Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.
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Artigo de método
Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar
Neste artigo
Resumo
Resumo
A terapia gênica é uma tecnologia poderosa para fornecer novos genes a um paciente para o tratamento da doença, seja para introduzir um gene funcional, inativar um gene tóxico ou fornecer um gene cujo produto pode modular a biologia da doença. O método de entrega do vetor terapêutico pode assumir várias formas, desde a infusão intravenosa para administração sistêmica até a injeção direta no tecido-alvo. Para distúrbios neurodegenerativos, muitas vezes é desejável inclinar a transdução para o cérebro e/ou medula espinhal. A abordagem menos invasiva para atingir todo o sistema nervoso central envolve a injeção no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que a terapêutica atinja uma grande fração do sistema nervoso central. A abordagem mais segura para administrar um vetor no LCR é a injeção intratecal lombar, onde uma agulha é introduzida na cisterna lombar da medula espinhal. Essa técnica, também conhecida como punção lombar, tem sido amplamente utilizada em roedores neonatais e adultos e em modelos animais de grande porte. Embora a técnica seja semelhante entre espécies e estágios de desenvolvimento, diferenças sutis no tamanho, estrutura e elasticidade dos tecidos ao redor do espaço intratecal requerem acomodações na abordagem. Este artigo descreve um método para realizar punção lombar em ratos juvenis para fornecer um vetor adeno-associado do sorotipo 9. Aqui, 25-35 μL de vetor foram injetados na cisterna lombar, e um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para avaliar o perfil de transdução resultante de cada injeção. Os benefícios e desafios dessa abordagem são discutidos.
Introdução
A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outr....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC). Ratos Sprague-Dawley (28-30 dias de idade, massa na faixa de cerca de 90-135 g, machos e fêmeas) foram utilizados no presente estudo.
1. Preparação do vetor
- Descongele o vetor AAV9 (consulte a Tabela de Materiais) no gelo no início do procedimento.
- Centrifugue brevemente o tubo de microcentrífuga contendo o vetor em uma centrífuga de mesa para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo.
- Agite suavemente o tubo da microcentrífuga para garantir que a solução est....
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Resultados
Para determinar a precisão da técnica de injeção, um corante, azul de tripano, foi usado como substituto para a terapêutica. Esse corante se liga prontamente às proteínas, por isso geralmente permanece dentro da estrutura na qual foi injetado. Isso significa que o corante pode não prever com precisão a distribuição pós-injeção da terapêutica; é simplesmente usado para revelar a precisão da injeção. Quando introduzido com sucesso na cisterna lombar, o azul de tripano se liga à dura-máter, manchando o perímetro da medula e.......
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Discussão
Uma grande variedade de doenças afeta o SNC. Fornecer uma cópia funcional do gene relevante por meio de um vetor viral é uma estratégia de tratamento atraente para aqueles que são recessivos e monogênicos por natureza, como atrofia muscular espinhal. No entanto, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui a maioria dos vetores de terapia gênica administrados por via intravenosa11. Aqueles que podem cruzar a BHE, como AAV9, devem ser administrados em altas doses para superar a perda vetorial devido à .......
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Divulgações
O Dr. Donsante é um inventor de uma patente pendente sobre a administração de vetores AAV9 no LCR.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman, da UT Southwestern, por uma discussão produtiva sobre o desafio representado por ratos juvenis para injeção intratecal. Este trabalho foi parcialmente apoiado por financiamento da Jaguar Gene Therapy (para JLFK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 200 µ L pontas de pipeta filtradas | MidSci | PR-200RK-FL | Vírus de pipetagem |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vetor expressando |
| sutura absorvível GFP com agulha revestida Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Círculo de corte reverso Tamanho da agulha 4 - 0 Trançado | McKesson | J422H | Sutura |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Cirurgia |
| Almofadas Isotérmicas Braintree Scientific, 8'' x 8''Fisher | Scientific | 50-195-4664 | Mantém a temperatura corporal |
| Buprenorfina | McKesson | 1013922 | Analgésico |
| Buprenorfina-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Analgésico de liberação prolongada | |
| Cotonetes | Fisher Scientific | 19-365-409 | Remoção |
| de sangueDrapeado, Mouse, Plástico Transparente, 12" x 12", com Fenestração Adesiva | Steris | 1212CPSTF | Campo cirúrgico |
| Dumont #5 Forceps Cobertor | Ferramentas Fine Science | Tools 11251-20 | Almofada |
| de | Aquecimento Extra Longa CVS Health | ||
| Eppendorf Research plus, pipeta de 1 canal, variável, 20; 200 µ L | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Tesoura Fina | Ferramentas de Ciência Fina | 14059-11 | Tesoura cirúrgica curva |
| Ciência Fina | Friedman-Pearson Rongeurs | 16121-14 | Laminectomia |
| Porta-agulhas Halsey | Ferramentas de Ciência Fina | 12001-13 Chave de | agulha |
| Seringas de insulina com agulha ultrafina 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | Seringa | BD 328431 | |
| Isoflurano | McKesson | 803250 | Toalhetes anestésicos |
| de isopropanol | Fisher Scientific | 22-031-350 | Desinfecção da pele |
| Lidocaína, 1% | McKesson | 239935 | Anestesia local |
| Tubos de microcentrífuga: 1,5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Carregando a seringa |
| Iodopovidona | Fisher Scientific | 50-118-0481 Cabo de | bisturi para desinfecção da pele |
| - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Suporte de lâmina de bisturi |
| Sure-Seal Induction | anestesia | Braintree Scientific | EZ-17 |
| Lâmina cirúrgica Miltex Carbon Steel No. 11 Estéril Descartável Embalada Individualmente | McKesson | 4-111 | #11 Lâmina de bisturi |
| SYSTANE Pomada para os olhos NIGHTTIME | Alcon | Pomada para os olhos | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injeção |
Referências
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685(2023).
- Larkin, H.
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Reimpressões e permissões
