Artigo de método

Modelo de roedores de perda muscular volumétrica masseter para estudo de materiais de bioengenharia

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DOI:

10.3791/66450

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31 de maio de 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a criação cirúrgica de uma lesão de perda muscular volumétrica (VML) no masseter de ratos, fornecendo um modelo reprodutível e acessível para o estudo de lesões musculares craniofaciais e seu tratamento usando biomateriais como o novo hidrogel.

Resumo

As lesões de perda muscular volumétrica craniofacial (VML) podem ocorrer como resultado de trauma grave, excisão cirúrgica, inflamação e condições congênitas ou outras condições adquiridas. O tratamento do VML craniofacial envolve transferência muscular cirúrgica e funcional. No entanto, esses procedimentos são incapazes de restaurar a função, sensação ou expressão normais e, mais comumente, essas condições não são tratadas. Muito pouca pesquisa foi realizada sobre a regeneração do músculo esquelético em modelos animais de VML craniofacial. Este manuscrito descreve um modelo de rato para o estudo da lesão craniofacial do VML e um protocolo para a avaliação histológica de biomateriais no tratamento dessas lesões. Hidrogel líquido e andaimes liofilizados são aplicados no momento da criação do VML cirúrgico, e os masseteres são excisados em pontos de tempo terminais até 12 semanas com altas taxas de retenção e complicações insignificantes. Hematoxilina e eosina (HE), tricrômico de Masson e análise imuno-histoquímica são usados para avaliar parâmetros de regeneração do músculo esquelético, bem como biocompatibilidade e imunomodulação. Embora demonstremos o estudo de um hidrogel à base de ácido hialurônico, este modelo fornece um meio para avaliar iterações subsequentes de materiais em lesões de VML.

Introdução

Trauma grave, excisão cirúrgica, inflamação e outras condições adquiridas podem resultar em um grau de perda de tecido que sobrecarrega os mecanismos endógenos de reparo do músculo esquelético. A perda de células e estruturas residentes que promovem o processo regenerativo primário pode resultar em remodelação patológica e fibrose tecidual, resultando em déficits de função e sensação a longo prazo e são chamadas de perda muscular volumétrica (VML)1,2,3. A resposta inflamatória às lesões de VML envolve um mecanismo bem documentado e complexo envolvendo macrófagos, citocinas e células miogênicas que apresenta muitos alvos teóricos na medicina regenerativa4. Embora muitos estudos in vitro tenham utilizado esses alvos em modelos animais de tratamento de VML de extremidade, há uma falta de pesquisas sobre a regeneração do músculo esquelético em modelos animais de VML craniofacial 5,6,7.

A perda de tecido craniofacial pode resultar de condições como as descritas anteriormente, e o tecido craniofacial deficiente também pode ocorrer em condições congênitas, como fissuras, que em alguns casos envolvem uma verdadeira deficiência volumétrica de tecido muscular 8,9. Como os músculos da região craniofacial são importantes para a função e também para a aparência estética, os efeitos a longo prazo do VML podem ter aflição psicológica significativa. Vários aspectos do músculo esquelético craniofacial são diferentes do músculo esquelético derivado de somitos encontrado nas extremidades, incluindo variações na expressão gênica, origem embrionária, fenótipo de células satélites, quantidade de células satélites, composição de fibras e arquitetura 10,11,12,13. Essas variações podem resultar em lesões de VML afetando o músculo craniofacial de forma diferente do músculo derivado de somitos14,15. Até o momento, as abordagens de engenharia de tecidos que demonstraram aumentar a regeneração em modelos animais de VML de extremidade não se traduziram de forma equivalente aos modelos animais de VML craniofacial16. Isso ressalta a necessidade de otimizar abordagens in vivo para modelos de VML craniofaciais em animais.

Embora vários estudos in vivo de VML craniofacial tenham sido realizados, os estudos são pequenos e a criação de um defeito muscular craniofacial robusto em modelos animais édesafiadora 8,13. Kim et al. relataram o desenvolvimento de um modelo VML de masseter de camundongo. No entanto, este estudo avaliou a histologia apenas até 28 dias após a lesão e teve poder incerto para detectar diferenças nos resultados histológicos entre os momentos17. Rodriguez et al. relataram o desenvolvimento de um modelo de VML craniofacial de ovelhas. No entanto, eles relataram alta variabilidade dentro dos grupos experimentais, sugerindo heterogeneidade na gravidade da lesão cirúrgica inicial16. Aqui, relatamos o protocolo de nosso modelo VML masseter de rato e demonstramos sua utilidade na avaliação de abordagens de engenharia de tecidos.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com todos os regulamentos aplicáveis, incluindo a adesão às recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Programa Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF aprovou todos os procedimentos e cuidados pós-operatórios com animais (protocolo IACUC #AN195944-01).

1. Cirurgia VML

  1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley machos com 12 semanas de idade, pesando 276-300 g em um recipiente lacrado, usando anestesia geral com isofluorano a uma taxa de 1% a 5%, antes de serem transferidos para um campo cirúrgico estéril.
    1. Posicione os roedores do lado esquerdo de forma que o pescoço fique estendido em posição neutra e o nariz encaixado no nariz anestésico, permitindo a exposição ao lado direito da face.
    2. Taxa de fluxo de isofluorano cônico da indução à taxa de fluxo de manutenção (aproximadamente 2%).
  2. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos roedores.
  3. Limpe o local operatório, delimitado por uma linha entre o canto direito da boca, a base da orelha direita superiormente e o ângulo da mandíbula inferiormente, do pelo usando creme depilatório.
    1. Desinfete o local da operação várias vezes em movimentos circulares usando etanol e esfoliante betadina.
      NOTA: O drapeado estéril não é usado neste protocolo, dado o tamanho e o local de acesso. O procedimento é realizado por meio de uma técnica asséptica de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais.
  4. Crie uma incisão longitudinal de 3-4 cm de comprimento, abrangendo desde a almofada inferior direita até a orelha direita.
    1. Elevar um retalho cutâneo, permitindo a visualização do masseter direito, bem como dos ramos vestibular e mandibular do nervo facial (Figura 1A).
    2. Limpe a pele da fáscia subjacente usando separação romba e segure as bordas da pele em uma posição retraída usando pinças cirúrgicas para visualização ideal do músculo subjacente.
  5. Faça uma incisão transversal de 1-2 cm de comprimento na fáscia que recobre a porção anterior do masseter. Use a separação sem corte para expandir o espaço entre a fáscia e o masseter com cuidado para manter a integridade geral da fáscia restante.
  6. Usando a incisão fascial como uma janela para o masseter superficial, crie uma lesão circular no músculo medindo 5 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade usando uma biópsia por punção descartável esterilizada. Certifique-se de que o defeito esteja centralizado entre os ramos vestibular e mandibular do nervo facial, com cuidado para evitar traumas nos nervos (Figura 1B).
  7. Adicione o biomaterial à lesão do masseter circular (Figura 1C).
  8. Uma vez que o agente esteja adequadamente no lugar, suture a janela fascial de investimento muscular usando uma única sutura de monofilamento 5-0 para evitar a migração.
    NOTA: Os agentes de forma sólida são colocados diretamente na ferida e o tecido pode ser perturbado para promover a saturação com sangue, enquanto os agentes líquidos são adicionados e gelificados, se necessário, ou imediatamente fechados no lugar usando a fáscia para evitar movimentos indesejados. No experimento demonstrado aqui, um criogel à base de ácido hialurônico acrilado é administrado.
  9. Feche a pele usando uma técnica subcuticular simples interrompida ou em execução com monofilamento 5-0.
    1. Aplique cola de pele sobre as suturas para ajudar a prevenir a deiscência da incisão pós-operatória.
  10. Deixe os ratos se recuperarem em uma gaiola com uma fonte de aquecimento externa (almofada de aquecimento embaixo da gaiola ou aquecedores de mãos estéreis na gaiola) e observe por 30 minutos no pós-operatório.
  11. Diluir o antibiótico sulfametoxazol-trimetoprima (200 mg de trimetoprima e 40 mg de sulfametoxazol em 5mL) em água de beber (5 mL/200 mL de água) e administrá-lo em água de beber de roedores por 7 dias de pós-operatório. Certifique-se de que a analgesia perioperatória seja conduzida de acordo com os protocolos institucionais.
    NOTA: Neste estudo, a bupivacaína SC a 0,25% foi administrada antes da incisão cirúrgica, a buprenorfina SC 0,05 mg/kg foi administrada antes da recuperação da anestesia e a 2 mg/kg de meloxicam IP foi administrada antes da recuperação da anestesia e novamente na manhã seguinte.

2. Colheita, congelamento e análise do masseter

  1. Em pontos de tempo predeterminados, sacrifique os ratos induzindo uma overdose de um agente químico (por exemplo, CO2 ou anestésico) na câmara de indução anestésica.
  2. Confirme o sacrifício do roedor realizando uma toracotomia bilateral usando uma única incisão de bisturi através da4ª costela ventralmente para perfurar os pulmões (toracotomia bilateral).
  3. Reabra a incisão cirúrgica para permitir a visualização do masseter e remova a pele que cobre o masseter para facilitar o acesso.
  4. Dissecar e remover o masseter da mandíbula, começando com a separação no ângulo mandibular. Certifique-se de que a dissecção ocorra ao longo da superfície óssea para capturar toda a espessura do masseter.
    1. Dissecar anteriormente ao longo da mandíbula, cortando o ponto de fixação do tendão. Em seguida, dissecar ao longo do arco zigomático posteriormente (Figura 1D). Por fim, disseque a inserção posterior, pois há um risco aumentado de sangramento.
  5. Enxágue o massagista excisado em 1x PBS à temperatura ambiente (RT) e remova a umidade excessiva enxugando completamente a amostra com uma toalha de papel.
  6. Coloque o músculo em um criomoldor e mergulhe-o em um meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT), com a extremidade anterior voltada para baixo e a extremidade posterior voltada para cima.
  7. Adicione o isopentano a um copo de metal e resfrie-o submergindo-o em nitrogênio líquido com cuidado para evitar que o nitrogênio líquido entre nele.
    1. Quando o isopentano atingir a temperatura ideal (-140 a -149 °C) e engrossar ligeiramente, segurar o criomold contendo OCT e o masseter parcialmente submerso no isopentano até que o OCT tenha congelado. Manter o criomoldor congelado em gelo seco até ser transferido para um congelador a -80 °C.
  8. Amostras de masseter congelado por criossecção com a orientação tal que o pólo anterior seja seccionado primeiro, movendo-se posteriormente através da amostra. Defina a temperatura do bloco de tecido para -20 °C e a temperatura da lâmina de criossecção para -15 °C. Para cada 200 μm, corte 4 lâminas (2 com seções de 10 μm, 2 com seções de 6 μm) antes de mover 200 μm mais, cortando 4 lâminas adicionais e repetindo em toda a amostra.
  9. Use as seções de 10 μm para análise histológica (tricrômico de Masson, hematoxilina e eosina, vermelho de Picrosirius, etc.) e as seções de 6 μm para imuno-histoquímica.
    NOTA: Para histologia, seções de 6 μm também podem ser usadas.
  10. Capture imagens usando microscopia de luz ou fluorescência.
  11. Meça as áreas da seção transversal de ~ 200 fibras musculares do músculo masseter usando o software Image J.

3. Análise imuno-histoquímica

  1. Para análise imuno-histoquímica da cadeia pesada da miosina embrionária, fixar lâminas em PFA a 4% por 1 h em RT.
  2. Lave as lâminas em PBS 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
  3. Permeabilize o tecido incubando as lâminas com 0,5% de Triton X-100 em RT por 15 min.
  4. Lave as lâminas em PBS 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
  5. Incubar com anticorpo monoclonal primário de camundongos hospedeiros (1:200) em soro de cabra normal (NGS) a 2% a 4 ° C durante a noite.
  6. Lave as lâminas em PBS-Tween 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
  7. Incubar com anticorpo secundário anti-camundongo marcado com fluoróforo do hospedeiro coelho (1:500) em 2% NGS em RT por 2 h.
  8. Lave as lâminas em PBS-Tween 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
  9. Monte as lâminas usando 3 gotas de montagem fluorescente DAPI antes de colocar uma lamínula.

Resultados

Os resultados para a avaliação do VML craniofacial e regeneração tecidual usando biomateriais incluem resultados quantitativos e qualitativos.

A Figura 2 mostra um exemplo de avaliação qualitativa usando o modelo descrito anteriormente. A observação do crescimento de fibras musculares de novo em nosso hidrogel é um resultado qualitativo positivo (Figura 2A) e sugere que um biomaterial pode fornecer suporte arquitetônico suficiente e fator de crescimento ou entrega de nutrientes. A retenção de hidrogel dentro do leito da ferida (Figura 2B) é visível na coloração HE. A avaliação qualitativa de outros tecidos dentro de um biomaterial pode ser feita, como a identificação de vasos sanguíneos usando HE (Figura 2C) e tricrômico de Masson (Figura 2D). Os ramos mandibular e bucal do nervo facial são visíveis nos cantos superior esquerdo e superior direito da imagem na Figura 2B, confirmando a correta colocação do hidrogel no leito da lesão do VML e fornecendo orientação. Uma camada de fáscia é vista acima do hidrogel, confirmando que o fechamento fascial foi bem-sucedido e permaneceu intacto durante o período pós-operatório. Um resultado negativo observado nesta etapa incluiria perda total de hidrogel (Figura 2E) ou perda de fechamento fascial e extrusão do leito da ferida (Figura 2F), com HE mostrando evidência de leito da ferida ou cicatriz fibrótica, dependendo do tempo decorrido no pós-operatório.

A análise imuno-histoquímica é fundamental na avaliação de biomateriais para o tratamento do VML craniofacial, a fim de identificar tipos celulares e interações moleculares no nível celular. Como o VML resulta na perda de células residentes e arquitetura capaz de regenerar o músculo esquelético, a regeneração muscular de novo no local lesionado é um resultado importante no tratamento4 e na avaliação da eficácia em terapias baseadas em biomateriais para VML. As isoformas de desenvolvimento da miosina, incluindo a miosina embrionária (MYH3) e neonatal (MYH8), são reexpressas nas fibras musculares esqueléticas em regeneração e fornecem um marcador específico para as fibras em regeneração18,19. A Figura 3 mostra um exemplo de como a imuno-histoquímica pode ser usada para identificar tipos celulares de interesse, neste caso, a cadeia pesada da miosina embrionária.

Finalmente, o ImageJ pode ser utilizado para quantificar as características das lâminas histológicas, incluindo imuno-histoquímica e colorações especializadas, como o tricrômico de Masson, para medir a resposta fibrótica (Figura 4). A remoção de uma porção de músculo nas lesões de VML altera a arquitetura e a composição muscular, levando ao aumento da deposição de colágeno I e fibrose macroscópica do tecido compartimental 2,3. Muitos estudos que avaliam tratamentos baseados em biomateriais para VML comparam a fibrose entre o grupo de intervenção e os grupos de controle4. Utilizando o método aqui descrito, os leitos das feridas em animais submetidos à lesão de VML podem ser identificados no tricrômico de Masson como cicatrizes fibróticas (Figura 4A). A deconvolução de cores através do ImageJ pode isolar e quantificar o canal azul correspondente ao tecido conjuntivo ( Figura 4B ) e, em seguida, definir em tons de cinza para medição ( Figura 4C ). A área da cicatriz pode ser isolada e medida usando a Imagem J (Figura 4D) e calibrada para uma barra de escala na imagem para tamanho preciso e área reprodutível. Usando essa abordagem, a deposição de tecido conjuntivo pode ser medida (Figura 4E).

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Figura 1: Esquema cirúrgico demonstrando os passos. (A,B) Lesão cirúrgica do masseter VML. (C) Aplicação de biomaterial. (D) Colheita de masseter. (E) Morfologia muscular após a colheita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Coloração tricrômica de HE e Masson. (A) Cortes de masseter de rato corados com HE da interface hidrogel-músculo com setas indicando estruturas morfologicamente identificadas como fibras musculares esqueléticas. (B) Seção de masseter de rato corada com HE demonstrando a abundância de fibras musculares esqueléticas em todo o hidrogel. (C) Tecido corado com HE e (D) tecido corado com tricrômico de Masson com setas indicando estruturas morfologicamente identificadas como vasos sanguíneos. (E, F) Resultados negativos mostrando perda total de hidrogel com gel aderido ao aspecto superficial do masseter em vez do leito da ferida e perda incompleta de hidrogel com perda de fechamento fascial, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Coloração imuno-histológica para cadeia pesada de miosina embrionária (eMHC) e laminina em seções transversais de masseter de rato. (A) 2 semanas após a cirurgia. (B) 12 semanas após a cirurgia. Uma concentração aumentada de eMHC é observada na amostra de 12 semanas em relação à amostra de 2 semanas. Imagens capturadas com ampliação de 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise quantitativa de fibrose. (A) Seção de masseter de rato corado com tricrômico de Masson para quantificação da deposição de tecido conjuntivo como proxy para fibrose da ferida após lesão de VML em 12 semanas. (B) A imagem J foi usada para deconvoluir o canal azul correspondente ao tecido conjuntivo. (C) A imagem foi convertida em tons de cinza para análise. (D) A área correspondente à cicatriz fibrótica foi isolada e (E) a área de secção transversa e as porcentagens do campo correspondente ao branco (fundo) e preto (tecido conjuntivo) foram calculadas. Imagens capturadas usando microscopia de luz com ampliação de 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Existem várias etapas críticas no protocolo em que é necessária atenção especial para alcançar um resultado ideal. A etapa 1.4 descreve a incisão inicial e a separação romba da pele da fáscia masseter superficial. A dissecção romba deve ser feita diretamente ao longo da pele com uma tesoura apontando para longe do músculo subjacente e da fáscia para evitar cortes e criar involuntariamente uma janela através da fáscia. O aspecto caudal do masseter superficial deve ser evitado para evitar lesões não intencionais na veia submandibular ou na artéria carótida externa. As etapas 1.5 e 1.6 descrevem a criação da janela fascial e do defeito VML, respectivamente. Deve-se tomar cuidado para garantir que a incisão fascial tenha o tamanho mínimo necessário para encaixar a biópsia por punção, pois a fáscia tende a se contrair para longe da incisão e pode ser difícil localizar as bordas na etapa 1.8 se uma incisão muito grande for feita. Novamente, a dissecção romba sob a fáscia deve ser feita apenas o suficiente para permitir que a biópsia por punção caiba dentro da janela e tenha um ângulo adequado para ser perpendicular à mandíbula. Ao criar a lesão VML, é importante identificar a maior área entre os ramos mandibular e bucal do nervo facial. O nervo mandibular distal se divide em uma divisão superior e inferior, e há variação no local onde a divisão superior se ramifica da divisão inferior em direção ao ramo bucal do nervo facial. Como essa divisão segue superiormente, alguns animais podem ter a divisão superior do nervo mandibular diretamente na barriga do masseter, onde o defeito deve ser criado. Nesses casos, o animal não deve ser usado para análise, pois provavelmente haverá uma lesão do nervo periférico confundindo os dados. Ao criar a biópsia por punção, pode ser necessária uma torção suave para penetrar em toda a profundidade de 5 mm. A etapa 2.4 descreve o blotting da amostra de tecido após lavá-la para remover a umidade excessiva. Isso é feito para evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento do tecido e subsequente redução dos artefatos de congelamento na histologia20.

Uma das vantagens desse método é a facilidade de acesso ao músculo masseter superficial e a relativa falta de estruturas de alto risco que podem ser encontradas durante a cirurgia. Como a vasculatura entra na extremidade caudal do músculo, sangramento significativo pode ser evitado na maioria dos casos. Isso é importante, pois não apenas diminui o risco de morbidade, mas também aumenta a padronização e diminui a chance de que a isquemia tenha um efeito de confusão na regeneração muscular. Devido à disponibilidade de um invólucro fascial, este protocolo pode ser usado para avaliar biomateriais em fatores de forma líquidos ou sólidos. Embora um hidrogel acelular tenha sido usado como exemplo para este protocolo, este método pode ser replicado para testar biomateriais com incorporação de células-tronco humanas usando ratos imunodeficientes, como foi feito em estudos anteriores de VML21 de extremidade.

Este estudo não define formalmente a lesão de tamanho crítico na VML, o ponto preciso em que os mecanismos de reparo endógeno não podem mais regenerar o músculo permanece obscuro. Embora seja lógico que a definição possa envolver a remoção de uma certa porcentagem do volume do músculo e, de fato, 20% seja frequentemente citado, há evidências conflitantes, e os dados sugerem que outros fatores, incluindo a localização e geometria da lesão, idade do animal, entre outros, também podem contribuir 16,21,22,23. Apesar disso, a observação de cicatriz fibrosa e contração visível da borda muscular observada 12 semanas após a lesão (Figura 4A) demonstra que ocorreu remodelamento patológico, sugerindo fortemente que as lesões aqui utilizadas são de tamanho crítico em relação à definição padrão.

Como os músculos craniofaciais em humanos, como os músculos intrínsecos da mão, são pequenos em comparação com os músculos dos membros proximais e realizam movimentos mais precisos, eles são mais propensos a ter sua função afetada pelo VML. O masseter foi selecionado neste protocolo devido ao volume adequado para testes e facilidade de acesso. No entanto, a geometria e a localização da lesão são fatores importantes na avaliação da VML, e as conclusões geradas usando esse modelo podem não se traduzir diretamente em outros músculos craniofaciais. O masseter é um músculo da mastigação e, embora contribua para a expressão facial em crianças24, seu papel na expressão facial diminui na idade adulta24. Lesões em outros músculos da face, como o zigomático maior, podem resultar em maior aflição psicológica após a VML, devido ao seu papel mais direto na expressão facial ao longo da vida em relação ao masseter2 5,26. Além disso, este estudo não avaliou a produção de força in vivo, uma limitação que é uma área de necessidade no campo. Até o momento, nenhum método reprodutível para teste funcional do músculo craniofacial com sensibilidade suficiente para comparar grupos de tratamento foi relatado, e isso é complicado pelos extensos músculos compensatórios dentro da face. Desenvolvimentos futuros deste protocolo terão como objetivo introduzir abordagens para medir diretamente a força em músculos faciais individuais.

Métodos alternativos de análise histológica de VML masseter em um modelo de roedor são muito limitados. Kim et al. criaram um sistema EMG vestível para avaliar a funcionalidade dos músculos masseteres lesionados em VML em camundongos. No entanto, seu ponto de tempo terminal foi de 4 semanas, eles não demonstraram a visualização de biomaterial em imagens histológicas, não descreveram um fechamento fascial e se concentraram principalmente na validação de seu sistema EMG versus análise de regeneração muscular e biocompatibilidade de tratamentos baseados em biomateriais17. Novos tratamentos são necessários para a perda muscular volumétrica craniofacial, e este modelo de VML masseter é suficientemente reprodutível para avaliar a resposta muscular à lesão de VML e avaliar os efeitos dos tratamentos na regeneração, fibrose e contratura, especialmente nos primeiros 3 meses após a lesão.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa é apoiada pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Um Ano da UCSF e pelo Programa de Projeto Translacional Interdisciplinar C-Doctor. Agradecemos aos membros do Laboratório Pomerantz e do Programa de Biologia Craniofacial da Universidade da Califórnia em São Francisco por suas contribuições.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
F1.652 Anticorpo monoclonal de cadeia pesada de miosina (embrionário)DSHBF1.652
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG2b de cabra anti-camundongo, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Anticorpo secundário de alta adsorção cruzada IgG de cabra (H + L), Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Punções de biópsia padrão Integra, punção de biópsia padrão descartável; 5 mm, Diâmetro: 0,19 pol., 0,5 cmIntegra12460411
Meio de Montagem com DAPI - Aquoso, FluoroshieldAbcamab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647) pré-adsorvidoAbcamab150127
Sulfametoxazol/Trimetoprim Suspensão Oral, Sabor Cereja, 473 mLMed-Vet InternationalSKU: RXBAC-SUSP

Referências

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