Artigo de método

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

DOI:

10.3791/66423

⸱

29 de dezembro de 2023

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

Neste artigo

Resumo

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As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Resumo

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As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.

Introdução

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As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo1. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A proteína de fusão DB-X se liga a uma sequência de reconhecimento do domínio DB; portanto, quando as proteínas X e Y interagem, a proteína de fusão AD-Y se aproxima da sequência de reconhecimento. Consequentemente, a transcrição do gene repórter a jusante da sequência de reconhecimento é ativada. Portanto, a presença ou ausência de atividade do gene repórter pode ser usada para determinar a presença ou ausência da interação proteína-proteína1.

Uma vez identificado um parceiro de interação específico da proteína de interesse, análises adicionais devem ser realizadas para elucidar a função biológica da interação. Para isso, se os mutantes das proteínas que prejudicam ou removem a interação proteína-proteína específica puderem ser isolados, eles servirão como ferramentas poderosas. O sistema Y2H pode ser usado diretamente para isolar esses mutantes rastreando clones de 'interação negativa', começando com o clone de 'interação positiva' do tipo selvagem. Para acelerar esse processo, foram desenvolvidos sistemas Y2H 'reversos' (rY2H) 2,3. Nos sistemas rY2H, as cepas de levedura hospedeiras abrigam genes marcadores contra-selecionáveis como genes repórteres, o que significa que as células de levedura crescem apenas quando as proteínas AD-Y e DB-X não interagem.

Embora os sistemas Y2H e rY2H permitam o isolamento de mutantes negativos para interação, o processo de isolamento dos mutantes é trabalhoso porque nem todos os candidatos obtidos por triagem carregam o tipo desejado de mutações (geralmente mutações missense). O problema mais sério é que uma fração significativa de candidatos abriga frameshift ou mutações sem sentido, e é necessário realizar western blotting para excluir clones indesejados. Para superar esse problema, novos vetores de plasmídeo foram desenvolvidos4. Nesses vetores, KanMX, um marcador de resistência a medicamentos, é posicionado fora do quadro a jusante do domínio DB ou AD. O gene marcador torna-se enquadrado no domínio DB ou AD somente quando o gene de interesse é inserido. Quando uma (s) mutação (ões) aleatória (s) é introduzida (s) no gene de interesse, mutantes indesejáveis, como aqueles com frameshift ou mutações sem sentido, podem ser facilmente eliminados realizando a seleção de resistência a medicamentos, e os candidatos portadores de mutações missense desejáveis podem ser facilmente identificados com a tela Y2H4. Este artigo apresenta um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada de uma proteína de interesse usando essa estratégia.

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Protocolo

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1. Construção da biblioteca mutante

  1. Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR4.
    NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de erro mais alta, como a Taq polimerase, que não possui atividade de revisão. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for longo, uma polimerase de maior fidelidade é necessária para reduzir o número de mutações. As mutações ocorrem a cada poucas centenas de pares de bases após 30 ciclos de amplificação com Taq polimerase4 regular. Nos resultados representativos, uma Taq polimerase diferente foi usada (ver Tabela de Materiais), que tem maior fidelidade do que a Taq polimerase regular, e a taxa de mutação foi de um em 600 pares de bases. Um exemplo das misturas de PCR, os detalhes do primer e as condições de reação são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
  2. Quando a PCR estiver concluída, combine todas as alíquotas da reação, confirme se os fragmentos de DNA de interesse foram amplificados usando eletroforese em gel de agarose, etc., e purifique o DNA5.
  3. Montar o fragmento de ADN gerado no passo 1.2 com o vector Y2H adequado, utilizando uma estratégia de clonagem «sem costuras» (figura 1).
    NOTA: O sistema de clonagem contínuo, como o conjunto Gibson6, minimiza a contaminação da biblioteca mutante construída por vetores vazios gerados por autoligação . Uma lista de vetores Y2H é fornecida na Tabela 1. Eles podem ser preparados por digestão BamHI antes da montagem. Todos os plasmídeos estão disponíveis no Projeto Nacional de BioRecursos - levedura (ver Tabela de Materiais).
  4. Introduza a mistura de reação gerada na etapa 1.3 em células competentes para Escherichia coli preparadas de acordo com um protocolo de transformação de E. coli altamente eficiente (por exemplo, Inoue et al.7). Espalhe todas as células competentes em várias placas LB (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl e 2% de ágar) contendo antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais). Neste ponto, espalhe uma pequena quantidade (~ 1/100 da reação total) na mesma placa de seleção para calcular o título da biblioteca. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
  5. Uma vez que um grande número de colônias de E. coli tenha aparecido, raspe todas as células da superfície da placa usando um laço de plástico descartável. Recupere o DNA do plasmídeo dessas células usando métodos populares, como a lise alcalina8. Ao mesmo tempo, conte o número de colônias que aparecem depois de espalhar pequenas alíquotas da mistura de transformação na placa. Usando esse número, estime o número total de clones independentes na biblioteca.
    NOTA: Neste ponto, pegue algumas colônias independentes (4-6) que aparecem na placa na qual as pequenas alíquotas da reação de transformação foram espalhadas, cultive-as separadamente e isole os plasmídeos delas para confirmar que praticamente todos os clones carregam os fragmentos de DNA desejados5. Muitos kits comerciais estão disponíveis para isolar plasmídeos de E. coli. O número de colônias que aparecem na placa após espalhar pequenas alíquotas pode ser contado manualmente.
  6. Meça a concentração do pool de DNA da biblioteca. Normalmente, algumas centenas de nanogramas de DNA de biblioteca são suficientes para obter vários milhares de transformantes na próxima etapa.
    NOTA: Recomenda-se medir a concentração de DNA usando um corante fluorescente que se liga ao DNA porque a medição de A260 é frequentemente imprecisa.

2. Transformação de levedura com a biblioteca mutante e réplica de revestimento

  1. Introduza a biblioteca mutante na cepa de levedura hospedeira (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) para o ensaio Y2H usando cerca de 100 ng de DNA. Pré-transforme as células hospedeiras com o plasmídeo 'isca'.
    1. Após o procedimento de transformação, suspenda as células de levedura em água estéril e espalhe alíquotas de diferentes quantidades em placas apropriadas (geralmente meio SC sem leucina e triptofano: SC-LW [0,67% de base de nitrogênio de levedura, 2% de glicose, 1,546 g / L de mistura dupla de eliminação SC -Leu -Trp e 2% de ágar, consulte a Tabela de Materiais]). Incubar estas placas durante a noite a 30 °C.
      NOTA: O protocolo padrão, como o método acetato de lítio-PEG11 com ~ 5 × 106 células de crescimento logaritmicamente, é suficiente para a transformação da levedura. Outro método com alta eficiência de transformação, como a eletroporação, também pode ser usado.
  2. No dia seguinte, quando aparecerem pequenas colônias, selecione as placas com um número apropriado de células (500-2000) e faça réplicas delas da seguinte maneira.
  3. Coloque duas folhas de papel de filtro em um bloco de réplica para fazer várias réplicas (o meio é SC-LW e SC-LW contendo canamicina) (consulte a Tabela de Materiais). Incubar a 30 °C durante 1-2 dias.
    NOTA: A concentração de canamicina (G418) é de 600 μg/mL. Não use veludo para réplicas de chapeamento, pois a resolução das colônias será perdida.
  4. Depois que as colônias crescerem, compare as placas e escolha os candidatos. Execute um ensaio de cor Y2H (consulte a etapa 3) se lacZ for usado como relator.
    NOTA: Para o repórter Y2H, lacZ geralmente é melhor em detectar uma interação fraca do que HIS3.

3. Ensaio de cor Y2H

  1. Coloque uma folha de papel de filtro cortada antecipadamente no tamanho apropriado na placa de réplica preparada usando a etapa 2. Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre o papel de filtro e a placa.
    NOTA: Use papel de filtro nº 4A ou papel de filtro de grau 50 (consulte a Tabela de Materiais). Qualquer SC-LW ou SC-LW contendo placas de canamicina, que são feitas por réplica de chapeamento, pode ser usada para o ensaio de cor.
  2. Quando o papel de filtro na placa estiver completamente umedecido (quando a cor do papel de filtro mudar completamente), coloque várias folhas de papel toalha por cima e coloque-o em contato com o papel de filtro para remover o excesso de umidade. Remova a toalha de papel quando ela absorver a água e mudar de cor. Repita esse processo duas ou três vezes.
  3. Pegue as bordas do papel de filtro com uma pinça, retire-o da placa rapidamente, mergulhe-o em nitrogênio líquido e congele-o. Se o nitrogênio líquido não estiver disponível, coloque o papel de filtro em uma bandeja de plástico com a colônia voltada para cima e coloque-o imediatamente em um freezer (-20 °C a -80 °C) para congelar completamente.
  4. Retire o papel de filtro congelado e coloque-o, com a colônia voltada para cima, sobre uma toalha de papel seca para descongelar. Imediatamente após o descongelamento, coloque o papel de filtro, com a colônia voltada para cima, em outro papel de filtro que tenha sido colocado em uma bandeja plástica ou recipiente lacrado e embebido em tampão Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl e 1 mM MgSO4, pH 7,0) contendo X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo) e 2-mercaptoetanol9 (ver Tabela de Materiais). Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre os papéis de filtro superior e inferior.
  5. Cubra a bandeja plástica que contém o papel de filtro e coloque-a em um recipiente hermético ou saco plástico. Feche o recipiente hermético ou saco plástico e incube-o a 37 °C até que apareça uma cor azul.
  6. Quando aparecer uma cor azul, coloque o papel de filtro com a colônia voltada para cima sobre cerca de 500 μL de solução de parada (1 M Na2CO3) colocada em uma bandeja plástica limpa. A solução de parada é absorvida rapidamente; Portanto, remova o filtro imediatamente, coloque-o sobre uma toalha de papel limpa com a colônia voltada para cima e deixe secar.
  7. Depois que a toalha de papel for substituída e o filtro estiver seco o suficiente, use um scanner ou outro dispositivo para capturar os dados.

4. Recuperação e confirmação de clones candidatos

  1. Selecione clones candidatos brancos e KanR da placa original da réplica (ou da placa replicada não usada para o ensaio de cores). Os exemplos são mostrados na Figura 1C. Confirmar se os clones candidatos são brancos e KanR , colocando-os novamente como uma pequena mancha em meio SC-LW contendo canamicina e incubando-os a 30 °C durante 1-2 dias. Faça pelo menos duas séries ou faça réplicas no dia seguinte.
    NOTA: As colônias brancas devem ser selecionadas porque as colônias azuis claras podem reter a interação.
  2. Uma vez que os clones candidatos tenham crescido bem, repita o ensaio de cor com pelo menos uma placa gerada na etapa 4.1, conforme descrito na etapa 3, e confirme se eles permanecem brancos e não ficam azuis (Figura 2A).
    NOTA: Ao listrar novamente os candidatos, não transfira grandes quantidades de células. Muitas células tornam impossível distinguir os clones KanR e KanS .
  3. Pegue os clones que ainda são brancos e KanR gerados na etapa 4.2 a partir dos restos da placa e cultive-os independentemente em 1 mL de meio de seleção (SC-L ou SC-W, dependendo de qual vetor é usado para a construção da biblioteca) durante a noite a 30 ° C.
  4. Transfira a cultura para um microtubo e colete as células por centrifugação (~ 15.000 × g, por 10-30 segundos à temperatura ambiente). Isole o DNA completo do pellet celular da seguinte forma.
  5. Suspenda o pellet celular em 400 μL de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) contendo 1 μL de 2-mercaptoetanol e 20 mg / mL de Zymolyase 100T (ver Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 30 min para digerir as paredes celulares. Neste momento, misture delicadamente invertendo o tubo a cada 5-10 min.
  6. Quando a suspensão celular se tornar opaca ou translúcida, adicione um volume igual de uma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem por vórtice em velocidade moderada por 10-20 s.
  7. Centrifugue os microtubos em uma microcentrífuga por 5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) e recupere a fase aquosa contendo DNA em um novo microtubo. Adicione 0,8 volume de isopropanol e misture bem invertendo o tubo.
  8. Deixe o tubo em temperatura ambiente por 2-3 min e depois centrifugue em uma microcentrífuga por 4-5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) para precipitar o DNA.
  9. Remover o sobrenadante e lavar o precipitado com cerca de 500 μL de etanol a 70%. Remover completamente o etanol e secar brevemente o precipitado.
  10. Adicione 20 μL de tampão TE (10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) ao precipitado, misture brevemente e deixe o tubo durante a noite à temperatura ambiente para dissolver o precipitado.
    NOTA: Se os usuários estiverem com pressa, mantenha os tubos a 37-50 °C. O precipitado de DNA se dissolverá em algumas horas.
  11. Assim que o pellet estiver completamente dissolvido, transforme E. coli com uma pequena quantidade dessa solução de DNA.
    NOTA: Cerca de 0,5 μL de solução de DNA é suficiente se E . coli com alta eficiência de transformação for usada.
  12. Quando as colônias de E. coli aparecerem, escolha várias colônias independentes, cultive-as e recupere plasmídeos por métodos padrão, como lise alcalina.
  13. Introduza o DNA do plasmídeo obtido na etapa 4.12 nas células hospedeiras Y2H que abrigam o plasmídeo da isca. Quando os transformantes aparecerem, verifique-os pelo ensaio de cores (eles devem aparecer brancos) e western blotting4 (eles devem expressar uma proteína do tamanho desejado).
    NOTA: O método pós-alcalino12 é uma maneira fácil e rápida de preparar um extrato de células inteiras a partir de levedura.
  14. Se os dois critérios acima forem atendidos, determine o local de mutação dos clones por sequenciamento de nucleotídeos4.

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Resultados

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Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o método descrito aq...

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Discussão

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Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H 2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significativa de t...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Agradecimentos

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Y. Tanaka realizou o aprimoramento técnico do Y2H. Este trabalho é apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 e pelo Institute for Fermentation, Osaka.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA (8,0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
Solução SDS de 10%Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoetanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanolKishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
ÁgarFormediumAGR60
Ampicilina de SódioFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT   Médico e Laboratórios Biológicos Co. Ltd.M180-7
DNA de testículos de salmãoMerck KGaA.D1626
EtanolMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Papel de filtro para elevador de colônia (Grau 50)Whatman, Cytiva1450-090
Papel de filtro para elevador de colônia (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
Papel de filtro para replica (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
Sulfato G-418Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Ácido clorídricoKishida Chemical Co., Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
acetato de lítio di-hidratadoNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4• 7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4• 12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4• 2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Toalha de papelAS ONE Corp.7-6200-02
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
DNAs de plasmídeoo Projeto Nacional de BioRecursos - levedura (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Kit de isolamento de plasmídeoNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Polietilenoglicol # 4.000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC mistura de dupla saída -Leu -TrpFormediumDSCK172
Kit de clonagem sem costura (montagem In-Fusion)Takara Bio Inc.#639648
Leite em pó desnatadoFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Sulfato de estreptomicinaFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polimerase (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (hidroximetil) aminometanoFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TriptonaThermoFisher scientific Inc.
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Extrato de leveduraThermoFisher scientific Inc.212750
Base de Nitrogênio de Levedura (YNB)para Zymolyasede CYN0210
100TNacalai Tesque Inc.Rolamento 07665-55
0141109000011150211705Médio

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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