espere até que o animal esteja totalmente anestesiado e/ou administre cetamina/xilazina adicional.
NOTA: Analgésicos suplementares não devem ser administrados para evitar efeitos analgésicos preventivos que possam interferir no desenvolvimento da dor neuropática do trigêmeo. - Raspe suavemente os pelos bucais entre a almofada do bigode e o olho para fazer uma incisão de aproximadamente 4 mm apenas rostral ao forame infraorbital. Tome cuidado para não danificar os bigodes, pois isso pode afetar os testes comportamentais.
- Fixe a cabeça do mouse em um quadro estereotáxico ou fixe a cabeça de outra forma. Coloque o mouse em uma almofada aquecida ou tome cuidado para manter a temperatura corporal de outra forma.
- Aplique pomada em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Esfregue a área da cabeça raspada com álcool e depois com betadine. Coloque uma cortina cirúrgica expondo a área da cabeça raspada.
- Use um microscópio para as etapas 2.7 a 2.14.
- Faça uma incisão na pele de 4 mm perpendicular à linha média aproximadamente a meio caminho entre a borda da almofada do bigode e o olho, apenas rostral ao forame infraorbital e centrada em torno da linha entre o centro do olho e o centro da almofada do bigode.
- Exponha a IoN separando sem rodeios o tecido conjuntivo superficial. Tome cuidado para minimizar os danos à musculatura e evitar as fibras nervosas motoras. Certifique-se de que o tronco do IoN (1-1,5 mm de diâmetro) esteja acessível a aproximadamente 3 mm de profundidade entre onde sai do crânio e onde se ramifica para a almofada do bigode (Figura 1).
- Usando um movimento rotativo, deslize a cabeça de um auxiliar de ligadura em forma de gancho sob o IoN, tomando cuidado para não danificar o nervo.
- Coloque a ligadura de tripa crômica através do orifício na ponta do auxiliar de ligadura e retraia o auxiliar de ligadura de modo que a ligadura permaneça sob o IoN e ambas as extremidades da ligadura fiquem mais ou menos equidistantes do IoN.
- Dê um "nó corrediço" nas duas extremidades da ligadura e deslize o nó contra o IoN. Certifique-se de que o nó deslizante permita uma ação suave para que o grau de constrição possa ser controlado com precisão. Deslize o nó ainda mais e contraia o IoN. Reduza o diâmetro do nervo em apenas uma quantidade perceptível4. Coloque um nó normal em cima do nó de fenda para evitar que escorregue.
- Corte as extremidades da ligadura deixando aproximadamente 1,5 mm de extremidades livres para evitar que o nó se desfaça.
- Realize a cirurgia simulada seguindo as etapas 2.2-2.8.
- Feche a incisão da pele com suturas sintéticas absorvíveis (6-0) e permita que o animal se recupere com uma almofada aquecida ou sob uma lâmpada de aquecimento infravermelho.
3. Teste comportamental
- Aclimate o mouse às condições de alojamento por pelo menos 8 dias antes do teste pré-operatório.
- Antes do teste pré-operatório, habitue o mouse ao procedimento de teste pelo menos uma vez ao dia durante 3 dias.
- Realize testes em condições normais de iluminação. Se necessário, forneça ruído de fundo para minimizar os distúrbios causados por ruídos externos.
- Observação do comportamento de higiene facial
- Transporte um único mouse da caixa para a sala de teste em uma gaiola de plástico coberta sem nenhum material de cama. Evite estimulação externa durante o transporte dos animais.
- Coloque o mouse em uma gaiola de plástico coberta e transparente sem roupa de cama (C x L x A: 12 cm x 12 cm x 17 cm) na frente de uma câmera de vídeo. Coloque um espelho para ver o rosto do animal quando ele estiver de costas para a câmera.
- Registre o comportamento do mouse por 10 min. Durante a gravação, certifique-se de que o experimentador não esteja presente na sala.
- Depois de registrar o próximo animal, limpe a gaiola de observação.
- Peça a um observador cego para as condições experimentais do camundongo que analise o comportamento registrado.
- Observe cada episódio de aliciamento facial enquanto analisa a gravação de 10 minutos. A limpeza facial são padrões de movimento em que o animal coloca as patas dianteiras em contato com as áreas faciais.
- Faça uma distinção entre cuidados faciais isolados e comportamentos de cuidados faciais durante o tratamento corporal9. Se uma sequência não for precedida ou seguida por cuidados com o corpo, o episódio será rotulado como cuidados faciais isolados. A limpeza corporal é definida como padrões de movimento que colocam as patas, a língua ou os incisivos em contato com uma área do corpo diferente do rosto ou das patas dianteiras. Se a preparação do corpo estiver presente antes ou depois de uma sequência de preparação do rosto, o episódio será rotulado como cuidados faciais durante a preparação do corpo.
- Determine o número de episódios de cuidados faciais aplicando um critério de corte de 4 s. Um período de tempo entre as ações de limpeza de menos de 4 s é definido como uma pausa em um único episódio. Um período de tempo superior a 4 s é definido como uma interrupção total das ações de limpeza entre dois episódios.
- Teste de estimulação mecânica
- Transportar ratos em grupos de até 6 animais da caixa para a sala de teste em uma gaiola coberta com roupa de cama. Novamente, tome cuidado para evitar estímulos externos.
- Coloque os ratos um de cada vez em uma mesa.
- Coloque a cauda do mouse em um grampo de silicone macio e prenda o grampo magneticamente a uma placa de metal sobre a mesa. O material de silicone evita que a cauda escorregue da braçadeira, minimizando a pressão na cauda.
- Coloque um suporte de plástico de três paredes (65 mm x 25 mm x 23 mm) sobre o animal de forma que apenas a cabeça do rato se projete do recipiente. O tamanho do suporte permite movimentos da cabeça e da pata dianteira, mas evita que o animal se vire dentro dele. Por fim, coloque um peso em cima do suporte para mantê-lo no lugar (Figura 2).
- Use uma série graduada de quatro cabelos de von Frey. A força necessária para dobrar os cabelos é de 0,02 g, 0,16 g, 0,4 g e 1,0 g.
- Habituar os ratos ao limitador e alcançar movimentos por 10 min. A cada 30 s, faça um movimento de alcance por animal.
- Quando o animal estiver relaxado, aplique lentamente o cabelo de von Frey mais claro dentro do território IoN perto do centro das vibrissas até que o cabelo de von Frey se dobre. Certifique-se de que a estimulação não leva mais de 1 s.
- Pontue a resposta do animal à estimulação para se encaixar em uma das seguintes categorias de resposta.
- Dê uma pontuação de 0 quando não houver resposta.
- Dê uma pontuação de 1 para detecção, ou seja, o mouse vira a cabeça em direção ao objeto estimulante e depois explora o objeto de estímulo.
- Dê uma pontuação de 2 para a reação de retirada, ou seja, o mouse vira a cabeça suavemente ou a puxa rapidamente para trás quando a estimulação é aplicada; Às vezes, ocorre um único lenço facial ipsilateral à área estimulada.
- Dê uma pontuação de 3 para atacar, ou seja, o mouse ataca o objeto de estímulo, fazendo movimentos de mordida e/ou agarramento.
- Dê uma pontuação de 4 para a limpeza assimétrica do rosto, ou seja, o mouse exibe uma série ininterrupta de pelo menos três movimentos de lavagem do rosto direcionados para a área facial estimulada.
- Para cada camundongo, aplique os pêlos de von Frey em ordem crescente de intensidade e estimule aleatoriamente os lados ipsilateral e contralateral. Aplique cada intensidade de estímulo uma vez de cada lado.
- Calcule a pontuação média das respostas aos quatro pêlos de von Frey dentro de cada animal. Calcule pontuações separadas para os lados ipsilateral e contralateral.
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Resultados
Os camundongos DIoN-CCI mostram um forte aumento pós-operatório no tempo gasto em cuidados faciais isolados e no número de episódios isolados de cuidados faciais (Figura 3). O aumento mais forte ocorre durante a primeira semana de pós-operatório e depois se torna menor durante as semanas seguintes, mas aumenta significativamente por pelo menos 6 semanas. A higiene facial durante a higiene corporal não é afetada.
Os camundongos DIoN-CCI são quase completamente inse...
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Discussão
Em ratos, foi argumentado anteriormente que uma abordagem intra-orbital para a IoN é preferível, considerando a importância da musculatura fina intacta controlando padrões complexos de batida na discriminação vibristátil e a distância relativa da incisão da linha média ao território do nervo cutâneoinfraorbital 10. Outros argumentaram que uma abordagem distal por meio de uma incisão na pele pilosa caudal ao coxim vibrissal tem uma série de benefícios
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores não têm agradecimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Categute crômico (6-0) | Dynek | CG602D | ligaduras |
| Aplicador de algodão | Farmácia | ||
| Câmera de vídeo digital | Sony | HDR-CX330E | |
| Dumont # 5 fórceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont fórceps - Pontas micro-embotadas (# 5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Duratears | Alcon | 0037-820 | pomada oftálmica |
| Auxiliar de ligadura em gancho | Fine Science Tools | 18062-12 | |
| Ketalar | Pfizer | cetamina (50 mg/mL) | |
| Microscópio de operação | Kaps | SOM 62 | |
| Cotonete de precisão | Qosina | 10225 | |
| Aparador de precisão | Philips | HP6392/00 | |
| Rompun | Bayer | xilazina (2%) | |
| Tesouras - pontas rombas | Ferramentas de Belas Ciências | 14574-09 | |
| Kit de estesiômetro Semmes-Weinstein Von Frey | Stoelting | 58011 | |
| Vicryl Rapide | Ethicon | MPVR489H suturas |
Referências
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Reimpressões e permissões
