As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.
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Artigo de método
DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As nanomáquinas baseadas em DNAzyme (DNM) para a detecção de sequências de DNA e RNA (analitos) são estruturas multifuncionais feitas de oligonucleotídeos. Suas funções incluem ligação apertada do analito, reconhecimento altamente seletivo do analito, amplificação de sinal fluorescente por múltiplas clivagens catalíticas de um substrato repórter fluorogênico e atração de substrato fluorogênico para um aumento na resposta do sensor. As unidades funcionais são anexadas a um andaime de DNA comum para sua ação cooperativa. Os DNMs 10-23 de clivagem de RNA apresentam sensibilidade aprimorada em comparação com sondas de hibridização não catalíticas. A estabilidade do DNM e o aumento das chances de reconhecimento do substrato são fornecidos por um fragmento de DNA de fita dupla, um ladrilho. O DNM pode diferenciar dois analitos com uma única diferença de nucleotídeo em um RNA dobrado e um DNA de fita dupla e detectar analitos em concentrações ~ 1000 vezes menores do que outras sondas de hibridização livre de proteínas. Este artigo apresenta o conceito por trás do potencial diagnóstico da atividade da DNA-nanomáquina e apresenta uma visão geral do projeto, montagem e aplicação do DNM em ensaios de detecção de ácido nucleico.
Introdução
Um dos primeiros métodos para detecção de ácidos nucleicos é a ligação complementar de oligonucleotídeos seletivos às sequências de RNA ou DNA analisadas. Este método emprega fragmentos de ácido nucleico (sondas) que podem formar pares de bases Watson-Crick com um analito de DNA ou RNA direcionado1. O complexo é então diferenciado do analito e da sonda não ligada por uma variedade de técnicas. Certos métodos, como Northern blotting, hibridização in situ ou qPCR, são baseados no fenômeno da ligação complementar2. As sondas de hibridização mais comuns têm duas desvantagens signifi....
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Protocolo
1. Projeto de DNM
- Selecione uma região única dentro do genoma de interesse.
NOTA: Este trabalho usa uma região do genoma do vírus Epstein-Barr (EBV) nas posições 13972-14154 (OR652423.1). - Crie um conjunto de primers para a amplificação do fragmento selecionado, por exemplo, por meio da ferramenta Primer3 incorporada no Ugene26.
- Abra a ferramenta da web UNAFold27 (consulte Tabela de Materiais) e insira a região selecionada. Altere a temperatura de dobramento para 55 °C e as condições iônicas para 250 mM de íons mo....
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Resultados
O objetivo do primeiro experimento foi mostrar a montagem do DNM antes do fragmento sintético do analito. Todas as fitas DNM constituintes foram adicionadas ao tampão de reação e montadas no béquer. O complexo DNM montado foi avaliado quanto ao seu tamanho correto e homogeneidade por PAGE nativo. A PÁGINA nativa mostra o DNM montado com o analito na pista 1 e duas fitas DNM nas pistas 2 e 4. Se a nanomáquina de DNA não fosse montada, 2 ou 3 bandas separadas seriam visíveis em vez de uma única banda de baixa mobilidade (p.......
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Discussão
O projeto de máquinas de DNA é simples, mas requer alguma experiência no projeto de sondas de hibridização ou nanoestruturas funcionais de DNA. É apropriado manter o fragmento do analito o mais curto possível para diminuir o número de possíveis estruturas secundárias e simplificar a invasão do DNM à estrutura secundária. O conteúdo de CG deve ser preferencialmente inferior a 60% para evitar estruturas intramoleculares estáveis. A montagem bem-sucedida do DNM é alcançada em taxas de resfr.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Ekaterina V. Nikitina por gentilmente fornecer o gDNA do EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya e Maria S. Rubel agradecem ao Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa (Grant No FSER-2022-0009) e ao programa Prioridade 2030.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL | Biofil CFT011015 | ||
| 100 bp+ DNA Ladder | Evrogen | NL002 | |
| 100-1000 µ Pipeta L | Kirgen | KG-Pro1000 | |
| 10-100 µ Pipeta L | Kirgen | KG-Pro100 | |
| 1-10 µ Pipeta L | Kirgen | KG-Pro10 | |
| 20-200 µ Pipeta L | Kirgen | KG-Pro200 | |
| 2-20 µ L pipeta | Kirgen | KG-Pro20 | |
| 4x Gel Loading Dye | Evrogen | PB020 | |
| Acrilamida 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
| Persulfato de amônio | Carl Roth | 2809447 | |
| Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
| Bisacrilamida | Molekula | 22797959 | |
| Boric Acid | TechSnab | H-0202 | |
| ChemiDoc | BioRad | 12003153 | |
| Costar 96-Well Black Polystyrene Plate | Corning | COS3915 | |
| DinaMelt | RNA Institute | http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php | |
| EDTA | Amresco | Am-O105 | |
| Brometo de etídio | BioLabMix | EtBr-10 | |
| HEPES | Amresco Am-O485 | ||
| Cloreto de magnésio | AppliChem | 131396 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658001EDU | |
| pipeta 10 µ Ponteiras L | Kirgen | KG1111-L | |
| pipeta 1000 µ Ponteiras L | Kirgen | KG1636 | |
| pipeta 200 µ Pontas L | Kirgen | KG1212-L | |
| Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
| Cloreto de potássio | Carl Roth | 1782751 | |
| PowerPac Fonte de alimentação básica | BioRad | 1645050 | |
| RNAse/DNAse água livre | Invitrogen | 10977049 | |
| Filme de vedação para placas de PCR | Sovtech | P-502 | |
| Cloreto de sódio | Vekton | HCh (0,1) | |
| Leitor de microplacas multimodo Spark | Tecan | Spark- 10M | |
| T100 amplificador | BioRad | 10014822 | |
| TEMED | Molekula | 68604730 | |
| Tris(hidroximetil)aminometano | Amresco | Am-O497 | |
| UNAFold | Instituto | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
| Banho-maria | LOIP | LB-140 | |
| Oligos usados | |||
| Analyte: | Evrogen | ordem direta, purificação | |
| de dessalinização padrãoGAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC | |||
| Tile-Arm3: | Evrogen | pedido direto, purificação de dessalinização padrão | |
| CCG GGCTGCTGTGCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT | |||
| Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT | Evrogen | pedido direto, purificação de dessalinização padrão | |
| Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGCCTGACCA | Evrogen | pedido direto, purificação | |
| de dessalinização padrãosub-oligonucleotídeo F: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 | DNA-Syntez | ordem direta, purificação por HPLC |
Referências
- Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
- Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
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Reimpressões e permissões
