Artigo de método

Uma tarefa apetitiva de memória de trabalho espacial para camundongos em um labirinto radial semiautomatizado de 8 braços, reduzindo a associação de memória de medo no labirinto

DOI:

10.3791/66456

⸱

29 de julho de 2025

 ,  ,  , 
1The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, 2Gerald Choa Neuroscience Institute, The Chinese University of Hong Kong

Neste artigo

Resumo

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A maioria dos experimentos de comportamento para roedores foi originalmente concebida para ratos. Devido às diferenças comportamentais entre ratos e camundongos, às vezes são necessárias modificações para camundongos. Apresentamos um método para testar a memória de trabalho espacial em camundongos, minimizando o estresse durante a tarefa de memória de trabalho.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo de método detalha um protocolo para testar a memória de trabalho espacial em camundongos usando um labirinto radial semi-automatizado de 8 braços (RAM). O RAM é um aparelho parcialmente fechado com 8 braços horizontais igualmente espaçados que irradiam de um hub central, a partir do qual o acesso a cada braço pode ser controlado individualmente por portas motorizadas servo-controladas. Os animais começam no hub central e podem explorar o labirinto para obter uma recompensa alimentar no final de cada braço ou braço selecionado. A tarefa RAM foi originalmente projetada para ratos, mas adaptamos o protocolo para camundongos, por exemplo, incluindo mais etapas de habituação. Em nosso protocolo, todos os braços são inicialmente iscados com leite condensado e os camundongos são admitidos sequencialmente em quatro braços selecionados pseudo-aleatoriamente para coletar as recompensas ("corrida forçada") antes de abrir todas as portas juntas para permitir que os camundongos corram livremente e encontrem as quatro recompensas restantes ("corrida livre"). Um atraso de 5 s é introduzido entre as corridas forçadas e livres para desafiar a memória de trabalho; Um erro é registrado se o mouse entrar em qualquer braço visitado anteriormente durante a execução livre. A tarefa é concluída quando todas as recompensas são recuperadas. Após 6 dias de habituação e 9 dias de treinamento no labirinto, os camundongos C57BL/6 machos atingem regularmente ≥ pontuação diária de taxa de sucesso de 80%, definida como 4/(4+E), onde E é o número de erros. Essa tarefa semiautomatizada poderia, em princípio, ser combinada com métodos de monitoramento in vivo , como eletrofisiologia, microscopia de fótons múltiplos ou imagens de cálcio.

Introdução

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A memória de trabalho1 é um processo cognitivo que pode conter uma quantidade limitada de informações por um curto período enquanto é manipulado e usado no planejamento e execução de uma tarefa mental, como memorizar um número de telefone ou uma rota para um destino de um local diferente. Está intimamente relacionado à inteligência fluida, que é a capacidade de raciocinar rapidamente e pensar abstratamente. Acredita-se que o treinamento da memória de trabalho pode melhorar a inteligência fluida2. A memória de trabalho, portanto, é crucial para estudos de pesquisa.

Os experimentos de comportamento mais populares para roedores foram originalmente concebidos para ratos na década de 1980, e os pesquisadores hoje costumam aplicar esses protocolos a camundongos. No entanto, existem diferenças comportamentais consistentes entre ratos e camundongos 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Especialmente, o controle do medo é um fator importante que pode afetar os resultados dos experimentos, pois os camundongos são mais propensos ao estresse em comparação com os ratos 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Portanto, é importante considerar as diferenças ao aplicar esses protocolos a camundongos. Em nosso protocolo, tentamos minimizar os fatores de estresse durante a tarefa de memória de trabalho no labirinto do braço radial. Isso foi feito cronometrando cuidadosamente os fechamentos das portas usando o software de rastreamento do mouse e controle do labirinto. Além disso, a captura de ratos no final da sessão no hub central foi evitada. Essa abordagem permitiu que os ratos escolhessem seu próximo braço sem associar o local ao medo de serem pegos. Atrasar a captura dos ratos até que todas as recompensas fossem coletadas no labirinto garantiu que a última recompensa não estivesse ligada à experiência de ser pego.

O labirinto de braço radial terrestre (RAM) é um aparelho popular e comumente usado para avaliar a aprendizagem e a memória espacial e não espacial e para testar a memória de trabalho e de referência em roedores. É um dos aparelhos mais populares para aprendizagem espacial e memória em camundongos20 , 21 , 22 . A RAM aproveita a tendência natural dos roedores de explorar o labirinto, encontrar novidades e aprender informações espaciais por tentativa e erro, além de forragear. Essa tendência pode ser aumentada restringindo sua dieta e recompensando-os com a comida preferida no labirinto. Atualmente, várias variantes do aparelho RAM são usadas, por exemplo, com 6, 8, 12 ou 16 braços e um aparelho parcialmente fechado ou aberto/elevado 23,24,25. A maioria dos protocolos atuais é baseada no de Olton et al.20,26, mas usa labirintos mais simples (6 ou 8 braços) 9,24,27,28,29. Testar a memória de trabalho em um labirinto de braço radial (6 ou 8 braços) é mais poderoso do que o labirinto em T (2 braços) porque os animais têm mais opções de braços para explorar.

O RAM original foi projetado por Olton e Samuelson20 para avaliar o aprendizado espacial e a memória em ratos usando iscas alimentares para reforço positivo, ao contrário de labirintos aquáticos como o labirinto aquático de Morris e o labirinto aquático radial de 8 braços que usam reforço negativo, ou seja, imersão em água 20,30,31,32. Olton e Samuelson20descobriram que os ratos têm excelentes memórias de lugares enquanto passam pela RAM. Eles mostraram que o hipocampo está envolvido no processamento de informações espaciais. Eles, portanto, introduziram o conceito de um sistema de memória dupla, compreendendo memória de trabalho e de referência, em roedores. Este sistema de memória dupla havia sido sugerido anteriormente por Honig36 com base em experimentos com pombos. Olton et al. descobriram que a função do hipocampo é essencial para a memória de trabalho. Isso foi conseguido fazendo lesões na área entorrinal, no corpo da fímbria-fórnix, anterior ao hipocampo, septo ou fórnice pós-comissural para romper cada uma das principais conexões de fibras extrínsecas da formação hipocampal 26,33,34,35. As lesões de fórnix-fímbria não afetaram a memória de referência26.

Nos protocolos modernos, os animais são habituados ao ambiente, permitindo que explorem o labirinto livremente por 10-15 minutos por dia durante 3 dias consecutivos, seguido de treinamento no labirinto por 1-3 semanas com um alimento preferido no final de todos os braços ou braços selecionados fixos, testando a memória de trabalho ou a memória de trabalho e a memória de referência no mesmo experimento, respectivamente 9,29,37.

Muitas vezes, esses protocolos não são descritos completamente e as diferenças comportamentais entre ratos e camundongos não são bem consideradas. Aqui apresentamos nosso protocolo e experiência em detalhes, especialmente como evitar associar experiências de medo a lugares e tempo com base nas diferenças de gerenciamento de medo entre ratos e camundongos. Este protocolo é para pesquisadores que desejam estudar a memória de trabalho espacial e aplicá-la à eletrofisiologia, imagens em tempo real e histologia usando camundongos.

Protocolo

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Todos os experimentos com camundongos foram pré-aprovados pelo Comitê de Ética da UCL e autorizados pela Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 e pela legislação subsequente do governo do Reino Unido.

1. Preparação de programas para o controle automatizado do labirinto em um aplicativo de software

NOTA: O labirinto de braço radial automatizado, conforme mostrado na Figura 1A-C, e o layout da sala na Figura 1D foram usados.

  1. Prepare um fluxo de trabalho experimental para o fechamento da porta, conforme descrito na Figura 2.
  2. Defina o início do estágio de habituação 1 (Figura 2A) em um aplicativo de software. Para fazer isso, siga as etapas abaixo.
    1. Defina o início da avaliação e das gravações de vídeo e feche todos os braços do software. 5 s depois que o software reconhece o mouse no hub central do labirinto, ele começa a rastrear e abre todas as portas.
    2. Quando o mouse entrar em um braço e estiver a 4 cm de distância da porta mais próxima das portas do hub central, feche todas as portas. Em seguida, imediatamente após fechar todas as portas, abra a porta do braço que o mouse selecionou.
    3. Assim que o mouse retornar ao hub central, feche a porta e confine-o ao hub central por 5 s. Repita isso por 30 min.
    4. Pare a gravação e o rastreamento de vídeo quando decorridos 30 minutos e o mouse retorna ao hub central.
      NOTA: Deixe o mouse explorar o labirinto livremente à sua vontade.
  3. Estágio de habituação 2 (Figura 2B)
    1. Defina o início do teste e a gravação de vídeo no software associado e feche todas as portas.
    2. 5 s após o software reconhecer o mouse no hub central do labirinto, inicie seu rastreamento e abra todas as portas.
    3. Termine o teste se o mouse entrar em cada braço pelo menos duas vezes ou após 30 minutos e depois retornar ao hub central. Deixe o rato explorar o labirinto livremente à sua vontade.
  4. Estágio de habituação 3 (Figura 2C)
    NOTA: Este estágio é a combinação dos estágios 1 e 2.
    1. Configure o software para iniciar o teste e a gravação de vídeo e feche todas as portas.
    2. Configure o software para controlar as portas do labirinto 5 s depois que o software reconhecer o mouse no hub central. Defina o início do rastreamento neste ponto e abra todas as portas.
    3. Feche todas as portas quando o mouse entrar em um braço e estiver a 4 cm de distância da porta mais próxima das portas do hub central. Em seguida, abra a porta do braço.
    4. Feche a porta quando o mouse entrar totalmente no hub central e confine o mouse no hub central por 3 s. Repita essa sequência por 30 minutos ou até que o mouse entre em cada braço pelo menos uma vez.
    5. Defina o final do teste após cumprir a condição e quando o mouse entrar totalmente no hub central.
      NOTA: Deixe o mouse explorar o labirinto livremente à sua vontade.
  5. Tarefa de memória de trabalho (Figura 2D, E)
    1. Configure o software para iniciar a avaliação e a gravação e feche todas as portas.
    2. 5 s depois que o software reconhecer o mouse no hub central, configure o software para iniciar o rastreamento.
    3. Inicie a fase de execução forçada. Apresente 4 braços escolhidos pseudo-aleatoriamente, um por um, para o mouse.
    4. Quando o mouse entrar no primeiro braço e estiver a 3 cm de distância do hub central, certifique-se de que a porta feche e o confine no braço por 15 s.
    5. Deixe a porta abrir e deixe o mouse voltar para o hub central.
    6. Feche a porta e abra o segundo braço.
    7. Repita isso até o quarto braço.
    8. Quando o mouse retornar ao hub central após o quarto braço da fase de execução forçada, confine-o ao hub central por 5 s.
    9. Deixe todas as portas se abrirem e inicie a fase de corrida livre.
    10. Termine o teste quando o mouse retornar ao hub central depois de coletar todas as recompensas/inserir todos os braços pelo menos uma vez.

2. Preparando gaiolas domésticas para alojamento individual

  1. Configure novas gaiolas usando materiais de nidificação padrão para um novo experimento.
    1. Coloque uma nova roupa de cama, serragem, um iglu de papel, um túnel de papel, listras de nidificação de papel e um bloco de mordida de madeira em novas gaiolas para cada rato para o experimento.
    2. Coloque o depósito de alimentos e feche a tampa.
      NOTA: Os ratos podem danificar as peças para ventilação se estiverem sem o funil de alimentos.

3. Manuseio, pesagem e restrição alimentar na sala de armazenamento de animais (Dia -7 ao Dia 0)

  1. Guie o mouse até o túnel de papel fornecido na gaiola doméstica com a mão suavemente.
  2. Levante o mouse da gaiola agrupada usando o túnel de papel 38,39,40 com a mão, mantenha-o na altura do peito por alguns segundos. Alternativamente, deixe o rato subir na mão voluntariamente.
    NOTA: Lidar com animais com estresse mínimo é essencial para experimentos de comportamento. Nunca os pegue pela cauda, o que é estressante para os ratos. Habituar os ratos ao experimentador também é importante. Os ratos precisam estar bem habituados e relaxados, ou não aprenderão bem no labirinto mais tarde.
  3. Sempre segure o mouse usando o mesmo método de manuseio. Coloque o mouse na balança para monitoramento do peso corporal e registre seu peso corporal.
    NOTA: Não estresse os ratos com movimentos rápidos do corpo ou fazendo barulhos altos. É melhor fazer isso em um ambiente silencioso. Caso contrário, eles podem pular da balança ou da mão do experimentador. Além disso, se os camundongos estiverem estressados, eles podem mostrar olhos semicerrados, guinchar e morder a mão do experimentador41,42.
  4. Após a pesagem, coloque o rato na nova gaiola preparada anteriormente.
  5. Coloque os ratos em uma dieta com uma quantidade restrita por uma semana antes da exposição ao labirinto do braço radial. Isso os motiva a procurar no labirinto as recompensas alimentares fornecidas. A recompensa alimentar durante o experimento é o leite condensado diluído.
  6. Coloque 2 ~ 3 g de ração padrão na gaiola e mantenha o peso corporal entre 85 ~ 90% do peso inicial durante todo o experimento.
    NOTA: Os camundongos C57BL / 6 comem 3-4 g de ração padrão todos os dias43.
  7. Observe a queda noturna no peso corporal como um guia para padronizar a quantidade de alimentos a serem administrados no dia seguinte. A partir de então, dê uma quantidade diária suficiente de ração padrão para manter 85-90% de seu peso corporal inicial durante todo o experimento.
    NOTA: Esses animais precisam perder peso lentamente. Monitore seu peso corporal e expressões faciais para evitar estresse.
  8. Forneça 1 mL de leite condensado diluído (recompensa; leite condensado adoçado: água = 1: 1) em um pequeno copo de plástico na gaiola doméstica para habituar os ratos até o final do estágio de habituação 1. Certifique-se de que os ratos comam a recompensa. Troque a comida de recompensa se a cepa de camundongos mostrar neofobia à comida apresentada.
    NOTA: A partir do estágio de habituação 2, não forneça a recompensa na gaiola doméstica. Se o peso corporal de qualquer camundongo cair abaixo de 80% do peso inicial, ele deve ser sacrificado de acordo com a IACUC e as diretrizes específicas do país. Se um camundongo não estiver na faixa normal de peso corporal para a linha de camundongo que está sendo usada (20-30 g com 8-12 semanas de idade) na primeira verificação do peso corporal, ele não deve ser considerado na coorte para evitar dificuldade em manter seu peso corporal na faixa exigida posteriormente.

4. Trazendo ratos para a sala de testes

  1. Use um carrinho para levar os ratos para a sala de teste de comportamento lentamente.
  2. Deixe os ratos intactos no carrinho por 5 min.

5. Configuração da sala

  1. Defina a iluminação da sala iluminando o hub central indiretamente, a 80 lux com lâmpadas brancas quentes, e reproduza ruído branco a 70 dB medido no hub central. NOTA: Sabe-se que a exposição a ruído branco de intensidade moderada leva os ratos a ter melhor desempenho em um labirinto geometricamente complexo44,45. O ruído branco parece fazer mais do que simplesmente mascarar o ruído inevitável no ambiente; O ruído branco de 70 dB aumenta a captação de colina em várias regiões do cérebro de ratos, incluindo o córtex pré-frontal, hipotálamo e hipocampo (mas não no estriado) 46 e sabe-se que o desempenho da memória de trabalho RAM depende da integridade das vias colinérgicas entre o hipocampo, córtex frontal e prosencéfalo32,47. Sabe-se também que os animais usam pistas visuais distais e proximais para navegar com precisão em seus ambientes. No entanto, os camundongos dependem mais de pistas visuais distais do que de pistas proximais para navegar durante o aprendizado espacial48. Neste experimento, pistas proximais impressas em um pequeno pedaço de papel foram introduzidas nas paredes traseiras de todos os braços da RAM de 8 braços, mas não reduziram o comportamento de encadeamento. Pistas visuais distais geometricamente assimétricas (no teto e nas paredes da sala), por outro lado, reduziram o encadeamento e foram essenciais para a navegação espacial na RAM.

6. Estágio de habituação 1 - Não recompensado (Dia 1 - 2)

NOTA: Nenhuma recompensa é atraída no labirinto. Este estágio é para habituar os ratos às portas do labirinto e seus sons.

  1. Inicie o rastreamento do mouse e a gravação de vídeo clicando no botão Iniciar no software e trazendo o mouse para o labirinto sem estressá-lo. Faça isso movendo-se lentamente e alterando a altura lentamente enquanto o mouse está na mão do experimentador. Coloque o mouse no hub central.
    NOTA: Se os ratos tremerem na mão do experimentador, diminua os movimentos. É um sinal de medo. Os ratos se movem durante o período de confinamento de 5 s no hub central antes de iniciar a fase de corrida forçada. Eles podem ficar de frente para qualquer lado quando colocados no hub central.
  2. Continue observando o comportamento do mouse no monitor do PC colocado longe do labirinto ou abaixo do nível da parede do labirinto. Se o rato tentar escapar do labirinto subindo na parede, simplesmente levante-se da cadeira para mostrar a existência do experimentador e caminhe em direção a ela, monitorando seu desempenho. Na pior das hipóteses, empurre o mouse de volta para o labirinto.
    NOTA: Normalmente, os ratos voltam ao labirinto depois de ouvir o ruído de fricção das roupas do experimentador ao se aproximarem dele. Isso precisa ser feito rapidamente. Se o experimentador continuar fazendo isso, os camundongos permanecerão no labirinto após os estágios de habituação 1 a 3. Se os ratos continuarem pulando do labirinto, é aconselhável removê-los de outros experimentos e análises.
  3. Após o teste, colete o rato de um braço do labirinto, deixando o rato subir na mão do experimentador voluntariamente enquanto a outra mão cobre o braço para evitar que ele pule do labirinto.
  4. Escove as fezes de rato e limpe o labirinto com lenço seco para remover quaisquer vestígios das recompensas. Em seguida, limpe com lenço úmido e seque o labirinto com lenço seco (cerca de 2 min).
  5. Faça isso para cada mouse por vez por dois dias.
    NOTA: Após 30 minutos, os ratos podem não ter visitado todos os 8 braços do labirinto. Isso é normal e não é um problema. Os camundongos tendem a visitar os braços em um padrão não sistemático e não sequencial e se movem com cautela, passando tempos irregulares em cada braço. Os ratos podem escalar as paredes do labirinto e/ou pular para fora do labirinto nesta fase. Se isso acontecer (por exemplo, o rato tenta escalar as paredes), evite-o garantindo que o experimentador faça o rato ciente de sua presença aproximando-se do labirinto e fazendo algum barulho, como roupas farfalhando. Portanto, pode ser necessária uma observação cuidadosa do comportamento do mouse na RAM e uma ação rápida. Após algumas repetições deste procedimento, os ratos permanecerão no labirinto. Se, apesar de tudo, o mouse não ficar na RAM durante a habituação, retire-o da análise.

7. Estágio de habituação 2 - Recompensado (Dia 3 - 4)

NOTA: Este estágio é para incentivar os ratos a explorar o labirinto livremente para obter recompensas alimentares.

  1. Coloque 70 μL da recompensa alimentar em cada poço alimentar em cada braço.
  2. Inicie o rastreamento do mouse e a gravação de vídeo clicando no botão Iniciar no software e, em seguida, colocando o mouse no hub central do labirinto, conforme explicado em 6.1.
  3. Continue observando o comportamento do mouse no monitor do PC de um lugar distante e anote-o se necessário, por exemplo, escalando a parede ou pulando do labirinto. Termine o teste quando o mouse entrar em cada braço pelo menos duas vezes ou 30 minutos se passaram.
  4. Após o teste, colete o rato do labirinto em um braço, deixando o rato subir na mão do experimentador voluntariamente enquanto a outra mão cobre o braço para evitar que ele pule do labirinto.
  5. Limpe o labirinto conforme descrito em 6.4 (Estágio de habituação 1; cerca de 2 min).
  6. Faça isso para cada rato duas vezes por dia durante dois dias.
    NOTA: Nesta fase, os ratos podem apresentar comportamento de encadeamento, mas é desnecessário se preocupar porque as entradas adicionais de 4 braços na tarefa de memória de trabalho podem desencorajar esse movimento. Nesta etapa, os ratos podem parar no braço sem consumir a recompensa. No dia 4, os ratos devem ser mais treinados do que no dia 3, mas ainda podem parar no meio do braço.

8. Estágio de habituação 3 - Recompensado (Dia 5 - 6)

NOTA: Este estágio é para permitir que os ratos se acostumem com o ambiente da combinação dos estágios 1 e 2.

  1. Isque todos os poços de comida com 70 μL da recompensa.
  2. Inicie o rastreamento do mouse e a gravação de vídeo clicando no botão Iniciar do software e colocando o mouse no hub central do labirinto.
  3. Continue observando o comportamento do mouse no monitor do PC de um local distante, até que o mouse entre em cada braço pelo menos uma vez ou 30 minutos. Se o rato tentar escapar do labirinto, aja rápido conforme indicado no Estágio de Habituação 1 (6.2).
  4. Após o teste, remova o mouse do labirinto, deixando-o subir na mão do experimentador voluntariamente enquanto a outra mão cobre o braço para evitar que ele pule do labirinto.
  5. Limpe o labirinto conforme descrito em 6.4 (estágio de habituação 1) (cerca de 2 min).
  6. Faça isso para cada rato duas vezes por dia durante dois dias.
    NOTA: Nesta fase, é melhor remover qualquer mouse que tente escapar do labirinto da análise.

9. Tarefa de memória de trabalho - Recompensado (Dia 7 - Dia 15)

  1. Isca todos os braços com 40 μL da recompensa. Coloque a recompensa em cada alimento bem perto do hub central para dificultar a visão dos ratos do hub central.
  2. Inicie o rastreamento e a gravação do mouse clicando no botão Iniciar do software e, em seguida, coloque o mouse no hub central do labirinto sem estressá-lo.
  3. Durante o confinamento de 5 s no hub central, afaste-se e sente-se em algum lugar longe do labirinto. Monitore o comportamento do mouse e anote a sequência do braço que o mouse visita no labirinto (consulte o arquivo suplementar 1).
  4. Pare de gravar a sequência de visita do braço quando o mouse coletar todas as oito recompensas alimentares, que é o fim da tarefa de memória de trabalho, e deixe-o visitar quatro braços extras.
    NOTA: Ao fazer isso, os ratos podem ter mais algum tempo antes de serem capturados, o que permite que os ratos se concentrem na tarefa de memória de trabalho. Esta etapa também permite que os ratos reforcem o fato de que as recompensas não são reabastecidas depois de coletadas.
  5. Após as quatro visitas extras do braço, remova o mouse do labirinto no final da última visita do braço, deixando-o subir na mão enquanto cobre o braço com a outra mão.
    NOTA: Ao não pegar ratos no hub central, os ratos não associarão a captura ao hub central, onde os ratos decidem para qual braço ir em seguida. Uma vez que os ratos se familiarizam com a tarefa, incluindo as visitas extras do braço, eles podem se mover livremente perto do último poço de comida ou passar algum tempo no hub central. No entanto, eles devem terminar as 4 visitas extras do braço em 3 minutos. Se eles não terminarem em 5 minutos, devolva-os à gaiola de casa.
  6. Selecione a próxima gaiola para ajustar o nível de excitação tocando na gaiola para a próxima tentativa.
  7. Limpe o labirinto conforme descrito em 6.4 (estágio de habituação 1) (cerca de 2 min).
  8. Passe para o próximo mouse e repita isso 6 vezes para cada mouse por vez por 9 dias.
    NOTA: A duração média das quatro visitas extras ao braço deve se tornar mais longa em tentativas posteriores, à medida que os ratos aprendem a reconhecer quando não há mais recompensas disponíveis ou que não há braços novos e não visitados para entrar.

10. Pontuação

  1. Calcule a "pontuação da taxa de sucesso diária" (%) = 4 (metas) / (número total de entrada do braço [4 + Erros]) x 100.
    NOTA: Após a corrida forçada, apenas quatro braços são preenchidos com a recompensa, os gols. Se eles entrarem em um braço que o mouse visitou na corrida forçada, conte-o como um erro, bem como braços repetidos na corrida livre.
  2. Calcule a "pontuação da taxa de tentativa perfeita" (%) em 6 tentativas = [(número de tentativas perfeitas) / 6] x 100
    NOTA: Uma pontuação perfeita significa que não há erro de memória de trabalho.
  3. Selecione a velocidade, distância e aceleração do mouse no software para análise e calcule as médias de cada dia. Certifique-se de excluir as quatro visitas extras do braço dessas análises. Além disso, meça a duração das quatro visitas extras do braço revisando os vídeos de rastreamento do mouse após o experimento.
    NOTA: Os ratos podem fazer curvas rápidas imediatamente após entrar em um braço. Não conte e marque isso como uma entrada, pois é uma correção rápida de erros, o que significa que a memória de trabalho é válida49. No entanto, se o mouse cruzar o ponto médio do braço ou permanecer no braço por mais de 3 s, conte e marque a entrada. As pontuações das taxas diárias de sucesso indicam as curvas de aprendizado dos camundongos e as pontuações da taxa de tentativa perfeita indicam a eficiência da retenção da memória de trabalho.

11. Estatísticas

  1. Se estudar a diferença entre a linha de controle e uma linha de camundongo nocaute, como feito na publicação anterior50, execute as estatísticas conforme descrito abaixo.
    1. Compare os dados resultantes dos grupos controle e experimental usando ANOVA bidirecional de medidas repetidas com uma análise post hoc (por exemplo, teste de Bonferroni) [medindo cada sujeito em 9 pontos de tempo diferentes].
    2. Se estiver comparando grupos, teste pelo menos 10 e de preferência ~ 20 camundongos em cada grupo. Onde o efeito da manipulação de genes, lesões ou tratamento medicamentoso é óbvio, o tamanho das amostras pode ser menor para concluir.

Resultados

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Este protocolo foi usado em nossa publicação anterior, onde perguntamos se novos oligodendrócitos e bainhas de mielina são necessários para o desempenho da tarefa de memória de trabalho espacial usando camundongos MyRF cKO e o controle50. Descobrimos que o desempenho da tarefa de memória de trabalho foi melhorado nos camundongos de controle, mas não nos camundongos MyRF cKO. A tarefa de memória de trabalho estimulou e promoveu a proliferação e diferenciação de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) e a mielinização de oligodendrócitos (OL) nas áreas cerebrais relacionadas ao processamento da memória de trabalho em camundongos do tipo selvagem. Também realizamos a tarefa de alternância recompensada do labirinto em T para avaliar a memória de trabalho espacial. Esta tarefa foi realizada para detectar deficiência de memória de trabalho em camundongos MyRF cKO. No entanto, não foram observadas diferenças significativas na análise histológica entre o grupo de camundongos que teve a tarefa de alternância recompensada do labirinto em T e o grupo controle da gaiola doméstica. Portanto, concluímos que o protocolo aqui apresentado é mais eficaz do que a tarefa de alternância recompensada pelo labirinto em T para estudar a memória de trabalho.

Cada camundongo teve 6 tentativas da tarefa de memória de trabalho por dia, que durou uma hora no total. Assim, este protocolo permitiu um máximo de 8 camundongos em uma coorte. Nos primeiros dias de habituação, os ratos passavam um tempo irregular nos braços do labirinto e seus movimentos eram lentos. Eles ficaram no final dos braços por um longo tempo. Até o final do dia 5 da habituação no labirinto, eles passaram tempos variáveis nos braços do labirinto e puderam retornar ao hub central sem tocar nas recompensas (Figura 3A). No entanto, no sexto dia, os animais entraram em cada braço pelo menos uma vez em 8-15 min, passaram um período semelhante em cada braço, o que indicou que os animais estavam habituados ao labirinto e estavam prontos para a tarefa (Figura 3A, linha inferior do dia 6 e Figura 3B).

Durante os estágios de habituação, eles geralmente ficavam em seus membros posteriores e olhavam para cima dos braços ou do cubo central. Comportamento semelhante foi observado durante a tarefa de memória de trabalho, mas eles não necessariamente giraram na mesma direção (por exemplo, 2 -> 3-> 5 -> 8 [sentido horário] ou 8 -> 5 -> 3 ->2 [sentido anti-horário]). Eles podem mudar de direção (por exemplo, 5 -> 4 -> 6 -> 1). Os camundongos individuais não tinham tendência comunal aparente de escolher a sequência do braço. Os ratos tendem a gastar um pouco mais de tempo selecionando o último braço recompensado do que o primeiro braço recompensado na corrida livre. Isso provavelmente ocorreu porque eles tinham quatro opções para escolher na primeira escolha na corrida livre e apenas uma opção para a última recompensa. O primeiro braço na fase de corrida forçada foi apresentado a camundongos pelo menos 50 (15 + 15 + 15 + 5) s antes do início da corrida livre. Assim, essa tarefa de memória de trabalho não foi muito fácil de executar sem erros de memória de trabalho. O vídeo suplementar 1 mostra um camundongo passando por um teste perfeito no dia 8 do treinamento da tarefa de memória de trabalho.

Usando qualquer um dos sistemas de pontuação, descobrimos que seu desempenho foi quase estável nos primeiros 3 dias do período de teste de RAM de 9 dias, mas melhorou acentuadamente depois disso (Figura 4A, B). Após 6 dias de habituação e 9 dias de treinamento no labirinto, os camundongos C57BL/6 machos alcançaram regularmente ≥ pontuação de taxa de sucesso diária de 80% a partir do dia 8, definida como 4/(4+E), onde E é o número de erros. A distância média percorrida nas corridas livres tornou-se menor com o tempo, mas a velocidade média e a aceleração foram bastante constantes de um dia para o outro (Figura 4C-F). Os camundongos podem ter desenvolvido uma memória de medo de serem pegos durante as quatro visitas adicionais do braço, o que pode ser uma das razões pelas quais os camundongos passaram mais tempo no final do experimento (Figura 4G).

Neste protocolo, as etapas de habituação duraram 6 dias, o que poderia levar ao ajuste do relógio biológico para o experimento, mesmo que o ciclo claro/escuro não fosse revertido em uma instalação animal.

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Figura 1: Especificações e recursos de RAM. (A) Vistas do labirinto do CCD montado no teto e do lado, e as dimensões. (B) O poço de comida foi afundado 1,5 cm abaixo do nível do piso do labirinto para que os ratos não pudessem ver o conteúdo a >10 cm de distância. (C) Configuração da arena do labirinto. O cubo central e o braço 1-8 são mostrados. (D) Esquema da sala experimental e as pistas visuais externas com uma fotografia da sala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Fluxogramas dos programas de controle do labirinto. (A) Estágio de habituação 1 (dias 1 e 2). (B) Estágio de habituação 2 (dias 3 e 4). (C) Estágio de habituação 3 (dias 5 e 6). (D) Tarefa de memória de trabalho (dias 7-15). (E) Esquema do paradigma da tarefa de memória de trabalho. Os ratos passaram pelos quatro braços de corrida forçada escolhidos pseudo-aleatoriamente, foram confinados no hub central por 5 s e depois foram para a corrida livre para coletar as recompensas restantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Mapas de calor e mapas de ninhos de pássaros durante a habituação de 6 dias. (A) Mapas de calor das trajetórias de camundongos durante os dias de habituação 1-6, para três camundongos. Nos dias de habituação 3-6, os ratos foram submetidos a duas tentativas por dia; Os mapas de calor superiores mostram as primeiras tentativas e os inferiores mostram as segundas tentativas. (B) Mapas de ninhos de pássaros para o dia 6 de habituação. Os três superiores mostram os primeiros testes e os três inferiores mostram os segundos testes dos camundongos 1, 2 e 3. A tabela inferior lista as durações dos testes para os mesmos três camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: A tarefa de memória de trabalho da RAM. (A) Pontuações médias diárias da taxa de sucesso (%) calculadas por [4/(número de entradas de braço durante a corrida livre) x 100]. As pontuações de 6 tentativas foram calculadas para o dia. (B) Pontuações de teste perfeitas ao longo dos 9 dias da tarefa. (C) Distâncias individuais percorridas e a média. (D) Velocidades de corrida individuais dos mouses na tarefa e a média. (E) Acelerações individuais dos camundongos e a média. (F) Desacelerações individuais dos camundongos e a média. (G) Durações individuais e médias das 4 visitas adicionais do braço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar 1: O mouse passa por um teste perfeito no dia 8 do treinamento da tarefa de memória de trabalho. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Exemplo de folha de gravação. Anote a sequência das visitas do braço enquanto observa o comportamento do rato. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Treinando e testando a memória de trabalho na RAM
A memória de trabalho é um processo cognitivo que pode reter uma quantidade limitada de informações por um curto período de tempo enquanto é manipulado e usado no planejamento e execução de uma tarefa mental. Os exemplos incluem memorizar o código de entrada de uma porta em um local remoto ou memorizar o caminho para um destino específico. A tarefa dupla N-back e a tarefa de extensão espacial são tarefas de memória de trabalho visuoespacial comumente usadas, nas quais os sujeitos humanos são solicitados a memorizar a localização, identidade e ordem temporal dos estímulos. Takeuchi et al. descobriram que a quantidade de treinamento em tarefas de memória de trabalho bem-sucedidas em humanos, que incluem a tarefa dupla N-back, se correlaciona com o aumento da anisotropia fracionária na parte anterior do corpo do corpo caloso em seu estudo usando ressonância magnética51. Em nosso estudo anterior50, usando o protocolo descrito neste artigo, descobrimos que os oligodendrócitos mielinizantes aumentaram no corpo caloso anterior e em outras áreas do cérebro que se acredita estarem envolvidas no processamento da memória de trabalho, incluindo o córtex cingulado anterior, que se acredita estar envolvido na atenção. O aumento de oligodendrócitos está intimamente correlacionado com o desempenho da tarefa de memória de trabalho, o que é consistente com o estudo em humanos de Takeuchi et al 50,51,52. No entanto, ainda é necessário estudar se existem semelhanças nos processos psicológicos entre humanos e camundongos (por exemplo, eletrofisiologia). A memória de trabalho está intimamente relacionada à atenção. Ele se correlaciona com medidas de 'inteligência fluida' em humanos e é importante para o aprendizado, portanto, importante para estudar. Olton e Samuelson descreveram uma tarefa de labirinto radial de 8 braços (RAM) para treinar e avaliar a memória espacial em ratos20. No experimento de livre escolha, eles forneceram a todos os braços do labirinto 0,1 g de ração de rato, que não foi reabastecida durante o teste. Portanto, apenas oito recompensas foram obtidas em um teste. Todos os braços estavam abertos e os ratos tiveram acesso imediato a todos os braços durante o experimento. Como as recompensas alimentares não foram reabastecidas, os ratos tiveram que usar a memória de trabalho para evitar revisitar os braços visitados anteriormente, a fim de recuperar o máximo de recompensas possível antes do final da tarefa. Cada rato foi colocado no hub central no início e autorizado a entrar em qualquer braço à vontade, para recuperar a recompensa alimentar até que 16 escolhas de braço fossem feitas ou 10 minutos decorridos. Olton et al. contaram o número de braços distintos que os ratos visitaram nas primeiras 8 opções e descobriram que todos os ratos escolheram uma média de mais de 7 braços distintos em 10 dias20. Tentamos um protocolo semelhante com camundongos e descobrimos que os camundongos, ao contrário dos ratos, mostraram encadeamento por alguns dias e não mudaram sua estratégia depois, o que contornou o propósito de avaliar sua memória de trabalho. O camundongo foi, portanto, confinado no hub central entre as visitas do braço, esperando que o confinamento no hub central impedisse o comportamento de encadeamento.

Olton et al. confinaram ratos no hub central por 1 min ou 15 s para interferir em qualquer sequência de escolhas. Isso os impediu de adotar sua tendência usual de progredir ao redor do labirinto continuamente, no sentido horário ou anti-horário20,53. Se a escolha de qualquer braço é aleatória, igualmente provável e completamente independente das escolhas anteriores, o experimento é um exemplo do clássico 'problema de ocupação'20, então as probabilidades p(n,8) de selecionar n braços distintos nas primeiras oito visitas sucessivas do braço são: p(1,8)=4,8x10-7, p(2,8)=4,2x10-4, p(3,8)=0,019, p(4,8)=0,17, p(5,8)=0,42, p(6,8)=0,32, p(7,8)=0,067, p(8,8)=0,0024. A partir dessas probabilidades, pode-se calcular que a probabilidade média de chance de escolher braços distintos é de 5,3 (valor esperado = figure-discussion-1 = 5,25; 5,3/8 = 66%) de 8. Olton et al. relataram que, durante um período de treinamento de 10 dias, os ratos entraram em média 5,7/8 braços distintos (71%; intervalo: 4,2-6,6) nos dias 1-5, aumentando para 7,6/8 braços distintos (95%; intervalo: 7,2-8,0) durante os dias 6-1020, o que é significativamente maior do que o acaso. Isso indicou que os ratos usaram a memória de trabalho para evitar braços sem comida. Tentamos uma abordagem semelhante com camundongos, confinando-os ao hub central por 5 s entre as visitas do braço. Os camundongos entraram em uma média de 5,7 / 8 braços diferentes por teste de 8 braços nos dias 1-5 (71%; intervalo: 5,2-5,8; onze camundongos C57BL / 6) e 5,9 / 8 braços durante os dias 6-10 (74%; intervalo: 5,7-6,5; onze camundongos C57BL / 6). Portanto, os camundongos não conseguiram aprender, ou aprenderam muito lentamente, a melhorar seu desempenho na busca de recompensas significativamente acima dos níveis de chance durante os 10 dias do experimento. Portanto, os protocolos acima foram considerados inadequados para camundongos, optando-se por um paradigma de 'corrida forçada/corrida livre', semelhante ao descrito para ratos por Sasaki et al.27

No protocolo de Sasaki et al.27, todos os braços foram iscados no início do experimento, as recompensas não foram reabastecidas e cada rato foi inicialmente confinado ao hub central de uma RAM aberta elevada de 8 braços. Eles foram então liberados em cada um dos 4 braços pré-selecionados, um braço de cada vez, sem confiná-los nos braços e no hub central entre as visitas dos braços (a 'corrida forçada'). Após a visita do4º braço, o rato voltaria ao hub central, e todas as portas foram imediatamente abertas para permitir que o rato visitasse todo e qualquer braço à vontade (a 'corrida livre'). Para coletar todas as recompensas alimentares restantes da maneira mais eficiente durante a corrida livre, os animais precisam se lembrar e evitar quaisquer armas que já tenham visitado nas corridas forçadas ou livres. Usamos uma abordagem muito semelhante (Figura 2E) com camundongos. Dez minutos de períodos de habituação no início de cada dia de treinamento de RAM em Sasaki et al.27 foram substituídos por um único período de habituação de 6 dias antes do treinamento. Outra modificação feita foi permitir que os ratos fizessem quatro visitas adicionais ao braço no final de cada teste, uma vez que todas as recompensas tivessem sido recuperadas. Isso pretendia reforçar o fato de que as recompensas não são reabastecidas em armas visitadas anteriormente. Além disso, como os camundongos aprendem a "evitar o arrependimento"54,55, isso pode desencorajar o comportamento de encadeamento no teste seguinte, porque tal comportamento não seria recompensado durante as quatro visitas adicionais do braço imediatamente antes do início do teste subsequente. Outra razão para as quatro visitas adicionais ao braço foi evitar que os ratos associassem uma recuperação bem-sucedida de todas as recompensas com a experiência possivelmente temerosa de serem pegos pelo experimentador no final da tarefa. Os camundongos podem ter desenvolvido uma memória de medo quando capturados durante as quatro visitas adicionais do braço, o que pode ser uma das razões pelas quais eles passaram mais tempo no final do experimento (Figura 4G). De fato, os ratos quebraram o comportamento de encadeamento durante as quatro visitas adicionais do braço, se o fizeram no teste. Além disso, os ratos foram confinados em cada braço por 15 s durante a corrida forçada e depois no hub central por 5 s antes de abrir todas as portas para iniciar a corrida livre. Sem confinar o mouse no hub central, os camundongos tendiam a encadear como descrito acima.

Para a corrida forçada, selecionamos de um conjunto de cinco sequências pseudoaleatórias de 4 braços que contêm 3 ou menos braços adjacentes. Estes foram (1,3,5,7), (2,4,5,8), (1,4,5,7), (2,3,4,7), (1,2,5,6) e suas variações de diferentes ordens e rotações de braços, numerando os braços de 1 a 8 no sentido horário a partir do topo (Figura 1C). Cada camundongo em uma coorte foi submetido a seis tentativas (uma tentativa = corrida forçada + 5 s de confinamento no hub central + corrida livre) por dia durante o estágio pós-habituação de 9 dias do teste RAM. Durante a corrida livre, se um rato fizesse apenas quatro visitas ao braço para recuperar todas as quatro recompensas restantes após a corrida forçada, era chamado de "teste perfeito". Seu desempenho durante os 9 dias de treinamento foi quantificado pela "pontuação da taxa de sucesso diária", calculada como 4/(4+E), onde E é o número de erros durante a corrida livre ou a proporção de tentativas que foram "tentativas perfeitas" (ou seja, E = 0). Por exemplo, se um mouse precisasse de 7 visitas de braço para recuperar as 4 recompensas restantes durante a corrida livre, a "pontuação da taxa de sucesso diária" seria 4/7 = 0,57 ou 57% e um teste perfeito pontuaria 100% nesta escala; Se um camundongo fizesse 5 tentativas perfeitas no dia, a pontuação da taxa de tentativa perfeita seria 5/6 = 83,3%.

As pontuações diárias da taxa de sucesso alcançadas pelo encadeamento foram calculadas manualmente para cada um dos padrões de corrida forçada de 4 braços que foram empregados (parágrafo anterior), assumindo que os ratos iniciam sua corrida livre aleatoriamente em qualquer um dos 8 braços da RAM. A pontuação média em muitos ensaios que podem ser alcançados por encadeamento está entre 53% e 56% para os padrões individuais de braço de corrida forçada, ou ~ 55% dos padrões gerais de braço. A probabilidade de obter uma pontuação perfeita (100%) por encadeamento é zero, e a de visitas aleatórias ao braço é de <1% (4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0,87%), assumindo que os camundongos nunca retornam ao braço que acabaram de sair. Portanto, as pontuações médias diárias da taxa de sucesso (>80%) e a porcentagem de pontuações perfeitas (>60%) alcançadas por nossos camundongos nos 2 dias finais do período de teste de 9 dias (Figura 4A, B) só poderiam ser alcançadas de forma consistente usando uma estratégia baseada em memória de trabalho.

Os camundongos que estavam familiarizados com a tarefa tendiam a ficar no último poço de comida, ou no hub central, depois de consumirem todas as recompensas, e também tendiam a gastar mais tempo nas quatro visitas extras do braço no final da tarefa (Figura 4G), sugerindo que haviam aprendido a "regra" de que cada braço continha uma e apenas uma recompensa, e também que eles poderiam acompanhar o fato de que haviam visitado todas as armas disponíveis. Para camundongos de origem genética diferente da usada aqui (C57BL / 6), os resultados podem variar porque a formação genética é importante em experimentos comportamentais 56,57,58. No entanto, em nosso estudo anterior50, usando camundongos com um fundo misto de C57BL / 6, CBA, 129P2, mas retrocruzado com camundongos C57BL / 6J, descobriu-se que o desempenho da tarefa de memória de trabalho foi muito melhorado usando o protocolo descrito aqui, com menos camundongos recorrendo ao encadeamento durante a execução livre. Koike et al.59 relataram que todas as 129 subcepas endogâmicas de camundongos carregam um polimorfismo de deleção Disc-1 que consiste em uma deleção de 25 pb no éxon 6 do Disc-1 que causa um frameshift e truncamento da proteína DISC-1, afetando sua funcionalidade60,61. Essa mutação causou comprometimento da memória de trabalho quando estudada com a tarefa de alternância atrasadado labirinto em T 59, outra tarefa de labirinto win-shift motivada apetitativamente, possivelmente explicando por que os camundongos de controle usados em nosso estudo anterior50 tinham pontuações de memória de trabalho ligeiramente mais baixas do que os camundongos C57BL / 6 consanguíneos. Sempre usamos camundongos que se enquadram na faixa normal de peso corporal para sua idade e tensão para evitar dificuldades em manter seu peso entre 85% e 90%. O tamanho da ninhada pode influenciar a memória espacial e o comportamento semelhante à ansiedade devido à superalimentação no início da vida em uma cepa chamada NMRI62. O pequeno tamanho da ninhada causa superalimentação e aumento do peso corporal nas linhagens de camundongos NMRI e C57BL / 6. No entanto, as duas linhagens resolveram tarefas de aprendizagem espacial de maneira diferente. Enquanto os camundongos C57BL / 6 não mostraram diferenças entre o tamanho da ninhada pequena e de controle, os camundongos NMRI mostraram comprometimento significativo na fase de aprendizado com o teste do labirinto aquático de Morris (MWM) e um leve comprometimento com a tarefa de alternância espontânea do labirinto em Y, embora não tenha sido significativo. Além disso, o pequeno tamanho da ninhada diminuiu significativamente os níveis de proteína do fator neurotrófico derivado do cérebro do hipocampo (BDNF) e aumentou o conteúdo proteico da interleucina-1b do hipocampo (IL-1b) após os testes de MWM e labirinto em Y na cepa NMRI. No entanto, essas alterações não foram observadas na cepa C57BL/6. A linhagem NMRI de camundongos exibiu um aumento significativo nos comportamentos semelhantes à ansiedade e nos níveis de corticosterona induzidos pelo estresse quando criados em pequenas ninhadas. Em contraste, pequenos tamanhos de ninhada para a cepa C57BL / 6 levaram a uma redução nos comportamentos semelhantes à ansiedade e nos níveis de corticosterona. Portanto, é importante considerar o tamanho da ninhada da cepa de camundongo ao projetar experimentos de comportamento.

Diferenças comportamentais entre ratos e camundongos
A maioria das tarefas cognitivas foi originalmente projetada para ratos. Além disso, o aprendizado / memória espacial tem sido extensivamente estudado em ratos. Devido à vantagem das tecnologias transgênicas e de modificação do genoma de hoje para camundongos, os pesquisadores costumam aplicar protocolos elaborados para ratos a camundongos. No entanto, existem diferenças comportamentais consistentes entre ratos e camundongos 3,4,5,6,7. Por exemplo, eles têm diferenças de preferência (preferência social por ratos e preferência alimentar por camundongos)3 e usam estratégias diferentes para negociar diferentes tarefas de labirinto (labirintos aquáticos ou terrestres)4. Além disso, os camundongos tendem a levar mais tempo para atingir boas pontuações de aprendizado espacial em RAM de 8 braços 4,8,9, que é uma das razões pelas quais os camundongos são geralmente considerados inferiores aos ratos em tarefas de aprendizado espacial.

Ratos e camundongos também diferem no comportamento / caráter geral, incluindo suas respostas ao estresse ou controle do medo 3,4,5,6,7,10. Por exemplo, estudos anteriores encontraram baixo aprendizado de extinção do medo em camundongos adolescentes 11,12,13,14, mas não em ratos 15,16,17,18. Além disso, os camundongos são mais propensos ao estresse e não gostam de ser manuseados quando comparados aos ratos, que, quando familiarizados com o manuseio, aparentemente gostam de receber cócegas do manipulador e tentam interagir com os manipuladores para fazer mais cócegas19. Portanto, o gerenciamento do medo é um fator importante a ser considerado ao estudar o comportamento do camundongo. Além disso, Borrow et al.63 relataram que o estresse variável crônico diminui o mRNA da ocitocina e aumenta o volume soma dos neurônios da ocitocina no núcleo paraventricular. Além disso, estudos recentes mostraram que o manuseio do túnel pode reduzir o estresse e melhorar o desempenho em experimentos comportamentais 38,39,40. Portanto, é importante evitar estressar os ratos durante ou antes dos experimentos comportamentais.

Os camundongos não gostam de ser expostos ao ar livre, por exemplo, no teste de campo aberto ou labirinto em mais elevado, preferindo locais mais fechados e escuros64,65. No contexto da RAM, o hub central é o espaço mais aberto, e é a partir daí que os ratos decidem qual braço visitar em seguida. Se eles estiverem ansiosos no hub central, eles podem se distrair da tarefa e terão um desempenho abaixo da média. Por esse motivo, decidimos pegar camundongos em um dos braços radiais (ver parte do procedimento), não no hub central, para que eles não associem o hub a uma experiência de medo.

Ao explorar a RAM de 8 braços para recompensas alimentares, os ratos que emergem de um determinado braço tendem a girar em ângulos retos para a próxima visita ao braço, pulando o braço intermediário, e raramente visitam os braços sequencialmente (o que chamamos de "encadeamento"); ou seja, os ratos tendem a visitar na ordem 1,3,5,7 e não 1,2,3,4 20,53,66. Em contraste, os camundongos geralmente adotam uma estratégia de encadeamento, possivelmente por causa do tamanho e da flexibilidade do corpo. A estratégia de encadeamento é uma maneira bastante econômica para os ratos recuperarem as recompensas alimentares, mas é uma desvantagem considerável para o experimentador que tenta testar a memória de trabalho espacial porque contorna o propósito do experimento67. No entanto, a exposição ao estresse pode afetar a capacidade de aprendizagem e mudar a estratégia de aprendizagem68. Como a abordagem de encadeamento pode indicar estresse, é importante garantir que os camundongos permaneçam sem estresse. Descrevemos nosso protocolo atual como livre de estresse para camundongos durante a tarefa de memória de trabalho porque os camundongos não usam a estratégia de encadeamento.

Sabe-se que os camundongos confiam mais em pistas visuais distais do que em pistas visuais proximais ao navegar no labirinto 48,69,70. Descobrimos que a incorporação de pistas visuais proximais adicionais que foram impressas em pedaços de papel e colocadas nas paredes posteriores de todos os braços não reduziu esse comportamento, o que é consistente com a afirmação de Olton et al. para ratos20. No entanto, colocar balizas nos braços do gol como uma sugestão intramaze ajudou os camundongos a resolver a tarefa da memória de referência do labirinto radial de 6 braços e o teste de memória de trabalho em um experimento71. Além disso, diferentes linhagens de camundongos mostram diferentes habilidades visuais72, mas sua capacidade de aprendizado visuoespacial e memória testadas no labirinto de Barnes não refletiram necessariamente sua capacidade visual, sugerindo que camundongos com habilidades visuais ruins, como BALB/c, podem depender de diferentes processos cerebrais. Assim, os experimentadores precisam considerar quais pistas desejam usar para se adequar melhor aos seus experimentos.

Reduzindo a ansiedade em camundongos durante o manuseio
Sabe-se que o manejo do estresse influencia os animais fisiológica e comportamentalmente 73,74,75,76,77. Além disso, Sandi et al demonstraram que o comprometimento da memória espacial causado pelo estresse agudo está associado à diminuição da expressão da molécula de adesão de células neurais (NCAM) no hipocampo e no córtex pré-frontal, testando ratos em uma tarefa de labirinto aquático dependente do hipocampo usando uma gata como estressor entre o último teste de aprendizado e o teste de sonda78, sugerindo que o hipocampo e o córtex pré-frontal são vulneráveis a altos níveis de estresse. Portanto, é importante reduzir o estresse/ansiedade em animais experimentais para evitar variações inexplicáveis dentro e entre estudos com animais. Especialmente, as tarefas de memória de trabalho exigem que os animais se concentrem durante a tarefa, portanto, distrações desnecessárias devem ser evitadas. Os protocolos publicados para testar a memória de trabalho em ratos, ou a memória de trabalho e a memória de referência juntas, muitas vezes não incluem detalhes importantes, como como, quando e de onde os experimentadores removem os animais do labirinto no final da tarefa. Como os camundongos são menos sociais do que os ratos com o manipulador e são mais propensos ao estresse, esses detalhes são mais importantes para experimentos com camundongos. Os roedores podem desenvolver memória episódica, que é uma forma de memória explícita de longo prazo que inclui a memória de tempos, locais e emoções associadas 79,80,81. Portanto, optamos por não remover os ratos do labirinto imediatamente após eles coletarem todas as recompensas de comida na RAM, mas permitimos que eles fizessem quatro visitas subsequentes ao braço sem ganhar recompensas de comida. Isso foi feito para evitar que os camundongos associassem a recuperação bem-sucedida de todas as recompensas com a experiência possivelmente temerosa de serem pegos pelo experimentador, o que é importante, especialmente para o estágio inicial de aprendizado na RAM. Além disso, as quatro visitas adicionais de braço não recompensadas podem reforçar o fato de que as recompensas alimentares não são reabastecidas nos braços que os ratos visitaram anteriormente. Se o manuseio não for muito estressante para os camundongos, eles interagem com o experimentador com mais frequência38. Para evitar estresse, levante o camundongo de sua gaiola doméstica no início do experimento RAM usando um tubo de papel na gaiola doméstica fornecido quando eles foram separados da gaiola agrupada para o experimento38, ou então permita que o camundongo suba na mão do experimentador voluntariamente, ao manuseá-los em sua gaiola doméstica antes do experimento e ao trazê-los de sua gaiola doméstica para o labirinto. Ao recuperar os ratos do labirinto no final de um experimento, não os persiga no labirinto, mas bloqueie a entrada do braço do labirinto com uma mão e deixe os ratos subirem nela voluntariamente, enquanto cobre o braço do labirinto com a outra mão para evitar que o mouse pule para fora do labirinto. Isso reduz o estresse de ser perseguido no labirinto ou pego pela cauda. Os experimentadores do sexo masculino às vezes são mais indutores de estresse do que os experimentadores do sexo feminino, no que diz respeito aos camundongos82. No entanto, prestando atenção às etapas de redução de estresse descritas aqui, descobriu-se que os experimentadores do sexo masculino poderiam realizar os testes de RAM sem grandes problemas. Assim, como lidar com ratos é mais importante.

Diferenças sexuais
Apenas camundongos machos são usados nos experimentos relatados aqui por causa dos vários impactos do sexo na cognição, aprendizado e memória observados em diferentes espécies (roedores e humanos), e porque as respostas de enfrentamento do estresse diferem entre machos e fêmeas 63,83,84,85,86,87 . No entanto, ao interpretar os resultados obtidos com roedores para possíveis benefícios para os seres humanos, é importante estudar ambos os sexos. As diretrizes do NIH e de outros conselhos de financiamento também sugerem o uso de animais machos e fêmeas.

Vantagens do protocolo
Nosso labirinto radial semiautomatizado de 8 braços é um labirinto fechado com paredes opacas de acrílico branco, mas sem tampas (consulte a Figura 1A para obter as dimensões). Enquanto navegam no labirinto, os ratos não podem ver o experimentador, o que pode ser uma distração em labirintos com paredes transparentes ou braços abertos e elevados, mas podem ver pistas visuais extramazinares distais acima do labirinto (veja a Figura 1). Além disso, este protocolo é, em princípio, aplicável a imagens in vivo em tempo real e eletrofisiologia porque não há fiação acima do labirinto e os camundongos podem aprender a tarefa com eficiência.

Direções futuras
O protocolo atual dura 15 dias desde a habituação até o final da tarefa de memória de trabalho. Realizamos o protocolo sem pausas nos finais de semana; no entanto, ter uma pausa de fim de semana após a habituação de 6 dias não deve afetar significativamente a tarefa seguinte de memória de trabalho de 9 dias. Fazer uma pausa de fim de semana durante a tarefa de memória de trabalho de 9 dias pode retardar o aprendizado em camundongos. Assim, ter dois experimentadores bem treinados no manuseio de camundongos pode ajudar a reduzir o estresse dos experimentadores sem retardar o aprendizado dos camundongos. De acordo com a Figura 4A, B, os primeiros três dias são cruciais, pois os camundongos alcançam mais de um teste perfeito em média após o quarto dia. Portanto, é aconselhável evitar pausas durante os três dias iniciais. Se a tarefa de memória de trabalho for muito fácil para os mouses de seu interesse, pode ser necessário aumentar o tempo de confinamento após execuções forçadas. Estes precisam ser ajustados para casos individuais.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos aos nossos colegas do Instituto Wolfson de Pesquisa Biomédica pelas discussões úteis e a David Bannerman (Universidade de Oxford) pelos conselhos sobre o comportamento do camundongo e pela revisão de um rascunho inicial do artigo. Também agradecemos a Matthew Grist pelo suporte técnico e administrativo. Esta pesquisa foi financiada pelo Wellcome Trust [108726/Z/15/Z e 214286/Z/18/Z] e pelo Instituto de Neurociência Gerald Choa [PJ8425013].

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fórceps de artéria ou alicateQualquerN/APara cortar a ração padrão
C57BL/6J camundongosJackson laboratory0006642~3 meses de idade
Leite condensado (Cravo)NestléN/AUsado como recompensa na tarefa
Água destiladaQualquerN/APara limpeza e diluente do leite condensado
EthovisionXT13 NoldusN/AControle as portas do labirinto e o mouse de rastreamento
- Módulo de ponto de corpo múltiploNoldusN / APara rastreamento de ponto de corpo múltiplo
- Teste e Módulo de controle de hardwareNoldusN/Apara teste e Controle de hardware
- Caixa de E / SNoldusN / AControle as portas do labirinto
Dicas visuais extramazeQualquerN / APara mapear o labirinto por ratos
Câmera de alta resoluçãoTracksysN / APara rastreamento e filmagem de mouse
PincelQualquerN / APara limpeza
Túnel de papelQualquerN / APara manuseio de ratos
Iglu de papelQualquerN/APara aninhamento
Listras de aninhamento de papelQualquerN/APara aninhamento
Pipeman P1000 GilsonF144059MPara fornecer leite condensado diluído para a gaiola doméstica
Ponta de pipeta P1000QualquerQualquer
Pipeteiro P200GilsonF144058MPara atrair o labirinto
Ponta de pipeta P200QualquerQualquer
labirinto de braço radialTracksysN/ALâmpadas de
ambienteQualquerN/APara mesmo iluminação no labirinto
Copo de plástico pequenoQualquerN/APara fornecer leite condensado diluído para a gaiola doméstica
Alto-falantes para ruído brancoQualquerN/APara tocar ruído branco
Ração padrãoQualquerN/APara restrição de dieta
papel de sedaQualquerN/APara limpeza
de lentes VerifocaisTracksysN/A5-50 mm, foco manual, íris manual
Bloco de mordida de madeiraQualquerN/APara aninhar
tubo de centrífuga de 50 mlFalconFalcon™ 352070Para misturar o leite condensado com água destilada (1:1)
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Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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