Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo¹. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A proteína de fusão DB-X se liga a uma sequência de reconhecimento do domínio DB; portanto, quando as proteínas X e Y interagem, a proteína de fusão AD-Y se aproxima da sequência de reconhecimento. Consequentemente, a transcrição do gene repórter a jusante da sequência de reconhecimento é ativada. Portanto, a presença ou ausência de atividade do gene repórter pode ser usada para determinar a presença ou ausência da interação proteína-proteína¹.

Uma vez identificado um parceiro de interação específico da proteína de interesse, análises adicionais devem ser realizadas para elucidar a função biológica da interação. Para isso, se os mutantes das proteínas que prejudicam ou removem a interação proteína-proteína específica puderem ser isolados, eles servirão como ferramentas poderosas. O sistema Y2H pode ser usado diretamente para isolar esses mutantes rastreando clones de 'interação negativa', começando com o clone de 'interação positiva' do tipo selvagem. Para acelerar esse processo, foram desenvolvidos sistemas Y2H 'reversos' (rY2H) ^2,3. Nos sistemas rY2H, as cepas de levedura hospedeiras abrigam genes marcadores contra-selecionáveis como genes repórteres, o que significa que as células de levedura crescem apenas quando as proteínas AD-Y e DB-X não interagem.

Embora os sistemas Y2H e rY2H permitam o isolamento de mutantes negativos para interação, o processo de isolamento dos mutantes é trabalhoso porque nem todos os candidatos obtidos por triagem carregam o tipo desejado de mutações (geralmente mutações missense). O problema mais sério é que uma fração significativa de candidatos abriga frameshift ou mutações sem sentido, e é necessário realizar western blotting para excluir clones indesejados. Para superar esse problema, novos vetores de plasmídeo foram desenvolvidos⁴. Nesses vetores, KanMX, um marcador de resistência a medicamentos, é posicionado fora do quadro a jusante do domínio DB ou AD. O gene marcador torna-se enquadrado no domínio DB ou AD somente quando o gene de interesse é inserido. Quando uma (s) mutação (ões) aleatória (s) é introduzida (s) no gene de interesse, mutantes indesejáveis, como aqueles com frameshift ou mutações sem sentido, podem ser facilmente eliminados realizando a seleção de resistência a medicamentos, e os candidatos portadores de mutações missense desejáveis podem ser facilmente identificados com a tela Y2H⁴. Este artigo apresenta um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada de uma proteína de interesse usando essa estratégia.

1. Construção da biblioteca mutante

1. Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR⁴.
   NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de erro mais alta, como a Taq polimerase, que não possui atividade de revisão. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for longo, uma polimerase de maior fidelidade é necessária para reduzir o número de mutações. As mutações ocorrem a cada poucas centenas de pares de bases após 30 ciclos de amplificação com Taq polimerase⁴ regular. Nos resultados representativos, uma Taq polimerase diferente foi usada (ver Tabela de Materiais), que tem maior fidelidade do que a Taq polimerase regular, e a taxa de mutação foi de um em 600 pares de bases. Um exemplo das misturas de PCR, os detalhes do primer e as condições de reação são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
2. Quando a PCR estiver concluída, combine todas as alíquotas da reação, confirme se os fragmentos de DNA de interesse foram amplificados usando eletroforese em gel de agarose, etc., e purifique o DNA⁵.
3. Montar o fragmento de ADN gerado no passo 1.2 com o vector Y2H adequado, utilizando uma estratégia de clonagem «sem costuras» (figura 1).
   NOTA: O sistema de clonagem contínuo, como o conjunto Gibson⁶, minimiza a contaminação da biblioteca mutante construída por vetores vazios gerados por autoligação . Uma lista de vetores Y2H é fornecida na Tabela 1. Eles podem ser preparados por digestão BamHI antes da montagem. Todos os plasmídeos estão disponíveis no Projeto Nacional de BioRecursos - levedura (ver Tabela de Materiais).
4. Introduza a mistura de reação gerada na etapa 1.3 em células competentes para Escherichia coli preparadas de acordo com um protocolo de transformação de E. coli altamente eficiente (por exemplo, Inoue et al.7). Espalhe todas as células competentes em várias placas LB (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl e 2% de ágar) contendo antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais). Neste ponto, espalhe uma pequena quantidade (~ 1/100 da reação total) na mesma placa de seleção para calcular o título da biblioteca. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
5. Uma vez que um grande número de colônias de E. coli tenha aparecido, raspe todas as células da superfície da placa usando um laço de plástico descartável. Recupere o DNA do plasmídeo dessas células usando métodos populares, como a lise alcalina⁸. Ao mesmo tempo, conte o número de colônias que aparecem depois de espalhar pequenas alíquotas da mistura de transformação na placa. Usando esse número, estime o número total de clones independentes na biblioteca.
   NOTA: Neste ponto, pegue algumas colônias independentes (4-6) que aparecem na placa na qual as pequenas alíquotas da reação de transformação foram espalhadas, cultive-as separadamente e isole os plasmídeos delas para confirmar que praticamente todos os clones carregam os fragmentos de DNA desejados⁵. Muitos kits comerciais estão disponíveis para isolar plasmídeos de E. coli. O número de colônias que aparecem na placa após espalhar pequenas alíquotas pode ser contado manualmente.
6. Meça a concentração do pool de DNA da biblioteca. Normalmente, algumas centenas de nanogramas de DNA de biblioteca são suficientes para obter vários milhares de transformantes na próxima etapa.
   NOTA: Recomenda-se medir a concentração de DNA usando um corante fluorescente que se liga ao DNA porque a medição de A₂₆₀ é frequentemente imprecisa.

2. Transformação de levedura com a biblioteca mutante e réplica de revestimento

1. Introduza a biblioteca mutante na cepa de levedura hospedeira (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) para o ensaio Y2H usando cerca de 100 ng de DNA. Pré-transforme as células hospedeiras com o plasmídeo 'isca'.
   1. Após o procedimento de transformação, suspenda as células de levedura em água estéril e espalhe alíquotas de diferentes quantidades em placas apropriadas (geralmente meio SC sem leucina e triptofano: SC-LW [0,67% de base de nitrogênio de levedura, 2% de glicose, 1,546 g / L de mistura dupla de eliminação SC -Leu -Trp e 2% de ágar, consulte a Tabela de Materiais]). Incubar estas placas durante a noite a 30 °C.
      NOTA: O protocolo padrão, como o método acetato de lítio-PEG¹¹ com ~ 5 × 10⁶ células de crescimento logaritmicamente, é suficiente para a transformação da levedura. Outro método com alta eficiência de transformação, como a eletroporação, também pode ser usado.
2. No dia seguinte, quando aparecerem pequenas colônias, selecione as placas com um número apropriado de células (500-2000) e faça réplicas delas da seguinte maneira.
3. Coloque duas folhas de papel de filtro em um bloco de réplica para fazer várias réplicas (o meio é SC-LW e SC-LW contendo canamicina) (consulte a Tabela de Materiais). Incubar a 30 °C durante 1-2 dias.
   NOTA: A concentração de canamicina (G418) é de 600 μg/mL. Não use veludo para réplicas de chapeamento, pois a resolução das colônias será perdida.
4. Depois que as colônias crescerem, compare as placas e escolha os candidatos. Execute um ensaio de cor Y2H (consulte a etapa 3) se lacZ for usado como relator.
   NOTA: Para o repórter Y2H, lacZ geralmente é melhor em detectar uma interação fraca do que HIS3.

3. Ensaio de cor Y2H

1. Coloque uma folha de papel de filtro cortada antecipadamente no tamanho apropriado na placa de réplica preparada usando a etapa 2. Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre o papel de filtro e a placa.
   NOTA: Use papel de filtro nº 4A ou papel de filtro de grau 50 (consulte a Tabela de Materiais). Qualquer SC-LW ou SC-LW contendo placas de canamicina, que são feitas por réplica de chapeamento, pode ser usada para o ensaio de cor.
2. Quando o papel de filtro na placa estiver completamente umedecido (quando a cor do papel de filtro mudar completamente), coloque várias folhas de papel toalha por cima e coloque-o em contato com o papel de filtro para remover o excesso de umidade. Remova a toalha de papel quando ela absorver a água e mudar de cor. Repita esse processo duas ou três vezes.
3. Pegue as bordas do papel de filtro com uma pinça, retire-o da placa rapidamente, mergulhe-o em nitrogênio líquido e congele-o. Se o nitrogênio líquido não estiver disponível, coloque o papel de filtro em uma bandeja de plástico com a colônia voltada para cima e coloque-o imediatamente em um freezer (-20 °C a -80 °C) para congelar completamente.
4. Retire o papel de filtro congelado e coloque-o, com a colônia voltada para cima, sobre uma toalha de papel seca para descongelar. Imediatamente após o descongelamento, coloque o papel de filtro, com a colônia voltada para cima, em outro papel de filtro que tenha sido colocado em uma bandeja plástica ou recipiente lacrado e embebido em tampão Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl e 1 mM MgSO₄, pH 7,0) contendo X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo) e 2-mercaptoetanol⁹ (ver Tabela de Materiais). Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre os papéis de filtro superior e inferior.
5. Cubra a bandeja plástica que contém o papel de filtro e coloque-a em um recipiente hermético ou saco plástico. Feche o recipiente hermético ou saco plástico e incube-o a 37 °C até que apareça uma cor azul.
6. Quando aparecer uma cor azul, coloque o papel de filtro com a colônia voltada para cima sobre cerca de 500 μL de solução de parada (1 M Na₂CO₃) colocada em uma bandeja plástica limpa. A solução de parada é absorvida rapidamente; Portanto, remova o filtro imediatamente, coloque-o sobre uma toalha de papel limpa com a colônia voltada para cima e deixe secar.
7. Depois que a toalha de papel for substituída e o filtro estiver seco o suficiente, use um scanner ou outro dispositivo para capturar os dados.

4. Recuperação e confirmação de clones candidatos

1. Selecione clones candidatos brancos e Kan^R da placa original da réplica (ou da placa replicada não usada para o ensaio de cores). Os exemplos são mostrados na Figura 1C. Confirmar se os clones candidatos são brancos e Kan^R , colocando-os novamente como uma pequena mancha em meio SC-LW contendo canamicina e incubando-os a 30 °C durante 1-2 dias. Faça pelo menos duas séries ou faça réplicas no dia seguinte.
   NOTA: As colônias brancas devem ser selecionadas porque as colônias azuis claras podem reter a interação.
2. Uma vez que os clones candidatos tenham crescido bem, repita o ensaio de cor com pelo menos uma placa gerada na etapa 4.1, conforme descrito na etapa 3, e confirme se eles permanecem brancos e não ficam azuis (Figura 2A).
   NOTA: Ao listrar novamente os candidatos, não transfira grandes quantidades de células. Muitas células tornam impossível distinguir os clones Kan^R e Kan^S .
3. Pegue os clones que ainda são brancos e Kan^R gerados na etapa 4.2 a partir dos restos da placa e cultive-os independentemente em 1 mL de meio de seleção (SC-L ou SC-W, dependendo de qual vetor é usado para a construção da biblioteca) durante a noite a 30 ° C.
4. Transfira a cultura para um microtubo e colete as células por centrifugação (~ 15.000 × g, por 10-30 segundos à temperatura ambiente). Isole o DNA completo do pellet celular da seguinte forma.
5. Suspenda o pellet celular em 400 μL de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) contendo 1 μL de 2-mercaptoetanol e 20 mg / mL de Zymolyase 100T (ver Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 30 min para digerir as paredes celulares. Neste momento, misture delicadamente invertendo o tubo a cada 5-10 min.
6. Quando a suspensão celular se tornar opaca ou translúcida, adicione um volume igual de uma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem por vórtice em velocidade moderada por 10-20 s.
7. Centrifugue os microtubos em uma microcentrífuga por 5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) e recupere a fase aquosa contendo DNA em um novo microtubo. Adicione 0,8 volume de isopropanol e misture bem invertendo o tubo.
8. Deixe o tubo em temperatura ambiente por 2-3 min e depois centrifugue em uma microcentrífuga por 4-5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) para precipitar o DNA.
9. Remover o sobrenadante e lavar o precipitado com cerca de 500 μL de etanol a 70%. Remover completamente o etanol e secar brevemente o precipitado.
10. Adicione 20 μL de tampão TE (10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) ao precipitado, misture brevemente e deixe o tubo durante a noite à temperatura ambiente para dissolver o precipitado.
    NOTA: Se os usuários estiverem com pressa, mantenha os tubos a 37-50 °C. O precipitado de DNA se dissolverá em algumas horas.
11. Assim que o pellet estiver completamente dissolvido, transforme E. coli com uma pequena quantidade dessa solução de DNA.
    NOTA: Cerca de 0,5 μL de solução de DNA é suficiente se E . coli com alta eficiência de transformação for usada.
12. Quando as colônias de E. coli aparecerem, escolha várias colônias independentes, cultive-as e recupere plasmídeos por métodos padrão, como lise alcalina.
13. Introduza o DNA do plasmídeo obtido na etapa 4.12 nas células hospedeiras Y2H que abrigam o plasmídeo da isca. Quando os transformantes aparecerem, verifique-os pelo ensaio de cores (eles devem aparecer brancos) e western blotting⁴ (eles devem expressar uma proteína do tamanho desejado).
    NOTA: O método pós-alcalino¹² é uma maneira fácil e rápida de preparar um extrato de células inteiras a partir de levedura.
14. Se os dois critérios acima forem atendidos, determine o local de mutação dos clones por sequenciamento de nucleotídeos⁴.

Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o método descrito aqui.

Uma biblioteca de mutações foi construída seguindo o método descrito na etapa 1. Fragmentos de DNA Pol2-C foram amplificados com GoTaq polimerase e clonados no vetor Gal4AD (pST2525) usando a enzima In-Fusion. O número de clones independentes na biblioteca foi estimado em 5000.

Conforme descrito na etapa 2, o DNA do plasmídeo da biblioteca foi introduzido na cepa hospedeira Y2H TAT-7, que foi pré-transformada com o plasmídeo LexA-Mcm10. As células foram espalhadas em uma placa SC-LW e replicadas para as placas SC-LW e SC-LW+G418 no dia seguinte. As repetições foram submetidas ao ensaio de cor conforme descrito na etapa 3. Alguns dos resultados do ensaio de cor são mostrados na Figura 1C.

Quarenta e sete colônias que eram brancas no ensaio de cor e resistentes a G418 foram isoladas como as primeiras candidatas de cerca de 8500 transformantes. Eles foram testados novamente com o ensaio de cor, e 25 dos 47 clones foram confirmados como brancos (Figura 2A). Esses 25 clones foram mantidos como candidatos. Os DNAs de plasmídeo candidatos foram recuperados de cada um dos 25 candidatos, conforme descrito na etapa 4. Eles foram reintroduzidos em células hospedeiras de levedura Y2H que abrigavam LexA-Mcm10 e testados com o ensaio de cor, e 16 clones que não tinham cor foram selecionados. Para confirmar ainda mais que estes eram mutantes de sentido incorreto Pol2-C, a expressão da proteína Pol2-C foi confirmada por western blotting. Doze candidatos exibiram uma banda em uma posição quase igual à do controle positivo (proteína de fusão Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, calculada m.w.: 158,8 kDa) (Figura 2B). O ensaio de cor mostrou que esses 12 clones não interagiram com Mcm10 (Figura 2C). Depois de determinar as sequências de nucleotídeos desses clones, foi confirmado que todos eles tinham uma (s) mutação (ões) missense (s). O número de mutações missense variou de um a cinco (dados não mostrados). Em média, cerca de uma mutação missense ocorreu em cada 1000 bases.

Figura 1: Esquemas da abordagem baseada em Y2H para triagem de mutantes nulos/prejudicados de interação. (A) O sistema Y2H. (B) Estratégia para isolar mutantes nulos de interação / prejudicados. 1: O vetor Y2H recém-construído contém uma cópia do gene KanMX a jusante da tag Y2H, domínio DB e AD. É importante ressaltar que este gene KanMX não possui um códon de início e está fora do quadro com a tag Y2H. Portanto, não se espera que o gene KanMX seja expresso a partir desse vetor. Quando o fragmento de DNA amplificado por PCR é inserido no vetor, o gene KanMX é enquadrado com a tag Y2H e expresso. Consequentemente, apenas plasmídeos que abrigam a inserção do tipo selvagem ou uma inserção com uma (s) mutação (ões) missense (s) podem expressar o gene KanMX, que confere resistência ao G418. Plasmídeos com uma (s) mutação (ões) sem sentido ou frameshift não podem expressar o gene KanMX. 2: A biblioteca mutante construída na etapa 1 é introduzida nas células de levedura hospedeiras Y2H. Quando os transformantes aparecem, são feitas réplicas. Ao comparar a expressão de um gene repórter e a resistência ao G418, candidatos a mutantes de interação nula / prejudicada podem ser selecionados. (C) Um exemplo de triagem. A biblioteca de plasmídeos, que abrigava Gal4-AD e um fragmento de DNA Pol2-C mutagênico por PCR, foi introduzida na cepa hospedeira Y2H TAT-7, que foi pré-transformada com o plasmídeo LexA-Mcm10. Imagens de células antes (esquerda) e depois (meio) do ensaio de cor e de células cultivadas em uma placa SC-LW + G418 (direita) são mostradas. Exemplos de candidatos de mutantes de interação nula/prejudicada e falsos candidatos são indicados por pontas de seta brancas e pretas, respectivamente. (D) Sequência de DNA ao redor do local de clonagem de vetores Y2H, vetores AD (superior) e DB (inferior). A sequência dos últimos dez aminoácidos (aa) da etiqueta Y2H (vermelho) até a porção correspondente aos primeiros dez aa de KanMX (verde) é mostrada. Locais de reconhecimento de SmaI e BamHI também são mostrados. As posições dos primers de PCR são mostradas na parte inferior quando o local BamHI é usado como local de clonagem. Os mesmos primers se aplicam para clonar o gene de interesse nos outros plasmídeos (pST2303 / 2523). Essa figura foi modificada de Tanaka et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um exemplo do processo de triagem de mutantes de interação nula/prejudicada. (A) As 47 colônias isoladas como clones candidatos, conforme mostrado na Figura 1C, foram novamente cultivadas em meio SC-LW contendo G418 e submetidas ao ensaio de cor. +: controle positivo (Wt Pol2-C), -: controle negativo (vetor). Os clones candidatos numerados de 1 a 25 foram cultivados para recuperar plasmídeos. (B) Os plasmídeos foram recuperados de cada clone candidato em (A), introduzidos nas células hospedeiras Y2H e novamente submetidos ao ensaio de cor. Dezesseis deles eram brancos (faltava cor). Extratos de células inteiras foram preparados a partir deles, e western blotting com um anticorpo monoclonal anti-HA foi realizado. O número no painel corresponde ao número em (A). Foram realizadas análises de vários clones plasmidiais independentes recuperados de cada candidato, exceto # 6. (C) Resultados do ensaio de cor para os 12 clones finais. Os números correspondem aos de (A). #16, que manteve a interação com Mcm10, foi usado como controle positivo no ensaio de cor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de vetores Y2H contendo KanMX fora do quadro com a tag Y2H.

Arquivo Suplementar 1: Um exemplo das misturas de PCR, os detalhes do primer e as condições de reação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram não ter conflito de interesses.