Neste estudo, demonstramos um protocolo refinado de eletromiografia de fibra única (SFEMG) para permitir a medição in vivo da transmissão da junção neuromuscular (NMJ) em modelos de roedores. Uma abordagem passo a passo da técnica SFEMG é descrita para permitir a quantificação da variabilidade e falha da transmissão da JNM no músculo gastrocnêmio de ratos.
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Artigo de método
Eletromiografia de fibra única estimulada (SFEMG) para avaliação da transmissão da junção neuromuscular em modelos de roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como a conexão final entre o sistema nervoso e o músculo, a transmissão na junção neuromuscular (JNM) é crucial para a função motora normal. A eletromiografia de fibra única (SFEMG) é uma técnica clinicamente relevante e sensível que mede as respostas do potencial de ação de uma única fibra muscular durante contrações voluntárias ou estímulos nervosos para avaliar a transmissão da JNM. A avaliação e quantificação da transmissão da JNM, envolve dois parâmetros: jitter e bloqueio. Jitter refere-se à variabilidade no tempo (latência) entre potenciais de ação consecutivos de fibra única (SFAPs). Bloqueio significa a falha da transmissão NMJ em iniciar uma resposta SFAP. Embora o SFEMG seja um teste bem estabelecido e sensível em ambientes clínicos, sua aplicação em pesquisas pré-clínicas tem sido relativamente rara. Este relatório descreve as etapas e critérios empregados na realização de SFEMG estimulado para quantificar o jitter e o bloqueio em modelos de roedores. Essa técnica pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos para obter informações sobre a função da JNM no contexto da saúde, envelhecimento e doença.
Introdução
A eletromiografia de fibra única (SFEMG) foi inicialmente desenvolvida por Stålberg e Ekstedt na década de 1960 para identificar e analisar potenciais de ação de fibras musculares individuais, principalmente para estudar a fadiga muscular1. A SFEMG é a técnica clínica mais sensível para a avaliação da transmissão da junção neuromuscular (JNM)2. O SFEMG é conduzido pelo registro seletivo de potenciais de ação de fibra única (SFAPs)3. A transmissão da JNM pode ser comprometida devido a fatores como o envelhecimento4,5 e vários distúrbios neuromusculares, como miastenia gravis e esclerose lateral amiotrófica6. Além disso, condições como isquemia, flutuações de temperatura e uso de agentes bloqueadores neuromusculares podem resultar em deficiências na transmissão da JNM, manifestadas pelo aumento da variabilidade da transmissão da JNM2.
Existem duas abordagens para registrar o SFEMG: SFEMG estimulado e voluntário. O SFEMG voluntário envolve o registro de SFAPs de duas JNMs fornecidas pelo mesmo axônio motor usando um eletrodo de agulha concêntrico inserido no músculo que está sendo testado durante a ativação voluntária7. Assim, o SFEMG voluntário requer cooperação do sujeito e só pode avaliar unidades motoras de baixo limiar (aquelas ativadas durante contrações fracas)3. O SFEMG estimulado usa um par de eletrodos estimulantes para estimular os axônios motores durante o registro de SFAPs com um eletrodo de agulha SFEMG inserido no músculo que está sendo testado7.
Tanto no SFEMG voluntário quanto no estimulado, o jitter e o bloqueio são os dois parâmetros usados para avaliar e quantificar a transmissão daJNM8. O jitter descreve a variabilidade no tempo (latência) entre SFAPs consecutivos. Durante o SFEMG voluntário, o jitter é quantificado avaliando as diferenças de latência entre um par de SFAPs (fornecidos pelo mesmo axônio motor) durante 50 a 100 descargas consecutivas. Durante o SFEMG estimulado, o jitter é quantificado avaliando as diferenças de latência entre o tempo de estimulação e o início do SFAP durante 50 a 100 descargas consecutivas. O bloqueio indica falha da transmissão da JNM em desencadear uma resposta de SFAP e pode ser quantificado como a presença ou ausência de cada par de SFAPs durante o SFEMG voluntário ou para cada NMJ durante o SFEMG estimulado 2,7.
Embora seja um teste estabelecido e sensível no ambiente clínico, o SFEMG tem sido aplicado com pouca frequência em pesquisas pré-clínicas 4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Neste relatório, descrevemos a abordagem para realizar e analisar registros de SFEMG em modelos pré-clínicos de roedores. Além disso, apresentamos dados representativos que destacam achados representativos sobre SFEMG que indicam comprometimento da transmissão da JNM após a administração de um agente bloqueador neuromuscular não despolarizante, o rocurônio.
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Protocolo
Todos os protocolos foram aprovados e realizados de acordo com os regulamentos estabelecidos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri.
1. Preparação animal e administração anestésica
- Coloque equipamento de proteção individual adequado.
- Antes do procedimento, meça o peso do rato para determinar a dose apropriada para medicamentos baseados no peso e configurações do ventilador.
- Induza a anestesia com isoflurano inalatório a 3% a 5%. Uma vez estabelecido um nível adequado de anestesia, posicione o rato em decúbito ventral e mantenha a anestesia com isoflurano inalatório a 1%-3%.
- Verifique a adequação da profundidade da anestesia pressionando suavemente o coxim do membro posterior com uma pinça para observar a ausência de resposta de retirada.
- Mantenha a temperatura corporal a 37 °C.
- Aplique pomada à base de petróleo aprovada pelo veterinário nos olhos para evitar o ressecamento. Monitore a profundidade da anestesia observando a frequência respiratória e avaliando as respostas de retirada ao aplicar pressão na almofada do pé usando uma pinça.
- Raspe o membro posterior para ser avaliado usando uma tesoura. Após a depilação adequada, com fita adesiva, posicione o membro a ser estudado com o tornozelo fixado em aproximadamente 90° de dorsiflexão, o joelho em extensão e o quadril em abdução.
- Monitore continuamente a respiração e a frequência cardíaca do rato durante todo o experimento.
NOTA: Um aumento na frequência cardíaca é comumente usado como um indicador de profundidade anestésica inadequada. - Administre isoflurano para eutanasiar o rato, com uma dose de 5% ou mais, até que a respiração tenha cessado por pelo menos 3 min. Confirme a eutanásia por decapitação.
2. Colocação e configuração do eletrodo
NOTA: A transmissão do nervo ciático e do músculo gastrocnêmio pela JNM é avaliada usando o sistema de eletromiografia (EMG). Consulte a Tabela de Materiais.
- Insira um par de agulhas monopolares isoladas de 28 G para estimular o nervo ciático com o cátodo na região do membro posterior proximal, enquanto o ânodo está mais proximal dentro do tecido subcutâneo que se sobrepõe ao sacro.
- Certifique-se de que os eletrodos estimulantes não sejam colocados imediatamente próximos ao nervo ciático ou excessivamente profundos para evitar danos diretos ao nervo ciático ou outras estruturas adjacentes.
- Coloque um eletrodo de aterramento descartável no membro posterior ou cauda contralateral.
- Coloque cuidadosamente um eletrodo de agulha de calibre 27 e 25 mm projetado especificamente para EMG de fibra única, com uma superfície de gravação feita de material de platina-irídio no músculo gastrocnêmio direito. Certifique-se de que os eletrodos SFEMG sejam autoclavados antes de cada uso para manter a esterilidade.
- Insira o eletrodo de agulha SFEMG em paralelo com as fibras musculares do gastrocnêmio para capturar potenciais de ação de fibra única (SFAPs).
- Evite danos musculares ao inserir e manobrar a agulha SFEMG dentro do músculo.
3. Procedimento de eletromiografia de fibra única estimulada (SFEMG)
- Aplique estimulação de corrente constante no nervo ciático direito na frequência de 10 Hz usando uma faixa de intensidade de 0,3-10 mA e uma duração de pulso de 0,1 ms.
- Defina as configurações do filtro em um filtro de baixa frequência de 1 kHz e filtro de alta frequência de 10 kHz. Ajuste o ganho de 200 μV a 1000 μV por divisão para facilitar a visualização de potenciais. Defina a velocidade de varredura em 500 μs por divisão.
- Ajuste a intensidade do estímulo para acionar e isolar SFAPs para registro e análise subsequente.
- Para identificar e analisar uma resposta como um SFAP, certifique-se de que os critérios específicos mencionados abaixo sejam atendidos: Certifique-se de que o tempo de subida do pico da linha de base para a fase negativa seja inferior a 500 μs, a amplitude mínima (pico da linha de base para negativo) seja de pelo menos 200 μV e a resposta exiba consistentemente um comportamento de tudo ou nada (tamanho e forma estáveis entre as respostas).
NOTA: É essencial que as respostas recorrentes exibam fases ascendentes consistentes, sem entalhes ou pontos de inflexão. Observe que o último critério é crucial para distinguir um sinal de qualidade da soma de vários sinais.
- Para identificar e analisar uma resposta como um SFAP, certifique-se de que os critérios específicos mencionados abaixo sejam atendidos: Certifique-se de que o tempo de subida do pico da linha de base para a fase negativa seja inferior a 500 μs, a amplitude mínima (pico da linha de base para negativo) seja de pelo menos 200 μV e a resposta exiba consistentemente um comportamento de tudo ou nada (tamanho e forma estáveis entre as respostas).
- Calcule o jitter, ou variabilidade da latência do SFAP (tempo entre a estimulação e a fase ascendente do pico negativo do SFAP) entre descargas consecutivas, após pelo menos 50 estímulos (50-100 estímulos), e avalie e quantifique o bloqueio.
NOTA: O bloqueio pode ser avaliado como a presença ou ausência em cada sinapse ou como a porcentagem de estímulos que não conseguem desencadear a geração de potencial de ação de uma única fibra. O jitter é calculado usando a seguinte equação7 (o jitter é normalmente calculado automaticamente por sistemas de eletromiografia clínica):
MCD = Valor médio da diferença consecutiva
IPI = Intervalo Interpotencial - Repita o processo para respostas SFAP adicionais. Em média, avalie 10 sinapses de cada animal para calcular o jitter e, posteriormente, determine os valores médios por animal.
- Excluir SFAPs com jitter inferior a 4 μs das análises para evitar a inclusão de potenciais que possam ter sido evocados por estimulação muscular direta11.
- Ao registrar potenciais que exibem bloqueio intermitente, aumente a intensidade do estímulo para verificar se a falha do SFAP não é atribuível à estimulação submáxima.
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Resultados
Para demonstrar aumento do jitter e bloqueio no contexto de falha de transmissão da JNM, o SFEMG estimulado foi realizado com e sem administração intravenosa de rocurônio. O rocurônio é um agente bloqueador neuromuscular de ação intermediária e não despolarizante amplamente utilizado em ambientes clínicos para induzir paralisia muscular durante cirurgias ou procedimentos médicos. Ele opera ligando-se competitivamente aos receptores nicotínicos de acetilcolina na NMJ19. Antes da administração de ro...
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Discussão
O SFEMG é comumente usado para testes diagnósticos em pacientes com suspeita de formas autoimunes, adquiridas e genéticas da doença da JNM. O SFEMG é considerado o exame mais sensível para o diagnóstico do distúrbio da JNM, miastenia gravis20,21. A estimulação nervosa repetitiva (RNS) é outro método mais comumente usado em testes diagnósticos clínicos e envolve a estimulação de um nervo periférico com uma sequência de estímulos e...
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Divulgações
W. David Arnold recebeu financiamento de pesquisa da NMD Pharma e da Avidity Biosciences e é consultor da NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics e Catalyst Pharmaceuticals.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Martin Brandhøj Skov, da NMD Pharma, por seus valiosos conselhos sobre a dosagem de rocurônio, e a Arash Karimi, do Departamento de Engenharia Biomédica da Stony Brook University, por sua assistência nos cálculos. Este estudo foi apoiado em parte por financiamento do NIH para a WDA (R01AG067758 e R01AG078129).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Eletrodo de agulha de fibra única reutilizável de 27 G | Technomed | 202860-000 | eletrodo de gravação de fibra única |
| Seringa de vidro de 2 mL | Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| Cabo destacável | Technomed | 202845-0000 | para conectar o eletrodo do gravador à máquina de eletrodiagnóstico |
| Eletrodo de disco descartável de 2" x 2" com leads | Cadwell | 302290-000 | eletrodo de aterramento |
| agulhas monopolares descartáveis 28 G | Technomed | 202270-000 | eletrodos estimuladores de cátodo e ânodo |
| Cabo de agulha EMG (caixa de comutação Amp/stim) | Cadwell | 190266-200 | para conectar eletrodos monopolares ao estimulador eletrodiagnóstico |
| Helping Hands clipe jacaré com base de ferro | Radio Shack | 64-079 | Mantendo a colocação do eletrodo de gravação |
| Isoflurano (frasco de 250 mL) | Seringa | ||
| Covidien | 81412012 | utilizado para aplicação de gel de eletrodo | |
| Sistema de Monitoramento Fisiológico PhysioSuite com Aquecimento Homeotérmico RightTemp | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Inclui almofada de aquecimento infravermelho, sonda retal e sonda de temperatura da almofada |
| Aparador Pro Pet Kit de tosa | Oster | 078577-010-003 | tosquiadeiras para depilação |
| Tubos endotraqueais de rato (16 G) | Kent Scientific Corporation | ||
| Brometo de rocorônio | Sigma | PHR2397-500MG | bloqueador neuromuscular |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | NA | sistema de eletrodiagnóstico portátil |
| SomnoSuite Low-Flow Sistema de Anestesia Digital | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Inclui adaptador anti-derramamento e anti-vapor na parte superior da garrafa; Tubulação do adaptador de Y; filtro de limpeza de carvão |
| Pomada oftálmica à base de petróleo veterinário | Puralube | 26870 | aplicado durante a anestesia para evitar lesões na córnea |
Referências
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Reimpressões e permissões
