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Artigo de método

Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

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DOI:

10.3791/66470

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22 de março de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

Neste artigo

Resumo

Aqui, mostramos o protocolo de imagem para observar interações biomoleculares com derivação fototérmica fora da ressonância (PORT), onde otimizamos os parâmetros de imagem, identificamos os limites do sistema e investigamos possíveis melhorias na montagem do motivo de DNA de estrela de três pontos de imagem.

Resumo

A microscopia atômica de alta velocidade da força (HS-AFM) é uma técnica popular da imagem latente molecular para visualizar processos biológicos da único-molécula no tempo real devido a sua capacidade fazer a imagem sob circunstâncias fisiológicas em ambientes líquidos. O modo de derivação fototérmica fora de ressonância (PORT) usa um laser de acionamento para oscilar o cantilever de maneira controlada. Este acionamento direto do cantilever é eficaz na faixa de MHz. Combinado com a operação do loop de feedback na curva de força no domínio do tempo, em vez da amplitude ressonante, o PORT permite imagens de alta velocidade em até dez quadros por segundo com controle direto sobre as forças da amostra de ponta. O PORT demonstrou permitir imagens de dinâmicas de montagem delicadas e monitoramento preciso de padrões formados por biomoléculas. Até agora, a técnica tem sido usada para uma variedade de estudos dinâmicos in vitro , incluindo os padrões de montagem de motivos de estrelas de 3 pontos de DNA mostrados neste trabalho. Através de uma série de experiências, este protocolo identifica sistematicamente os ajustes ótimos dos parâmetros da imagem latente e os limites finais do sistema da imagem latente do AFM de HS-PORTO e como afetam processos biomoleculares do conjunto. Além disso, investiga potenciais efeitos térmicos indesejados induzidos pelo laser de acionamento na amostra e no líquido circundante, principalmente quando a varredura é limitada a pequenas áreas. Essas descobertas fornecem informações valiosas que impulsionarão o avanço da aplicação do modo PORT no estudo de sistemas biológicos complexos.

Introdução

A microscopia de força atômica de alta velocidade (HS-AFM) é uma técnica de imagem em rápido crescimento 1,2,3,4. Ele opera em velocidades que permitem aos pesquisadores visualizar interações biomoleculares em tempo real 5,6,7,8,9. O rosqueamento fototérmico fora da ressonância (PORT) é um modo de imagem fora da ressonância semelhante ao pico de força de derivação10,11, modo de força pulsada12,13 ou modo de salto14. No entanto, em vez de oscilar verticalmente o scanner, o PORT oscila verticalmente apenas o cantilever por meio de um laser de excitação focado no cantilever (geralmente próximo ao ponto de fixação). O cantilever deforma-se devido ao efeito bimorfo: um laser de excitação modulada por potência aquece periodicamente o cantilever revestido, que se dobra devido aos diferentes coeficientes de expansão térmica do cantilever e dos materiais de revestimento15. O aquecimento do cantilever e da amostra pode ser minimizado usando um laser de acionamento que é periodicamente desligado e ligado novamente durante cada ciclo de oscilação, em vez de usar um acionamento senoidal completo5.

O DNA tem sido usado para formar motivos biologicamente relevantes, estruturalmente interessantes e bioquimicamente úteis por vários anos 16,17,18,19,20. Além disso, as estruturas de DNA provaram ser ideais para caracterizar a qualidade da imagem de AFM21 e avaliar o efeito de ponta do AFM de alta velocidade22. As estrelas de três pontos de DNA de extremidade romba (3PS) tornaram-se práticas como um sistema modelo programável para investigar a organização supramolecular de moléculas estruturadas de forma semelhante em sistemas biológicos complexos19. Anteriormente, a automontagem de redes formadas por monômeros de DNA trimérico de extremidade romba era rastreada via HS-AFM23. Eventualmente, eles se organizam em grandes redes com ordem hexagonal. Aqui, a automontagem de estrelas de 3 pontos de DNA19 é fotografada com a técnica PORT em velocidades de varredura rápidas o suficiente para rastrear a automontagem e seus mecanismos de correção24, garantindo o mínimo de interrupção do processo ou danos à amostra. Como em qualquer modo HS-AFM, há uma compensação entre a qualidade de imagem alcançável, a velocidade de imagem e a perturbação indesejada da amostra. Ao escolher o compromisso certo, pode-se entender melhor os padrões de auto-organização dos conjuntos supramoleculares. Este protocolo usará, portanto, uma configuração semelhante com o DNA 3PS como um sistema modelo para otimizar os parâmetros específicos do PORT. Isso permitirá a operação em velocidades de imagem rápidas em tamanhos de varredura grandes o suficiente, minimizando os danos à amostra.

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Protocolo

1. Amostra e tampões

NOTA: O bloco de DNA usado neste estudo é o motivo de estrela de 3 pontas desenvolvido no laboratório Mao da Purdue University19,25. Todos os oligonucleotídeos usados neste estudo foram adquiridos da Integrated DNA Technologies, Inc. Reúna os materiais e reagentes necessários.

  1. Misture os DNAs de fita simples (ssDNAs) em uma proporção molar de 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM para S2 e 1,8 μM para S3) no tampão de recozimento (5 mM TRIS, 1 mM EDTA e 10 mM MgAc2). A concentração final do motivo de DNA deve ser de 0,6 μM (49 ng/μL com o peso molecular de 3PS sendo 82020,3 g/mol).
  2. Colocar a solução de ADN num recipiente resistente ao calor e aquecê-la a 80 °C. Arrefecer lentamente a solução de ADN de 80 °C a 20 °C durante um período de 4 h. Este processo de recozimento ajuda os oligonucleotídeos ssDNA a formar o motivo de DNA de fita dupla desejado.
  3. Para purificação, carregue a solução de DNA recozido em um gel de agarose a 3% para remover o excesso de ssDNAs e qualquer produto colateral indesejado. Execute o gel a 3% a 60 V por cerca de 2,5 h em um tampão de corrida contendo 0,5x Tris-Borato-EDTA (TBE) e 10 mM Mg (CH3COO)2.
  4. Identifique e localize a banda no gel que contém o motivo de DNA. Certifique-se de que a banda tenha migrado para uma posição específica com base em seu tamanho.
  5. Extirpar cuidadosamente a faixa que contém o motivo de DNA do gel. Extrair o motivo de ADN do fragmento de gel excisado, colocando-o numa coluna de centrifugação de extracção de gel e centrifugando a 3.000 x g e 4 °C durante 10 min.
  6. Substitua o tampão no motivo de DNA extraído pelo tampão de recozimento usando um concentrador centrífugo. Centrifugar a 3000 x g à temperatura ambiente (ou inferior) até que a solução concentrada seja inferior a 100 μl. Em seguida, adicione 300 μL de tampão de recozimento e repita esta etapa duas vezes para garantir que o tampão seja substituído.
  7. Dilua o motivo de DNA para 6 nM para fins de imagem. Use um espectrofotômetro ou outros métodos apropriados para determinar e ajustar com precisão a concentração. O motivo do DNA agora está pronto para a imagem.
    NOTA: Todos os tampões no protocolo são de pH 8.0. As informações de sequência para as três respectivas bandas são as seguintes:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Crescimento da ponta do modilhão

  1. Montagem do cantilever no suporte do cantilever SEM: Certifique-se de que os cantilevers estejam limpos e livres de contaminantes. Monte os cantilevers em um suporte adequado compatível com o sistema SEM. O design do suporte cantilever personalizado pode ser compartilhado mediante solicitação.
  2. Injeção de gás: Aqueça o gás precursor (por exemplo, fenantreno C14H10 precursor para pontas de carbono amorfa) a ser usado no sistema de injeção de gás para fazer crescer a nova ponta. Assim que o vácuo estiver abaixo de 10-5 mbar, purgue a linha de injeção de gás 10 vezes por 2 s para ter certeza de que nenhum ar residual indesejado está na linha do bico (isso deve ser feito com a válvula para a câmara da pistola fechada).
  3. Ajuste da posição da ponta: Use microscopia eletrônica de varredura (SEM) para localizar a extremidade do cantilever. Incline o suporte do modilhão a um ângulo (por exemplo, 11° neste caso) equivalente àquele que o modilhão apresentará quando colocado no suporte do modilhão do AFM no que diz respeito à superfície assim que a ponta crescida será perpendicular à superfície ao laçá-la. Ajuste a posição e o foco do SEM para obter uma visão clara da ponta do cantilever, onde uma ponta afiada de carbono será cultivada.
  4. Deposição induzida por feixe de elétrons focalizado (FEBID):
    1. Defina os parâmetros de deposição no software selecionado (neste caso, SmartFIB), como corrente do feixe (I) e tensão de aceleração (V), distância de trabalho (WD), ampliação, forma exposta, tempo de dose/deposição e tempo de permanência. Os seguintes parâmetros foram usados para crescer pontas de carbono amorfas, que apresentam boas propriedades mecânicas para imagens de AFM, levando a comprimentos em torno de 130 nm e raios na faixa de 2-4 nm:
      Selecione o ponto/ponto como forma exposta
      WD = 5 mm
      I = 78 pA e V = 5 kV
      Tempo de permanência = 1 μs
      Dose = 0,05 nC e tempo de deposição = 0,64 s
      Ampliação = 20000x
    2. Comece o processo de deposição para aumentar a ponta irradiando o feixe de elétrons em um ponto na ponta do cantilever enquanto injeta simultaneamente o gás precursor, fechando o gás quando a deposição é feita. Nesse caso, o software SmartFIB executa isso automaticamente após configurar a receita mencionada acima.
  5. Análise pós-crescimento: Realize imagens SEM pós-crescimento para examinar a ponta recém-crescida e garantir sua qualidade e características (raio e comprimento da ponta). Aguarde 1-2 minutos após o crescimento da ponta para ter certeza de que todo o gás precursor é bombeado para fora para evitar a redeposição durante a imagem de MEV. Remova o porta-amostras da câmara de SEM.
  6. Reciclagem de cantilever: Caso o sistema SEM também tenha um feixe de íons focalizado combinado (FIB) instalado, remova uma ponta danificada ou suja previamente crescida fresando-a com o sistema FIB usando baixas correntes FIB (por exemplo, 1 pA, para evitar danos ao cantilever). Execute a remoção da ponta fresando em uma forma de seção transversal, da extremidade da ponta à base, para evitar o colapso da ponta. Isso permitirá que um novo cresça.

3. Hardware HS-AFM

  1. A configuração de imagem é composta pelo cabeçote PORT personalizado5, 26 (Figura 1A), scanner de alta velocidade26 com um disco de amostra com mica na parte superior, controlador compatível27, amplificador de alta tensão com a alta largura de banda necessária para imagens de alta velocidade, base AFM e PC com o software necessário para controlar o equipamento mencionado anteriormente27.
    NOTA: Neste caso, estes são componentes de código aberto para os quais os planos podem ser obtidos no Laboratório de Bio e Nano-Instrumentação na EPFL27, 28. Também é possível participar de workshops sobre como construir o cabeçote e o controlador PORT29, bem como fazer o download e usar o software baseado em LabView.
  2. Coloque cuidadosamente um cantilever ultracurto (por exemplo, AC10DS ou equivalente) sob o clipe de mola no suporte do cantilever usando uma pinça. Certifique-se de que o chip cantilever esteja fixo e estável.
  3. Adicione 50 μL de líquido usando uma seringa através da porta esquerda de acesso ao fluido, conforme demonstrado na Figura 1B. Com o laser de excitação ainda desligado, alinhe o laser de leitura no cantilever usando os três botões dedicados na cabeça do AFM mostrados na Figura 1A. Faça isso observando a sombra do cantilever em um papel branco enquanto maximiza a soma (método da sombra). Em seguida, centralize o ponto do laser no fotodiodo usando os dois botões dedicados.
  4. Ligue e alinhe o laser de acionamento marcando a caixa Habilitação de excitação em Excitação VI, para que ele atue e oscile o cantilever. Mostre o sinal de excitação do cantilever e o sinal de deflexão do cantilever em um osciloscópio conectado. Se a oscilação de deflexão for muito baixa (ou inexistente), pode ser que o laser de acionamento esteja muito longe do cantilever. Nesse caso, use o método da sombra e desligue o laser de deflexão para facilitar o alinhamento. Maximize a amplitude de oscilação usando os botões de ajuste do laser de acionamento mostrados na Figura 1A.
  5. Para ajustar a amplitude de oscilação do cantilever em PORT, insira no controle correspondente do software a tensão pico a pico enviada ao circuito de controle de diodo laser (a partir de agora, entrada CA pico a pico) na Excitação VI. Para manter o diodo laser no regime de condução e, portanto, o laser, adicione uma tensão CC ao circuito de controle do diodo laser (a partir de agora, entrada de deslocamento CC), o que também é feito a partir de uma caixa de configuração no Excitation VI. Ambos também afetarão a potência do laser, que pode ser medida com um medidor de potência do laser e é usada para ajustar a amplitude de oscilação do cantilever.
  6. Determine a frequência máxima de excitação fototérmica que pode ser aplicada ao cantilever, que deve estar abaixo da frequência de ressonância do cantilever. Determine a frequência de ressonância por uma sintonia térmica ou uma varredura de frequência. Os cantilevers utilizados neste estudo (AC10DS), cuja frequência de ressonância em líquidos é de cerca de 400 kHz (1 MHz no ar)30, possuem uma região de curvatura quase-estática abaixo de 300kHz5. Assim, frequências PORT abaixo desse limite (em torno de 100-200 kHz) devem ser usadas.
  7. Ajuste os parâmetros de imagem e as configurações para a taxa de PORT e a taxa de varredura para os valores necessários em Excitation e Scan Vis, respectivamente (os parâmetros usados neste artigo são indicados nas descrições das figuras). Depois que os parâmetros de configuração e imagem estiverem configurados, execute os experimentos de imagem necessários para observar e rastrear as interações moleculares.
    NOTA: Como os cantilevers AC10DS não são mais vendidos, uma alternativa como Fastscan D ou BioLever31 pode precisar ser usada até que um equivalente esteja disponível.

4. Obtenção de curvas de interação adequadas

  1. Inicialmente, aproxime-se da superfície de amostra no modo de contato clicando em Iniciar no VI do controlador Z definido como Modo de contato.
    1. Neste modo, a ponta do AFM entra em contato direto com a amostra. Uma vez atingida a superfície, execute uma curva de força versus distância na Rampa VI para obter a calibração da sensibilidade à deflexão do cantilever.
    2. Além disso, estime a constante da mola do cantilever, seja a partir das especificações do fornecedor do cantilever (com menos precisão), obtidas com um interferômetro, ou por meio de uma calibração baseada em sintonia térmica após a calibração da sensibilidade à deflexão. Uma calibração precisa do cantilever é essencial para um controle preciso da força da ponta-amostra.
  2. Depois de retrair completamente o Z-piezo da superfície onde a ponta não pode alcançar a superfície clicando em Up no VI do controlador Z, mude para o modo PORT no VI do controlador Z e ligue o laser de excitação na caixa de seleção Excitation VI. Para começar, defina o modo PORT para operar na frequência desejada na Excitação VI, que, neste caso experimental, é de 100 kHz, usando um balanço AC10DS.
  3. Registar a oscilação sem consola perto mas sem tocar a superfície. Em seguida, ligue o Feedback no controlador Z em contato com a superfície para gravar e clique em Corrigir para obter a oscilação do cantilever quando o cantilever estiver intermitentemente em contato com a superfície, ambos em nanômetros. Subtraia a curva de oscilação livre da curva de contato intermitente para obter a curva de interação verdadeira, convertendo-as em pN usando a constante de mola cantilever (neste caso, 0,1 N/m).

5. Imagem de HS-AFM

  1. Preparar uma solução de Mg(CH3COO)2 a uma concentração de 10 mM. Usando uma seringa Hamilton, injete 50 μL da solução preparada de 10 mM Mg(CH3COO)2 no canal fluídico do porta-cantilever, criando uma gota de líquido que engloba o cantilever.
  2. Aproxime-se gradualmente do cantilever da superfície clicando em Start no Z Controller VI. Assim que a superfície for detectada, ligue o Feedback e encontre o pico da curva de interação nas Curvas de Força ORT VI. Encontre o ponto de ajuste de força mais baixo que permita o rastreamento adequado (abaixo de 300 pN para evitar danos a amostras biológicas frágeis).
  3. Defina o Tamanho de Varredura no VI de Varredura para 800 nm por 800 nm e a Taxa de Linha para 100 Hz. Varra a superfície clicando na seta Quadro (para baixo) no VI de Varredura para verificar a qualidade da superfície. Se alguma contaminação for detectada, resolva o problema limpando a superfície, o balanço e/ou o suporte do cantilever antes de prosseguir.
  4. Após a digitalização, retraia o cantilever da superfície clicando em Retirar no VI do controlador Z. Remova a solução tampão do orifício no suporte do cantilever com uma seringa Hamilton para evitar problemas de volume morto.
  5. Prepare uma solução diluída de DNA 3PS da parte 1 do protocolo. Injete 50 μL da solução diluída de DNA 3PS no canal dedicado do suporte do cantilever.
  6. Inicie o processo de imagem repetindo as etapas 5.2 a 5.3, digitalizando uma área de 800 nm por 800 nm a uma taxa de linha padrão de 100 Hz (256 linhas × 256 pixels). Após a varredura inicial, ajuste o tamanho e a velocidade da imagem no Scan VI para os valores especificados para aquisição adicional de dados.
  7. Mantenha o ponto de ajuste da força de entrada da interação ponta-amostra na caixa Z Controller VI Setpoint no nível mais baixo necessário para o rastreamento adequado (abaixo de 300 pN) durante todo o processo de imagem para minimizar os danos/distúrbios da amostra, a menos que especificado de outra forma. Repita esse processo para todas as áreas de amostra necessárias.

6. Processamento de imagem

  1. Configure o ambiente para executar o código de processamento em lote personalizado do Pygwy (Python para Gwyddion), garantindo que o Python e todas as bibliotecas necessárias. Mais informações podem ser encontradas no site da Gwyddion32 estão instalados corretamente no sistema. Isso garante que o código seja executado sem problemas e possa acessar as funcionalidades necessárias.
  2. Abra o código de processamento em lote Pygwy personalizado (fornecido mediante solicitação). Isso fornecerá acesso às ferramentas e funcionalidades necessárias para processamento e análise de imagens.
  3. Inicie o processamento da imagem executando a correção da linha mediana horizontal nas imagens. Esta etapa visa remover quaisquer irregularidades ou artefatos presentes nas linhas de varredura, garantindo que as etapas de processamento subsequentes sejam baseadas em dados precisos. Após a remoção do plano de fundo, aplique a correção de linha. Use a remoção de cicatrizes para aprimorar ainda mais as imagens, eliminando marcas indesejadas ou imperfeições causadas por fatores externos. Esta etapa melhora a aparência visual geral das imagens.
  4. Melhore a visibilidade e o contraste das imagens ajustando o mapa de altura de cores. Isso garante que os recursos de interesse sejam claramente visualizados e se destaquem nas imagens.
  5. Selecione as imagens processadas que precisam ser combinadas em um vídeo. Determine a taxa de quadros desejada para o vídeo. Nesse caso, defina-o como 7 quadros por segundo (fps).
  6. Calcule a duração de cada quadro. Use Fiji (ImageJ) para combinar as imagens processadas em um vídeo. Certifique-se de que a taxa de quadros e a duração do quadro estejam definidas corretamente.

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Resultados

Nesta investigação, o processo dinâmico do conjunto de motivos da ponto-estrela do ADN 3 em ilhas estáveis foi observado com sucesso utilizando as capacidades do AFM do HS-PORTO. Essa técnica nos permitiu capturar a montagem dessas estruturas em tempo real. Na Figura 2A, B, obtemos uma varredura de imagem nítida em taxas de linha de 100 Hz e 200 Hz, respectivamente, para taxa de PORT de 100 kHz (tamanho de varredura de 800 nm por 800 nm). Isso corresponde a 3,9 e 1,95 ciclos...

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Discussão

Ao obter imagens de amostras biológicas delicadas, os modos de imagem de rosqueamento fora da ressonância no AFM são particularmente úteis, pois podem controlar diretamente as forças de interação ponta-amostra10. Entre eles, o modo PORT se destaca pelas maiores taxas de oscilação que pode atingir, o que possibilita maiores taxas de varredura. Como o PORT aciona diretamente e apenas o cantilever com um laser, ele permite a excitação em frequências muito mais altas ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Os autores agradecem a Raphael Zingg pela ajuda na programação do script Python para processamento de séries de imagens. O GEF reconhece o financiamento do H2020 - Programa-Quadro de Investigação e Inovação da UE (2014-2020); ERC-2017-CdG; InCell; Número do projeto 773091. A VC reconhece que este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 754354. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça por meio da concessão 200021_182562.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Descontinuado 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Unidade de eletroforese
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xtermociclador para recozimento
Configuração personalizada de AFMLaboratório para Instrumentação Bio-Nano, Instituto de Bioengenharia Interfaculdade, Escola de Engenharia, Ecole Polytechnique Fé d & eacute; rale LausanneObtido através do Laboratório para Instrumentação Bio-Nano
EDTAITW ReagentsA5097Em buffer de recozimento
Medidor de Potência a LaserThorlabsPM100DDigital Handheld Optical  Console do medidor de energia e energia
Fonte de alimentação 3AP animada, MP-310Major ScienceMP-310 Fonte dealimentação de eletroforese
MgAc2ABCR GmbHAB544692Em buffer de recozimento
TBEThermo Scientific327330010Tampão de corrida para eletroforese
TRISBio-Rad1610719Em buffer de recozimento

Referências

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