Method Article

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

DOI:

10.3791/66451

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March 22nd, 2024

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1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Detector de Diferença de cAMP In Situ (cADDis) é um novo biossensor que permite a medição contínua dos níveis de cAMP em células vivas. O biossensor é criado a partir de uma proteína fluorescente permutada circularmente ligada à região da dobradiça de Epac2. Isso cria um único biossensor de fluoróforo que exibe fluorescência aumentada ou diminuída após a ligação do cAMP. O biossensor existe em versões ascendentes vermelhas e verdes, bem como versões verdes descendentes e várias versões vermelhas e verdes direcionadas a locais subcelulares. Para ilustrar a eficácia do biossensor, foi utilizada a versão verde para baixo, que diminui a fluorescência após a ligação do cAMP. Dois protocolos usando este sensor são demonstrados: um utilizando um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços compatível com triagem de alto rendimento e outro utilizando imagens de célula única em um microscópio fluorescente. No leitor de placas, células HEK-293 cultivadas em placas de 96 poços foram estimuladas com 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol, o que induziu reduções rápidas e grandes na fluorescência na versão verde para baixo. O biossensor foi usado para medir os níveis de cAMP em células individuais do músculo liso das vias aéreas humanas (HASM) monitoradas sob um microscópio fluorescente. O biossensor verde descendente exibiu respostas semelhantes às populações de células quando estimulado com forscolina ou isoproterenol. Este ensaio de célula única permite a visualização da localização do biossensor com ampliação de 20x e 40x. Assim, este biossensor de cAMP é sensível e flexível, permitindo a medição em tempo real de cAMP em células imortalizadas e primárias, e com células únicas ou populações de células. Esses atributos tornam o cADD uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica da sinalização do cAMP em células vivas.

Introduction

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A adenosina 3',5'-monofosfato cíclico, cAMP, desempenha um papel central na comunicação celular e na coordenação de vários processos fisiológicos. O AMPc atua como um segundo mensageiro, retransmitindo sinais externos de hormônios, neurotransmissores ou outras moléculas extracelulares para iniciar uma cascata de eventos intracelulares1. Além disso, o cAMP está intrinsecamente envolvido em várias vias de sinalização, incluindo aquelas associadas a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e adenilil ciclases. Compreender o papel do AMPc na sinalização celular é fundamental para desvendar os mecanismos complexos subjacentes às funções celulares normais e o desenvolvimento de terapias potenciais para uma ampla gama de condições médicas2.

No passado, vários métodos foram empregados para medir o cAMP direta ou indiretamente. Estes incluíram radiomarcação de pools de ATP celular seguidos de purificação em coluna, HPLC, radioimunoensaios e imunoensaios enzimáticos 1,2. Esses ensaios legados são limitados pelo fato de serem medidas de ponto final, exigindo um grande número de amostras para construir respostas dependentes do tempo. Mais recentemente, os sensores de Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET) foram desenvolvidos para criar ensaios em células vivas, produzindo dados dinâmicos em tempo real e permitindo que os sensores sejam direcionados em diferentes locais subcelulares3. O FRET aproveita dois fluoróforos, um doador fluorescente e um aceptor fluorescente que, quando próximo, o fluoróforo aceitador será excitado pela saída fluorescente do doador. Os dois fluoróforos mais utilizados são a proteína fluorescente ciano (CFP) e a proteína fluorescente amarela (YFP), uma vez que estas possuem propriedades de excitação e emissão compatíveis. Além de CFP e YFP, a utilização da proteína fluorescente verde (GFP) e da proteína fluorescente vermelha (RFP) é comumente usada para biossensores FRET. Os biossensores cAMP FRET operam tendo um doador e um aceptor em extremidades opostas da proteína de ligação ao cAMP Epac2. A ligação do cAMP altera a confirmação de Epac e aumenta a distância entre os fluoróforos doadores e aceptores 3,4. Essa mudança conformacional é detectada por uma perda de FRET, ou seja, a excitação do fluoróforo aceitador pela energia transferida das gotas de fluoróforo doador3. Embora seja um processo aparentemente simples, há uma abundância de limitações e problemas com o biossensor FRET para pesquisa de cAMP5. Uma delas é a seleção de proteínas fluorescentes, por exemplo, GFP, que podem dimerizar naturalmente, reduzindo assim a sensibilidade6. Os biossensores cAMP baseados em FRET foram direcionados para microdomínios específicos7, mas pode haver limitações devido ao grande tamanho de uma construção com dois fluoróforos6. Outra questão significativa é a baixa relação sinal-ruído dos sinais FRET resultante da sobreposição entre excitação e emissão do fluoróforo, resultando em alta frequência de amostragem e complicando a análise dos resultados 4,5.

Mais recentemente, o novo biossensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, resolveu essas e outras limitações quando se trata de estudar a regulação da sinalização do cAMP8. Uma melhoria importante é a dependência de um único fluoróforo. Isso permite um sinal rápido e eficiente com uma faixa dinâmica mais ampla e uma alta relação sinal-ruído. Como resultado, pode haver mais precisão, pois há um escopo menos amplo de comprimentos de onda para vasculhar8. Como as sondas FRET, o biossensor tem sido direcionado para locais subcelulares, permitindo a pesquisa sobre a teoria da compartimentação e a exploração em jangadas lipídicas e não jangadas e outros domínios subcelulares9. Talvez o mais importante seja a adequação de um único biossensor de fluoróforo para triagem de alto rendimento, que melhorou a sensibilidade e a reprodutibilidade em relação aos biossensores baseados em FRET. O biossensor é empacotado em um vetor BacMam para facilitar a transdução de uma ampla gama de tipos de células e controle preciso sobre a expressão de proteínas.

O controle de expressão por meio do vetor BacMam pode ser particularmente útil em ensaios usando ortólogos GPCR de diferentes espécies para facilitar a interpretação de dados de estudos em animais. Além disso, o controle sobre a expressão do receptor é fundamental para medir os diferentes graus de eficácia do medicamento (por exemplo, agonistas inversos e agonistas parciais), e baixos níveis de expressão do receptor são úteis para mimetizar os baixos níveis encontrados no tecido animal. O BacMam é um vetor de baculovírus que foi modificado para transduzir células de mamíferos, como culturas de células primárias e linhas HEK-29310. Marcadores selecionáveis dominantes permitem que o BacMam forneça mais estabilidade em relação às infecções plasmídicas tradicionais11. Esses promotores seletivos permitem uma entrega e expressão gênica mais eficientes. Além disso, a adição de tricostatina A (um inibidor da histona desacetilase) aumenta os níveis de proteína repórter11. Os níveis de expressão podem ser controlados por meio do título do vírus BacMam usado e devem ser otimizados para cada tipo de célula. No caso deste biossensor, uma proteína fluorescente vermelha ou verde está ligada ao Epac nos terminais N e C. Quando o cAMP se liga, uma mudança conformacional no biossensor move os aminoácidos adjacentes à proteína fluorescente. Tal mudança move a absorbância do estado aniônico para o estado neutro a 400 nm, diminuindo assim a fluorescência.

Existem 90-120 GPCRs expressos em uma única célula que respondem a uma ampla variedade de sinais neuro-humorais12. Portanto, pode-se supor que pelo menos várias dezenas de GPCRs por célula podem estimular ou inibir o cAMP por meio do acoplamento Gs ou Gi, respectivamente. Embora tenha havido progresso no monitoramento desse segundo mensageiro em tempo real, como o FRET, são necessários métodos mais eficientes. A metodologia para monitorar a síntese e degradação de sinais de cAMP usando cADDis em tempo real é apresentada aqui. A mudança na fluorescência pode ser monitorada em tempo real usando um leitor de placas de fluorescência para ensaios de alto rendimento ou usando um microscópio fluorescente para ensaios de célula única. Esses métodos são úteis para uma ampla gama de questões biológicas relacionadas à sinalização GPCR via cAMP.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ensaio de alto rendimento do espectrofotômetro de leitura de placas

  1. Semeando células HEK-293 com o vetor cADDis BacMam em uma placa de 96 poços (Dia 1)
    1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HEK quente (Tabela 1) e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e os materiais limpando-os com lenços embebidos em EtOH.
      3. Remover e eliminar os meios HEK do balão com uma pipeta serológica.
      4. Adicionar 5 ml de DPBS livre de Mg2+ e Ca2+ (37 °C) com uma pipeta serológica. Incline o frasco para frente e para trás para lavar o fundo com DPBS. Remova e descarte a SPBD com uma pipeta sorológica.
      5. Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% aquecida com uma pipeta sorológica. Inclinar o balão para garantir que o reagente cobre totalmente o fundo do balão. Coloque a tampa no frasco e deixe o reagente descansar por 3-5 min para permitir que as células se desprendam do frasco.
        NOTA: Este experimento é otimizado para um frasco de 75 cm2 ; Ajustes de volume para reagentes podem precisar ser feitos se um aparelho de cultura de tamanho diferente for usado.
      6. Retire 5 mL de meio fresco contendo antibióticos. Expulsar e retirar o volume do balão para lavar as paredes do balão e separar fisicamente as células.
      7. Recolher o volume total do balão (8 ml) e centrifugar (25 °C) num tubo de 15 ml a 200 x g durante 5 min.
      8. Após centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica, com o cuidado de não perturbar o sedimento.
      9. Para lavar as células sem perturbar o pellet, adicione 500 μL de DPBS sem Mg2+ e Ca2+ DPBS na lateral do tubo de 15 mL. Depois de adicionar suavemente o DPBS, remova e descarte o máximo de tampão possível sem perturbar o pellet. Repita mais uma vez.
      10. Conte as células e ajuste para uma densidade celular de 250.000 células / mL de células.
      11. Faça uma mistura mestre com base nos volumes de reagentes necessários por poço de uma placa preta e transparente de 96 poços. Isso é chamado de "placa de tecido". Veja os volumes abaixo:
        NOTA: Exemplo de 1 poço (volume total 200 μL): 40 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais / mL), 2 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM; concentração final 1 μM), 158 μL de densidade celular de 250.000 células / mL. Exemplo de 10 poços (volume total 2 mL): 400 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais /mL), 20 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM), 1.580 μL de meio com densidade celular de 250.000 células/mL.
      12. Adicione 200 μL de master mix por poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 numa incubadora durante 24 h antes de utilizar o espectrofotómetro de leitura de placas.
  2. Executando em um leitor de placas
    1. Em uma bancada, remova cuidadosamente todos os meios em cada poço e substitua por 180 μL de DPBS com Mg2+ e Ca2+ a 37 ° C.
    2. Inspecione as células em um microscópio para confirmar a saúde celular.
    3. Embrulhe a placa em papel alumínio e incube a 37 °C por 30 min-1 h.
    4. Durante a incubação, prepare os medicamentos para a leitura na diluição de 1:10 (também chamada de 10 vezes) para a dose final desejada. Assim, prepare 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
    5. Adicione 60 μL de cada medicamento de forma colunar a uma placa transparente de 96 poços (chamada de "placa de medicamento").
      NOTA: Com a diluição adequada do medicamento e para otimizar a leitura, os medicamentos são adicionados a uma placa transparente de 96 poços, chamada de "placa do medicamento", para ser transferida no momento da leitura para a "placa de tecido" usando um pipetador múltiplo de 96, permitindo que o medicamento seja adicionado a todos os poços simultaneamente e seja lido rapidamente pelo espectrofotômetro fluorescente.
  3. Configuração do leitor de placa de fluorescência
    1. Ajuste as configurações do leitor de placa de fluorescência.
      1. Modo de leitura: fluorescência. Tipo de leitura: cinético. Leitura dos comprimentos de onda: 494 nm e 522 nm.
      2. Tempo de leitura: Insira 3 min para a leitura fluorescente da linha de base e 7 min para a adição pós-medicamento. Intervalo" é inserido como 00:00:30 por 30 s entre cada leitura.
        NOTA: O tempo de leitura pode ser otimizado e aumentado com base no tempo necessário.
  4. Aquisição de dados
    1. Remova a placa de tecido da incubadora, remova a folha de alumínio e a tampa da placa e coloque a placa de tecido no leitor de placas. Feche a gaveta do leitor para permitir que a placa de tecido descanse e se equilibre à temperatura do leitor (37 °C).
    2. Coloque a placa transparente de 96 poços (placa de medicamento) com as diluições do medicamento sob a pipeta de 96 multi e pratique a extração de 20 μL dos poços. Certifique-se de que haja um volume uniforme de medicamento puxado nas pontas do pipetador.
    3. Inicie uma execução de medição de "linha de base".
      NOTA: 40 RFU ou mais são considerados dados viáveis. Se os dados estiverem abaixo desse valor, o experimento deverá ser interrompido e descartado.
    4. A placa de tecido será ejetada do leitor no final da execução da linha de base. Adicione rápida e cuidadosamente 20 μL da placa transparente do medicamento à placa de tecido preto. Em seguida, comece rapidamente a execução do "tratamento". A placa de tecido não deve ficar fora do leitor por mais de 30 s após a adição dos medicamentos.
      NOTA: Se o medicamento for adicionado muito rapidamente, as células se desprendem da placa de tecido, criando um experimento inutilizável. Além disso, as células são infectadas com uma proteína fluorescente verde sensível à luz; Assim, adicionar rápida e prontamente os medicamentos e iniciar a segunda leitura é imperativo para evitar perder a parte inicial da resposta.
    5. Quando a segunda leitura estiver concluída, certifique-se de que a placa de tecido seja ejetada do leitor e a coleta de dados seja concluída.
      NOTA: Antes de descartar a placa de tecido, é uma prática recomendada verificar se as células ainda estão presas à placa. Observe as células ao microscópio. Se as células forem desanexadas, os resultados serão inválidos e deverão ser descartados. O experimento precisará ser repetido.
    6. Exporte os dados resultantes como um arquivo do Excel.
    7. Abra os dados legíveis exportados do Excel do leitor de chapas e copie e cole as informações relevantes no modelo de conversão do Excel. Os dados serão transformados do leitor de placas configurado para leituras de coluna de poço único à direita dos dados copiados.
      NOTA: As colunas de fluorescência para um poço ao longo do tempo são listadas em RFUs (intituladas transformação de coluna) e como uma mudança decimal em relação à leitura de RFU na leitura inicial (t0 intitulado Delta F). No modelo do Excel, a tabela Delta F é definida como a última leitura de linha de base antes da adição do medicamento. Este é o6º ponto de coleta de dados.
    8. Após a transformação dos dados, copie os dados do Delta F e cole-os no software de análise de dados como decaimento ou decaimento relativo na fluorescência ao longo do tempo.
    9. Altere o título X para "tempo (s)" e o título Y para "ΔF/F0" para valores decimais relativos.

2. Ensaio de célula única usando um microscópio fluorescente invertido

  1. Semeando células (HASM) com o vetor cADDis BacMam em um prato de 35 mm (Dia 1)
    1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HASM quente (Tabela 1), tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e os materiais e limpe o capô com lenços embebidos em EtOH.
      3. Retirar e eliminar os meios HASM do balão com uma pipeta serológica.
      4. Adicionar 5 ml de Mg2+ e Ca2+ DPBS livre (37 °C) com uma nova pipeta serológica e inclinar o balão para lavar o fundo com a DPBS.
      5. Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% aquecida com uma pipeta sorológica. Inclinar o balão para garantir que o reagente cobre totalmente o fundo do balão. Deixe o reagente agir por 3-5 min para permitir que as células se desprendam do frasco.
      6. Retire 5 ml de meios frescos contendo antibióticos e expulse a pipeta para remover as células do fundo do frasco.
      7. Recolher o volume total da centrífuga do balão (8 ml) num tubo de centrifugação a 200 x g durante 5 min.
      8. Após centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica, com o cuidado de não perturbar o sedimento.
      9. Sem perturbar o pellet, adicione 500 μL de DPBS sem Mg2+ e Ca2+ DPBS na lateral do tubo da centrífuga. Remova e descarte o máximo de líquido possível e repita mais uma vez.
        NOTA: Este experimento é otimizado para um frasco de 75 cm2 ; Ajustes de volume para reagentes podem precisar ser feitos se um aparelho de cultura de tamanho diferente for usado.
      10. Conte as células e ajuste para a densidade celular de 40.000 células/mL.
      11. Fazer uma mistura principal com base no volume de reagente necessário por alvéolo de uma placa de 35 mm. Veja os volumes abaixo:
        NOTA: Exemplo de 1 poço (volume total 500 μL): 20 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais /mL), 5 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM, concentração final 1 μM), 500 μL de densidade celular de 40.000 células/mL. Exemplo para 4 poços (volume total de 2 mL): 80 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de genes virais /mL), 20 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM, concentração final de 1 μM), 2000 μL de densidade celular de 40.000 células/mL.
      12. Adicione 500 μL de master mix por poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 h antes de prosseguir a experiência.
        NOTA: O número de células pode variar de acordo com a linhagem celular. Para evitar a sobreposição de células para a análise, use números baixos de células.
  2. Preparação de agentes farmacológicos (Dia 2)
    1. Remova cuidadosamente o meio em cada poço e substitua por 450 μL de DPBS com Mg2+ e Ca2+ a 37 °C.
    2. Embrulhar a placa em papel alumínio e incubar o disco de 35 mm a 37 °C durante 30 min-1 h.
    3. Inspecione as células em um microscópio para confirmar a saúde celular.
    4. Enquanto isso, prepare os medicamentos para a leitura de 1 unidade logarítmica acima da concentração final desejada (10 vezes maior). Assim, prepare 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
    5. Para títulos de dose logarítmica, prepare o medicamento a 10 mM e use diluições seriadas para atingir 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
  3. Aquisição de dados
    NOTA: As configurações a seguir são para um microscópio invertido fluorescente. O software que acompanha cada microscópio pode ser diferente; As configurações gerais usadas no protocolo atual são descritas aqui.
    1. Ligue o hub central e, em seguida, o microscópio fluorescente invertido.
    2. Abra o software que será usado para a captura e escolha a opção de captura de lapso de tempo .
    3. Coloque um porta-amostras de prato de 35 mm no microscópio stage.
    4. Defina a lente objetiva para x20.
    5. Use o foco automático e obtenha uma imagem o mais nítida possível. Se for difícil encontrar células individuais, comece com uma objetiva 4x e depois passe para 20x. Foque a amostra manualmente se o microscópio não tiver um recurso de foco automático.
      NOTA: A ampliação de 40x pode ser usada se forem necessários detalhes morfológicos celulares mais significativos.
    6. Ajuste as seguintes configurações para obter a aquisição de dados ideal: Brilho automático (exposição), Comprimento de onda de excitação, Equilíbrio de preto (para reduzir o ruído de fundo), Foco automático.
    7. Depois de encontrar uma área de visão com várias células fluorescentes citoplasmáticas, adquira dados usando a captura de lapso de tempo por 20 minutos a cada 30 s.
    8. Clique em ir para iniciar a leitura.
    9. Corra por 3 min para coletar a linha de base. Assim que a captura de 3 minutos for feita, adicione suavemente 50 μL do medicamento ao poço apropriado. Quando os medicamentos são adicionados, a concentração final no prato será de 10 μM de forscolina e 10 nM de isoproterenol.
      NOTA: O medicamento deve ser adicionado com cuidado; Não toque na placa com a ponta da pipeta, pois isso pode mover o campo de visão feito e tornar a amostra incapaz de ser analisada.
    10. Deixe o experimento ser executado por mais 17 minutos com captura de dados a cada 30 s.
    11. Depois que o teste for concluído, certifique-se de que os dados estejam prontos para análise.
      NOTA: Embora o protocolo atual não incorpore um controle para desvio focal, pode ser benéfico incluir um no experimento. Por exemplo, o uso de corantes nucleares pode ajudar no gerenciamento do desvio focal durante a análise microscópica, especialmente ao capturar imagens de células vivas por períodos prolongados. Os biossensores cADDis são normalmente distribuídos amplamente dentro da célula, tornando um plano focal amplo a captura mais eficaz e reduzindo a necessidade de controlar o desvio focal9.
  4. Analisando os dados
    NOTA: O software que acompanha cada microscópio pode ser diferente, portanto, as configurações gerais que devem ser usadas para analisar as imagens capturadas são descritas aqui.
    1. Abra os arquivos de imagem capturados durante o experimento.
    2. Use a ferramenta polígono ou círculo para selecionar a região de interesse de cada célula para realizar a análise. A análise deve fornecer o brilho de cada célula em cada ponto de tempo.
      NOTA: A melhor prática é selecionar células individuais e não células que tocam a parede do prato ou outras células. Isso garante a melhor coleta de dados possível. Selecione um mínimo de 5 células para análise dentro de cada condição e replique o experimento pelo menos três vezes.
    3. Depois de analisar os dados, abra os dados em uma planilha do Excel e calcule o brilho médio para cada condição em cada foto, começando na imagem antes de adicionar os agentes farmacológicos ou veículo. Neste exemplo, na marca de 3 minutos ou na6ª foto tirada no microscópio, já que cada foto é tirada a cada 30 s.
    4. Calcule ΔF/F0 para cada valor médio em cada condição.
    5. Carregue em um software de análise estatística e plote ΔF / F0 em relação ao tempo em s.
      NOTA: A Figura 1 fornece uma visão geral esquemática das principais etapas dos protocolos.

Results

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O presente estudo validou o biossensor citosólico em ensaios de leitura de placas e microscópio. Uma vez que as células expressaram o biossensor, elas foram estimuladas com 10 μM de forscolina (um ativador direto da adenilil ciclase), 10 nM de isoproterenol (um agonista em ß1AR e ß2AR) ou veículo (Figura 1). As mudanças subsequentes na fluorescência, indicativas da produção de cAMP, foram capturadas a cada 30 s.

Os dados foram transformados como a mudança na fluorescência da fluorescência inicial (ΔF / F0). Um modelo de decaimento de um local foi aplicado aos dados de fluorescência para quantificar as mudanças temporais nos níveis de cAMP nas diferentes condições (Figura 2 e Figura 3). Os parâmetros dessas curvas de decaimento podem ser usados para quantificar a resposta a uma determinada concentração do medicamento. O produto da taxa de decaimento (k) e o platô como um único valor que quantifica a resposta ao fármaco foi usado, e estes foram usados para criar curvas de concentração-resposta quando múltiplas concentrações do mesmo fármaco são aplicadas13.

No leitor de placas, após estimulação com 10 μM de forscolina, o sensor citosólico mostrou uma diminuição considerável na intensidade de fluorescência em segundos e progrediu ao longo de muitos minutos (da linha de base 0 ΔF / Fo a 200 s a -0,7 ΔF / Fo a 600 s) em células HEK-293 ( Figura 2A ). Dado o design do sensor verde, uma diminuição na fluorescência indica um aumento na produção de cAMP, indicando que a forscolina causou um aumento uniforme nos níveis de cAMP no citosol. A estimulação de células HEK-293 com uma concentração submáxima de isoproterenol (10 nM) levou a reduções rápidas, mas menores, na fluorescência do biossensor (-0,3 ΔF / Fo a 600 s, Figura 2A). Quando essas concentrações mais baixas de isoproterenol (10 nM e 100 nM) foram examinadas em um único poço de células ao longo do tempo, oscilações dos níveis de cAMP foram observadas em células HEK-293 (Figura 2B). A periodicidade dessas oscilações foi consistentemente em torno de 200 s. A análise de dados de rotina inclui o ajuste da resposta a um modelo de decaimento de local único, que calcula a média dessas oscilações (consulte a linha de conexão). A média de vários experimentos juntos normalmente fazia com que essas oscilações ficassem obscurecidas nos dados. No entanto, o biossensor apresenta uma sensibilidade e cinética rápida que permitem a observação das oscilações do cAMP.

cADDis também pode ser medido usando um microscópio de fluorescência. Essa abordagem permite o monitoramento do cAMP em células individuais e também pode ser adaptada para visualizar biossensores direcionados a diferentes locais subcelulares. No presente estudo, o biossensor foi utilizado em células primárias do músculo liso das vias aéreas humanas (HASM). A estimulação do HASM com qualquer veículo, 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol leva a uma diminuição observável na intensidade de fluorescência ao longo do tempo (da linha de base 0 ΔF / Fo em 120 s para -0,9 ΔF / Fo em 410 s) (Figura 3) (Vídeo 1, Vídeo 2 e Vídeo 3). A fluorescência é distribuída uniformemente por todo o citosol das células e exclui o núcleo (veja os vídeos de lapso de tempo). Assim, a forscolina e o isoproterenol produziram uma diminuição rápida e considerável semelhante nas células HASM de fluorescência. Esses dados demonstram a capacidade de usar o biossensor em culturas de células primárias.

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Figura 1: Representação esquemática das etapas do protocolo do biossensor. Inicialmente, as células de cultura são divididas e ressuspensas com meio fresco, depois infectadas com o vírus BacMam que carrega os sensores cADDIS. As células pós-transfecção são estimuladas com agentes farmacológicos que desencadeiam vias celulares que alteram o AMPc. As mudanças na intensidade da fluorescência em resposta à variação da concentração de cAMP são capturadas usando um espectrofotômetro de leitura de placas (A) ou microscópio de fluorescência (B), fornecendo uma quantificação em tempo real da dinâmica do cAMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Monitoramento em tempo real de cAMP em células HEK-293 vivas em um espectrofotômetro de leitura de placas. A fluorescência das células HEK-293 em placas de 96 poços que expressam o biossensor foi medida ao longo do tempo. Após o estabelecimento da fluorescência basal, o decaimento da fluorescência foi monitorado por 7 min. (A) O decaimento da fluorescência após a adição de 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol é plotado como o SEM ± médio de 10-15 experimentos. (B) As oscilações de decaimento de fluorescência são mostradas plotando um único experimento após a adição de 10 nM ou 100 nM de isoproterenol. Os dados em ambos os gráficos são ajustados a um único modelo de decaimento do local (linha de conexão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Monitoramento em tempo real de cAMP em células vivas de HASM em um microscópio de fluorescência. A fluorescência das células HASM em placas de 35 mm que expressam o biossensor foi medida ao longo do tempo. Após o estabelecimento dos valores basais, o decaimento da fluorescência foi medido a cada 30 s por 20 min. O agente indicado foi adicionado aos 120 s (seta). As curvas de decaimento da fluorescência do biossensor em resposta a qualquer veículo, 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol. Os dados de um único experimento são mostrados com uma linha de conexão. Vídeos de lapso de tempo de células tratadas com veículo (controle), forscolina ou isoproterenol são incluídos para fornecer uma representação visual das respostas fluorescentes do biossensor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo de lapso de tempo do monitoramento em tempo real do cAMP em células HASM vivas em resposta ao veículo. Curvas de decaimento de fluorescência do biossensor em resposta ao veículo (controle). Cada quadro foi capturado a cada 30 s por 20 min. Barra de escala: 40 μM. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeo de lapso de tempo do monitoramento em tempo real do cAMP em células HASM vivas em resposta a 10 μM de forscolina. Curvas de decaimento de fluorescência do biossensor em resposta a 10 μM de forscolina. Cada quadro foi capturado a cada 30 s por 20 min. Barra de escala: 40 μM. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Vídeo de lapso de tempo do monitoramento em tempo real do cAMP em células HASM vivas em resposta ao isoproterenol 10 nM. Curvas de decaimento de fluorescência do biossensor em resposta ao isoproterenol 10 nM. Cada quadro foi capturado a cada 30 s por 20 min. Barra de escala: 40 μM. Clique aqui para baixar este vídeo.

Formulação de meios
Meio HASM
NomeVolume
F-12K de Ham419,65 mL
FBS50 mL
HEPES (1M)12,5 ml
Solução de hidróxido de sódio6 mL
L-glutamina 200 mM (100X)5 ml
Cloreto de cálcio (1 M)0,850 mL
Antibiótico-Antimicótico (100X)5 ml
Primocin1 mL
HEK médio
NomeVolume
DMEM (1x)444 mL
FBS50 mL
Antibiótico-Antimicótico (100X)5 ml
Primocin1 mL

Tabela 1: Formulação de meios de meio HASM e meio HEK.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A medição precisa e sensível do cAMP é crucial para entender seu papel em vários processos celulares e para estudar a atividade das vias de sinalização dependentes do cAMP. Existem vários métodos comumente empregados para medir os níveis de cAMP, incluindo ELISA, radioimunoensaio, biossensores FRET e o ensaio GloSensor cAMP 14,15,16,17,18. Cada ensaio cAMP tem pontos fortes e fracos. O protocolo permite a detecção e monitoramento em tempo real, variando de minutos a horas, e a medição da dinâmica do cAMP dentro de células vivas sem a necessidade de incluir inibidores da fosfodiesterase. Este último ponto é crítico para pesquisadores interessados em estudar o papel das isoformas da fosfodiesterase na regulação da sinalização do cAMP19. O biossensor está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) em várias versões: um fluoróforo verde que diminui a fluorescência após a ligação do cAMP, um fluoróforo vermelho que exibe maior fluorescência após a ligação do cAMP e um fluoróforo verde que exibe maior fluorescência após a ligação do cAMP. A versão descendente do biossensor é mais útil, pois o principal fator limitante é o nível de expressão do biossensor, e esta versão exibirá fluorescência máxima na linha de base antes de iniciar um experimento, aliviando a necessidade de avaliar a expressão do biossensor adicionando um estímulo máximo de cAMP. O biossensor também está disponível em versões direcionadas a microdomínios de membrana, cílios primários ou ao núcleo. Essas diferentes versões permitem medições de cAMP simultaneamente nos compartimentos citosólico e de membrana/ciliar dentro da mesma célula. Essas novas ferramentas são exclusivamente adeptas da visualização e quantificação da dinâmica do cAMP em diferentes componentes celulares, uma área de estudo importante e em rápida evolução20.

Os biossensores oferecem um método direto para monitorar efetivamente a dinâmica do cAMP em tempo real, permitindo que os pesquisadores observem mudanças rápidas nos níveis de cAMP com resolução temporal excepcional. Um dos principais pontos fortes do biossensor reside em sua alta sensibilidade, que permite a detecção de variações sutis e significativas nas concentrações de cAMP8. Um exemplo disso nas oscilações do AMPc é observado em baixos níveis de estímulo de isoproterenol em células HEK-293 sem inibidor da fosfodiesterase presente (Figura 2B). Esse comportamento oscilatório não é compreendido e parece exclusivo dessas células, mas a sensibilidade e a cinética rápida do biossensor permitem sua detecção. Deve-se notar, no entanto, que o biossensor pode ser facilmente saturado, de modo que esse biossensor pode ser limitado na quantificação das diferenças entre os sinais de cAMP médios e grandes. Essa característica limitante é particularmente relevante quando se emprega inibidores da fosfodiesterase que causam aumentos globais nos níveis de cAMP quando um estímulo receptor também está presente. Embora apresentemos a infecção por HASM neste estudo, é importante reconhecer o desafio associado à infecção de células primárias usando o vetor BacMam. As condições devem ser otimizadas para tipos de células individuais, a fim de obter expressão suficiente do biossensor. No entanto, a sensibilidade e a escalabilidade do biossensor o tornam adequado para ensaios de alto rendimento.

Outra melhoria do uso deste biossensor em relação aos sensores baseados em FRET é a minimização do fotobranqueamento. Muitos biossensores fluorescentes estão sujeitos a fotobranqueamento após excitação prolongada e repetida. Os protocolos descritos aqui envolvem excitações de curta duração espaçadas de 30 s. O biossensor também é extremamente brilhante, limitando assim o potencial fotobranqueamento para este tipo de análise. O fotobranqueamento seria observado durante a linha de base inicial, lido como um desvio. Se ocorrer desvio da linha de base, pode-se subtrair a linha de base derivada dos dados antes de ajustar a curva ou aumentar o intervalo de amostragem para reduzir a frequência de excitação.

Como outros biossensores de cAMP, este biossensor tem alta especificidade para se ligar ao cAMP. Consequentemente, os sinais gerados por este ensaio se correlacionam diretamente com os níveis de cAMP, reduzindo significativamente a interferência potencial de outros componentes celulares e fornecendo resultados confiáveis. Além disso, vale destacar a versatilidade do biossensor. Embora o ensaio GloSensor seja amplamente utilizado em campo, ele tem certas limitações. Por exemplo, confiar na transfecção transitória pode resultar em ineficiências em tipos específicos de células, e a análise de vários parâmetros ou processos dentro da mesma célula é um desafio. Além disso, o ensaio depende de enzimas luciferase que podem ser influenciadas por certos compostos, potencialmente levando a uma precisão de resultado comprometida21. Por outro lado, o biossensor, pode ser empregado em vários tipos celulares e sistemas experimentais, incluindo células aderentes e em suspensão. Sua compatibilidade com diversos contextos celulares permite que os pesquisadores investiguem a dinâmica do cAMP em diferentes sistemas biológicos 22,23,24. A integração deste ensaio de biossensor com microscopia de fluorescência aumenta ainda mais sua utilidade, uma vez que informações morfológicas celulares também podem ser coletadas 25,26,27.

Este ensaio fornece aos pesquisadores grande flexibilidade no desenho experimental, permitindo uma ampla gama de investigações relacionadas à sinalização do cAMP. Ele serve a vários propósitos, permitindo a medição dos níveis basais de cAMP, o estudo das flutuações do cAMP em resposta a diversos estímulos ou tratamentos e a exploração da dinâmica do cAMP em várias condições fisiológicas ou patológicas. Um dos principais pontos fortes do ensaio é sua compatibilidade com outras técnicas, o que permite uma compreensão mais abrangente da sinalização do cAMP. Ao combinar o biossensor com métodos como coloração por imunofluorescência ou manipulação genética10, os pesquisadores podem obter insights mais profundos sobre a regulação espacial e temporal precisa do cAMP em compartimentos celulares específicos ou vias de sinalização. Por meio dessa integração, os pesquisadores podem investigar as diversas funções do cAMP em vários contextos, levando a informações valiosas sobre as complexidades dos processos celulares mediados por cAMP. O emprego dessas técnicas permite que os pesquisadores visualizem e quantifiquem os níveis de cAMP tanto no nível individual da célula quanto da população, oferecendo uma compreensão abrangente de sua distribuição dentro da célula, incluindo a identificação de pools de cAMP. Como resultado, a combinação desses métodos permite a aquisição de dados precisos, contribuindo significativamente para o nosso conhecimento da sinalização do AMPc.

Embora os métodos tradicionais tenham sido valiosos para a análise de cAMP, a introdução do cADDis representa um avanço promissor neste campo. Sua especificidade, sensibilidade e recursos em tempo real o tornam uma adição valiosa ao kit de ferramentas do pesquisador, principalmente devido à sua compatibilidade com células vivas. Com a capacidade de monitorar os níveis de cAMP em tempo real e sua alta sensibilidade, o biossensor oferece uma vantagem significativa em vários ambientes experimentais. Esse progresso contribui para uma compreensão mais profunda da natureza dinâmica da sinalização do cAMP e suas implicações funcionais em processos fisiológicos e patológicos.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI) (HL169522).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de 96 poços (transparente)Fisherbrand21-377-203
Prato de 35 mmGreiner Bio-One627870Pratos de cultura de células com fundo de vidro
Prato de 96 poços Corning3904Preto com fundo plano transparente
Antibiótico-Antimicótico (100x)Gibco15240062Para mídia HEK e HASM
Microscópio de fluorescência BZ-XKeyence
(IM)Quality Biological IncE506Para mídia HASM
Tubo de centrífuga (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092mídia HEK
DPBS com Mg2+ e Ca2+ Gibco14040-133
DPBS sem Mg2+ e Ca2+Corning14040-133
Soro Fetal Bovino (FBS)R& D systemsS11195Para HEK e HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagente
Ham's F-12K Gibco21127022para mídia HASM
HEPES (1M)Gibco15630080para mídia HASM
IsoproterenolSigmaI6504Droga
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Para mídia HASM
Tubo de microcentrífuga (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiótico para o RNAse do meio de HASM
afastadoSolução
SigmaS2770do hidróxido de sódiode Thermo para o
leitor de placa dos meios Spectrmax M5Trichostatin
A reagentede TCI AmericaT2477Reagente
de tripsina EDTAGibco25200-056
Cloreto de cálcio científica do reagente do reagente do 700511 do HASM

References

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