Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

Resumo

Aqui, mostramos o protocolo de imagem para observar interações biomoleculares com derivação fototérmica fora da ressonância (PORT), onde otimizamos os parâmetros de imagem, identificamos os limites do sistema e investigamos possíveis melhorias na montagem do motivo de DNA de estrela de três pontos de imagem.

Resumo

A microscopia atômica de alta velocidade da força (HS-AFM) é uma técnica popular da imagem latente molecular para visualizar processos biológicos da único-molécula no tempo real devido a sua capacidade fazer a imagem sob circunstâncias fisiológicas em ambientes líquidos. O modo de derivação fototérmica fora de ressonância (PORT) usa um laser de acionamento para oscilar o cantilever de maneira controlada. Este acionamento direto do cantilever é eficaz na faixa de MHz. Combinado com a operação do loop de feedback na curva de força no domínio do tempo, em vez da amplitude ressonante, o PORT permite imagens de alta velocidade em até dez quadros por segundo com controle direto sobre as forças da amostra de ponta. O PORT demonstrou permitir imagens de dinâmicas de montagem delicadas e monitoramento preciso de padrões formados por biomoléculas. Até agora, a técnica tem sido usada para uma variedade de estudos dinâmicos in vitro , incluindo os padrões de montagem de motivos de estrelas de 3 pontos de DNA mostrados neste trabalho. Através de uma série de experiências, este protocolo identifica sistematicamente os ajustes ótimos dos parâmetros da imagem latente e os limites finais do sistema da imagem latente do AFM de HS-PORTO e como afetam processos biomoleculares do conjunto. Além disso, investiga potenciais efeitos térmicos indesejados induzidos pelo laser de acionamento na amostra e no líquido circundante, principalmente quando a varredura é limitada a pequenas áreas. Essas descobertas fornecem informações valiosas que impulsionarão o avanço da aplicação do modo PORT no estudo de sistemas biológicos complexos.

Introdução

A microscopia de força atômica de alta velocidade (HS-AFM) é uma técnica de imagem em rápido crescimento 1,2,3,4. Ele opera em velocidades que permitem aos pesquisadores visualizar interações biomoleculares em tempo real 5,6,7,8,9. O rosqueamento fototérmico fora da ressonância (PORT) é um modo de imagem fora da ressonância semelhante ao pico de força de derivação^10,11, modo de força pulsada^12,13 ou modo de salto¹⁴. No entanto, em vez de oscilar verticalmente o scanner, o PORT oscila verticalmente apenas o cantilever por meio de um laser de excitação focado no cantilever (geralmente próximo ao ponto de fixação). O cantilever deforma-se devido ao efeito bimorfo: um laser de excitação modulada por potência aquece periodicamente o cantilever revestido, que se dobra devido aos diferentes coeficientes de expansão térmica do cantilever e dos materiais de revestimento¹⁵. O aquecimento do cantilever e da amostra pode ser minimizado usando um laser de acionamento que é periodicamente desligado e ligado novamente durante cada ciclo de oscilação, em vez de usar um acionamento senoidal completo⁵.

O DNA tem sido usado para formar motivos biologicamente relevantes, estruturalmente interessantes e bioquimicamente úteis por vários anos 16,17,18,19,20. Além disso, as estruturas de DNA provaram ser ideais para caracterizar a qualidade da imagem de AFM²¹ e avaliar o efeito de ponta do AFM de alta velocidade²². As estrelas de três pontos de DNA de extremidade romba (3PS) tornaram-se práticas como um sistema modelo programável para investigar a organização supramolecular de moléculas estruturadas de forma semelhante em sistemas biológicos complexos¹⁹. Anteriormente, a automontagem de redes formadas por monômeros de DNA trimérico de extremidade romba era rastreada via HS-AFM²³. Eventualmente, eles se organizam em grandes redes com ordem hexagonal. Aqui, a automontagem de estrelas de 3 pontos de DNA¹⁹ é fotografada com a técnica PORT em velocidades de varredura rápidas o suficiente para rastrear a automontagem e seus mecanismos de correção²⁴, garantindo o mínimo de interrupção do processo ou danos à amostra. Como em qualquer modo HS-AFM, há uma compensação entre a qualidade de imagem alcançável, a velocidade de imagem e a perturbação indesejada da amostra. Ao escolher o compromisso certo, pode-se entender melhor os padrões de auto-organização dos conjuntos supramoleculares. Este protocolo usará, portanto, uma configuração semelhante com o DNA 3PS como um sistema modelo para otimizar os parâmetros específicos do PORT. Isso permitirá a operação em velocidades de imagem rápidas em tamanhos de varredura grandes o suficiente, minimizando os danos à amostra.

Protocolo

1. Amostra e tampões

NOTA: O bloco de DNA usado neste estudo é o motivo de estrela de 3 pontas desenvolvido no laboratório Mao da Purdue University^19,25. Todos os oligonucleotídeos usados neste estudo foram adquiridos da Integrated DNA Technologies, Inc. Reúna os materiais e reagentes necessários.

1. Misture os DNAs de fita simples (ssDNAs) em uma proporção molar de 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM para S2 e 1,8 μM para S3) no tampão de recozimento (5 mM TRIS, 1 mM EDTA e 10 mM MgAc₂). A concentração final do motivo de DNA deve ser de 0,6 μM (49 ng/μL com o peso molecular de 3PS sendo 82020,3 g/mol).
2. Colocar a solução de ADN num recipiente resistente ao calor e aquecê-la a 80 °C. Arrefecer lentamente a solução de ADN de 80 °C a 20 °C durante um período de 4 h. Este processo de recozimento ajuda os oligonucleotídeos ssDNA a formar o motivo de DNA de fita dupla desejado.
3. Para purificação, carregue a solução de DNA recozido em um gel de agarose a 3% para remover o excesso de ssDNAs e qualquer produto colateral indesejado. Execute o gel a 3% a 60 V por cerca de 2,5 h em um tampão de corrida contendo 0,5x Tris-Borato-EDTA (TBE) e 10 mM Mg (CH₃COO)₂.
4. Identifique e localize a banda no gel que contém o motivo de DNA. Certifique-se de que a banda tenha migrado para uma posição específica com base em seu tamanho.
5. Extirpar cuidadosamente a faixa que contém o motivo de DNA do gel. Extrair o motivo de ADN do fragmento de gel excisado, colocando-o numa coluna de centrifugação de extracção de gel e centrifugando a 3.000 x g e 4 °C durante 10 min.
6. Substitua o tampão no motivo de DNA extraído pelo tampão de recozimento usando um concentrador centrífugo. Centrifugar a 3000 x g à temperatura ambiente (ou inferior) até que a solução concentrada seja inferior a 100 μl. Em seguida, adicione 300 μL de tampão de recozimento e repita esta etapa duas vezes para garantir que o tampão seja substituído.
7. Dilua o motivo de DNA para 6 nM para fins de imagem. Use um espectrofotômetro ou outros métodos apropriados para determinar e ajustar com precisão a concentração. O motivo do DNA agora está pronto para a imagem.
   NOTA: Todos os tampões no protocolo são de pH 8.0. As informações de sequência para as três respectivas bandas são as seguintes:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Crescimento da ponta do modilhão

1. Montagem do cantilever no suporte do cantilever SEM: Certifique-se de que os cantilevers estejam limpos e livres de contaminantes. Monte os cantilevers em um suporte adequado compatível com o sistema SEM. O design do suporte cantilever personalizado pode ser compartilhado mediante solicitação.
2. Injeção de gás: Aqueça o gás precursor (por exemplo, fenantreno C₁₄H₁₀ precursor para pontas de carbono amorfa) a ser usado no sistema de injeção de gás para fazer crescer a nova ponta. Assim que o vácuo estiver abaixo ^{de 10-5} mbar, purgue a linha de injeção de gás 10 vezes por 2 s para ter certeza de que nenhum ar residual indesejado está na linha do bico (isso deve ser feito com a válvula para a câmara da pistola fechada).
3. Ajuste da posição da ponta: Use microscopia eletrônica de varredura (SEM) para localizar a extremidade do cantilever. Incline o suporte do modilhão a um ângulo (por exemplo, 11° neste caso) equivalente àquele que o modilhão apresentará quando colocado no suporte do modilhão do AFM no que diz respeito à superfície assim que a ponta crescida será perpendicular à superfície ao laçá-la. Ajuste a posição e o foco do SEM para obter uma visão clara da ponta do cantilever, onde uma ponta afiada de carbono será cultivada.
4. Deposição induzida por feixe de elétrons focalizado (FEBID):
   1. Defina os parâmetros de deposição no software selecionado (neste caso, SmartFIB), como corrente do feixe (I) e tensão de aceleração (V), distância de trabalho (WD), ampliação, forma exposta, tempo de dose/deposição e tempo de permanência. Os seguintes parâmetros foram usados para crescer pontas de carbono amorfas, que apresentam boas propriedades mecânicas para imagens de AFM, levando a comprimentos em torno de 130 nm e raios na faixa de 2-4 nm:
      Selecione o ponto/ponto como forma exposta
      WD = 5 mm
      I = 78 pA e V = 5 kV
      Tempo de permanência = 1 μs
      Dose = 0,05 nC e tempo de deposição = 0,64 s
      Ampliação = 20000x
   2. Comece o processo de deposição para aumentar a ponta irradiando o feixe de elétrons em um ponto na ponta do cantilever enquanto injeta simultaneamente o gás precursor, fechando o gás quando a deposição é feita. Nesse caso, o software SmartFIB executa isso automaticamente após configurar a receita mencionada acima.
5. Análise pós-crescimento: Realize imagens SEM pós-crescimento para examinar a ponta recém-crescida e garantir sua qualidade e características (raio e comprimento da ponta). Aguarde 1-2 minutos após o crescimento da ponta para ter certeza de que todo o gás precursor é bombeado para fora para evitar a redeposição durante a imagem de MEV. Remova o porta-amostras da câmara de SEM.
6. Reciclagem de cantilever: Caso o sistema SEM também tenha um feixe de íons focalizado combinado (FIB) instalado, remova uma ponta danificada ou suja previamente crescida fresando-a com o sistema FIB usando baixas correntes FIB (por exemplo, 1 pA, para evitar danos ao cantilever). Execute a remoção da ponta fresando em uma forma de seção transversal, da extremidade da ponta à base, para evitar o colapso da ponta. Isso permitirá que um novo cresça.

3. Hardware HS-AFM

1. A configuração de imagem é composta pelo cabeçote PORT personalizado^{5, 26} (Figura 1A), scanner de alta velocidade²⁶ com um disco de amostra com mica na parte superior, controlador compatível²⁷, amplificador de alta tensão com a alta largura de banda necessária para imagens de alta velocidade, base AFM e PC com o software necessário para controlar o equipamento mencionado anteriormente²⁷.
   NOTA: Neste caso, estes são componentes de código aberto para os quais os planos podem ser obtidos no Laboratório de Bio e Nano-Instrumentação na EPFL^{27, 28}. Também é possível participar de workshops sobre como construir o cabeçote e o controlador PORT²⁹, bem como fazer o download e usar o software baseado em LabView.
2. Coloque cuidadosamente um cantilever ultracurto (por exemplo, AC10DS ou equivalente) sob o clipe de mola no suporte do cantilever usando uma pinça. Certifique-se de que o chip cantilever esteja fixo e estável.
3. Adicione 50 μL de líquido usando uma seringa através da porta esquerda de acesso ao fluido, conforme demonstrado na Figura 1B. Com o laser de excitação ainda desligado, alinhe o laser de leitura no cantilever usando os três botões dedicados na cabeça do AFM mostrados na Figura 1A. Faça isso observando a sombra do cantilever em um papel branco enquanto maximiza a soma (método da sombra). Em seguida, centralize o ponto do laser no fotodiodo usando os dois botões dedicados.
4. Ligue e alinhe o laser de acionamento marcando a caixa Habilitação de excitação em Excitação VI, para que ele atue e oscile o cantilever. Mostre o sinal de excitação do cantilever e o sinal de deflexão do cantilever em um osciloscópio conectado. Se a oscilação de deflexão for muito baixa (ou inexistente), pode ser que o laser de acionamento esteja muito longe do cantilever. Nesse caso, use o método da sombra e desligue o laser de deflexão para facilitar o alinhamento. Maximize a amplitude de oscilação usando os botões de ajuste do laser de acionamento mostrados na Figura 1A.
5. Para ajustar a amplitude de oscilação do cantilever em PORT, insira no controle correspondente do software a tensão pico a pico enviada ao circuito de controle de diodo laser (a partir de agora, entrada CA pico a pico) na Excitação VI. Para manter o diodo laser no regime de condução e, portanto, o laser, adicione uma tensão CC ao circuito de controle do diodo laser (a partir de agora, entrada de deslocamento CC), o que também é feito a partir de uma caixa de configuração no Excitation VI. Ambos também afetarão a potência do laser, que pode ser medida com um medidor de potência do laser e é usada para ajustar a amplitude de oscilação do cantilever.
6. Determine a frequência máxima de excitação fototérmica que pode ser aplicada ao cantilever, que deve estar abaixo da frequência de ressonância do cantilever. Determine a frequência de ressonância por uma sintonia térmica ou uma varredura de frequência. Os cantilevers utilizados neste estudo (AC10DS), cuja frequência de ressonância em líquidos é de cerca de 400 kHz (1 MHz no ar)³⁰, possuem uma região de curvatura quase-estática abaixo de 300^kHz5. Assim, frequências PORT abaixo desse limite (em torno de 100-200 kHz) devem ser usadas.
7. Ajuste os parâmetros de imagem e as configurações para a taxa de PORT e a taxa de varredura para os valores necessários em Excitation e Scan Vis, respectivamente (os parâmetros usados neste artigo são indicados nas descrições das figuras). Depois que os parâmetros de configuração e imagem estiverem configurados, execute os experimentos de imagem necessários para observar e rastrear as interações moleculares.
   NOTA: Como os cantilevers AC10DS não são mais vendidos, uma alternativa como Fastscan D ou BioLever³¹ pode precisar ser usada até que um equivalente esteja disponível.

4. Obtenção de curvas de interação adequadas

1. Inicialmente, aproxime-se da superfície de amostra no modo de contato clicando em Iniciar no VI do controlador Z definido como Modo de contato.
   1. Neste modo, a ponta do AFM entra em contato direto com a amostra. Uma vez atingida a superfície, execute uma curva de força versus distância na Rampa VI para obter a calibração da sensibilidade à deflexão do cantilever.
   2. Além disso, estime a constante da mola do cantilever, seja a partir das especificações do fornecedor do cantilever (com menos precisão), obtidas com um interferômetro, ou por meio de uma calibração baseada em sintonia térmica após a calibração da sensibilidade à deflexão. Uma calibração precisa do cantilever é essencial para um controle preciso da força da ponta-amostra.
2. Depois de retrair completamente o Z-piezo da superfície onde a ponta não pode alcançar a superfície clicando em Up no VI do controlador Z, mude para o modo PORT no VI do controlador Z e ligue o laser de excitação na caixa de seleção Excitation VI. Para começar, defina o modo PORT para operar na frequência desejada na Excitação VI, que, neste caso experimental, é de 100 kHz, usando um balanço AC10DS.
3. Registar a oscilação sem consola perto mas sem tocar a superfície. Em seguida, ligue o Feedback no controlador Z em contato com a superfície para gravar e clique em Corrigir para obter a oscilação do cantilever quando o cantilever estiver intermitentemente em contato com a superfície, ambos em nanômetros. Subtraia a curva de oscilação livre da curva de contato intermitente para obter a curva de interação verdadeira, convertendo-as em pN usando a constante de mola cantilever (neste caso, 0,1 N/m).

5. Imagem de HS-AFM

1. Preparar uma solução de Mg(CH₃COO)₂ a uma concentração de 10 mM. Usando uma seringa Hamilton, injete 50 μL da solução preparada de 10 mM Mg(CH₃COO)₂ no canal fluídico do porta-cantilever, criando uma gota de líquido que engloba o cantilever.
2. Aproxime-se gradualmente do cantilever da superfície clicando em Start no Z Controller VI. Assim que a superfície for detectada, ligue o Feedback e encontre o pico da curva de interação nas Curvas de Força ORT VI. Encontre o ponto de ajuste de força mais baixo que permita o rastreamento adequado (abaixo de 300 pN para evitar danos a amostras biológicas frágeis).
3. Defina o Tamanho de Varredura no VI de Varredura para 800 nm por 800 nm e a Taxa de Linha para 100 Hz. Varra a superfície clicando na seta Quadro (para baixo) no VI de Varredura para verificar a qualidade da superfície. Se alguma contaminação for detectada, resolva o problema limpando a superfície, o balanço e/ou o suporte do cantilever antes de prosseguir.
4. Após a digitalização, retraia o cantilever da superfície clicando em Retirar no VI do controlador Z. Remova a solução tampão do orifício no suporte do cantilever com uma seringa Hamilton para evitar problemas de volume morto.
5. Prepare uma solução diluída de DNA 3PS da parte 1 do protocolo. Injete 50 μL da solução diluída de DNA 3PS no canal dedicado do suporte do cantilever.
6. Inicie o processo de imagem repetindo as etapas 5.2 a 5.3, digitalizando uma área de 800 nm por 800 nm a uma taxa de linha padrão de 100 Hz (256 linhas × 256 pixels). Após a varredura inicial, ajuste o tamanho e a velocidade da imagem no Scan VI para os valores especificados para aquisição adicional de dados.
7. Mantenha o ponto de ajuste da força de entrada da interação ponta-amostra na caixa Z Controller VI Setpoint no nível mais baixo necessário para o rastreamento adequado (abaixo de 300 pN) durante todo o processo de imagem para minimizar os danos/distúrbios da amostra, a menos que especificado de outra forma. Repita esse processo para todas as áreas de amostra necessárias.

6. Processamento de imagem

1. Configure o ambiente para executar o código de processamento em lote personalizado do Pygwy (Python para Gwyddion), garantindo que o Python e todas as bibliotecas necessárias. Mais informações podem ser encontradas no site da Gwyddion³² estão instalados corretamente no sistema. Isso garante que o código seja executado sem problemas e possa acessar as funcionalidades necessárias.
2. Abra o código de processamento em lote Pygwy personalizado (fornecido mediante solicitação). Isso fornecerá acesso às ferramentas e funcionalidades necessárias para processamento e análise de imagens.
3. Inicie o processamento da imagem executando a correção da linha mediana horizontal nas imagens. Esta etapa visa remover quaisquer irregularidades ou artefatos presentes nas linhas de varredura, garantindo que as etapas de processamento subsequentes sejam baseadas em dados precisos. Após a remoção do plano de fundo, aplique a correção de linha. Use a remoção de cicatrizes para aprimorar ainda mais as imagens, eliminando marcas indesejadas ou imperfeições causadas por fatores externos. Esta etapa melhora a aparência visual geral das imagens.
4. Melhore a visibilidade e o contraste das imagens ajustando o mapa de altura de cores. Isso garante que os recursos de interesse sejam claramente visualizados e se destaquem nas imagens.
5. Selecione as imagens processadas que precisam ser combinadas em um vídeo. Determine a taxa de quadros desejada para o vídeo. Nesse caso, defina-o como 7 quadros por segundo (fps).
6. Calcule a duração de cada quadro. Use Fiji (ImageJ) para combinar as imagens processadas em um vídeo. Certifique-se de que a taxa de quadros e a duração do quadro estejam definidas corretamente.

Resultados

Nesta investigação, o processo dinâmico do conjunto de motivos da ponto-estrela do ADN 3 em ilhas estáveis foi observado com sucesso utilizando as capacidades do AFM do HS-PORTO. Essa técnica nos permitiu capturar a montagem dessas estruturas em tempo real. Na Figura 2A, B, obtemos uma varredura de imagem nítida em taxas de linha de 100 Hz e 200 Hz, respectivamente, para taxa de PORT de 100 kHz (tamanho de varredura de 800 nm por 800 nm). Isso corresponde a 3,9 e 1,95 ciclos de oscilação por pixel, respectivamente. No entanto, a geração de imagens em velocidades mais altas sem aumentos simultâneos na taxa de PORT que permitiriam um mínimo de um ciclo de oscilação por pixel reduzirá drasticamente a qualidade da imagem, como pode ser visto na Figura 2C (0,78 de um ciclo de oscilação por pixel). A velocidade de imagem é limitada pela taxa na qual o cantilever sonda a superfície com controle de força de amostra de ponta apropriado, uma vez que a taxa de mudança de topografia se torna muito rápida para rastrear na taxa de amostragem de superfície.

Além de definir uma taxa de PORT alta o suficiente, é importante que as curvas PORT contenham as informações necessárias para controlar as forças. Especialmente o arrasto hidrodinâmico e a baixa largura de banda de detecção podem obscurecer a força aplicada. A Figura 3 exibe a deflexão do cantilever em diferentes distâncias da superfície da amostra e as taxas de frequência de excitação usando uma média de 4096 curvas para reduzir o ruído. As curvas azuis na Figura 3A (para taxa de PORT de 100 kHz) e na Figura 3D (para taxa de PORT de 500 Hz) representam o movimento do cantilever quando o cantilever está longe da superfície e oscila livremente (sem tocar a superfície durante um ciclo de oscilação). As curvas vermelhas mostram a deflexão do cantilever quando o cantilever oscila próximo à superfície e entra em contato intermitente com a superfície, sondando a amostra. Para obter a curva de interação verdadeira e, portanto, a interação ponta-amostra, subtraímos a curva azul da curva vermelha para obter a Figura 3B,E, respectivamente. Um exemplo de uma curva de interação clara necessária para imagens não destrutivas de amostras biológicas é representado na Figura 3B. Essa configuração leva à boa qualidade de imagem mostrada na Figura 3C, onde a taxa de PORT é de 100 kHz. À medida que aumentamos a frequência de excitação perto da ressonância do cantilever, em algum momento, o controle de feedback se deteriora, mesmo quando o cantilever exibe oscilação de amplitude suficiente para se desprender da superfície após aumentar a potência do laser de excitação ( Figura 3E ). Se a frequência PORT estiver muito próxima da frequência de ressonância do cantilever, a ressonância do cantilever limita a resposta de tempo da dinâmica do cantilever. A flexão em balanço, portanto, não representa mais com precisão a interação ponta-amostra, e a curva de interação que obtemos é obscurecida. Isso leva a uma degradação da qualidade da imagem, conforme exibido na Figura 3F.

Uma curva de interação comprometida em frequências PORT mais altas também pode acontecer devido à eficiência de atuação reduzida em frequências mais altas³³, que atualmente é um dos fatores limitantes dos cantiléver AFM comerciais de alta velocidade. Essa diminuição eventualmente atinge um nível limite no roll-off, no qual a imagem adequada é prejudicada: a amplitude de oscilação pode ser insuficiente para se desprender da superfície e a ponta está sempre em contato, danificando as estruturas da amostra. Para neutralizar a diminuição na amplitude causada em taxas de PORT mais altas, exploramos um aumento na potência do laser. Usamos um cabeçote PORT que pode atingir potências de laser mais altas para observar melhor esse efeito. A potência do laser de excitação, que medimos com um medidor de potência, foi dividida em componentes CC e CA. A potência total é controlada ajustando no software a tensão pico a pico (entrada CA pico a pico) e a tensão CC (entrada de deslocamento CC) enviada ao circuito de controle do diodo laser. A Figura 4A exibe a amplitude de oscilação do balanço pico a pico resultante de um aumento da entrada CA pico a pico. Como esperado, a amplitude de oscilação se correlaciona bem com o valor de entrada CA. É importante observar que essas amplitudes pico a pico são maiores do que as normalmente usadas em imagens PORT. Ao obter imagens de amostras frágeis, a amplitude CA é da ordem de 10-30 nm. A Figura 4B exibe a amplitude de oscilação do cantilever pico a pico para entradas de deslocamento CC aumentadas. A amplitude de oscilação pico a pico permanece bastante constante na faixa de tensão de deslocamento CC. Atribuímos as pequenas variações a não linearidades na detecção. A Figura 4C mostra o aumento dos componentes de potência do laser CA e CC resultante do aumento da CA pico a pico. A Figura 4D mostra o aumento dos componentes de potência do laser CA e CC resultante do aumento do deslocamento de entrada CC.

Os efeitos do aumento da entrada CA pico a pico e da entrada de deslocamento CC foram testados separadamente para determinar os respectivos efeitos na potência total e na amplitude de oscilação. Um aumento na potência do laser faz com que a amostra seja interrompida, provavelmente por meio do aumento da temperatura, enquanto um aumento na amplitude de oscilação aumentará a força de impacto na amostra⁵. Aumentar exclusivamente a entrada CA pico a pico terá menos impacto no aumento total da potência do laser, conforme mostrado na Figura 4C, e aumentará predominantemente a amplitude de oscilação do cantilever (e consequentemente a força de impacto), conforme mostrado na Figura 4A. Aumentar a entrada de deslocamento CC terá um efeito maior no aumento da potência de saída do laser, conforme mostrado na Figura 4D, que aquece a amostra, mas terá um efeito insignificante na amplitude de deflexão, como visto na Figura 4B. Os resultados de imagem estão representados na Figura 4E,F. A Figura 4E mostra o DNA 3PS para a entrada CA pico a pico mais baixa (imagem à esquerda, circulada em azul) e a entrada CA pico a pico mais alta (imagem à direita, circulada em vermelho), o que resulta em danos à amostra presumivelmente por meio das forças mais altas. A Figura 4F exibe DNA 3PS para a entrada de deslocamento CC mais baixa (imagem da esquerda, circulada em azul) e entrada de deslocamento CC mais alta (imagem da direita, circulada em vermelho), onde as estruturas são danificadas.

Figura 1: A configuração do HS-AFM. (A) A cabeça PORT no scanner e na base do AFM, mostrando o (i) botão para ajustar o foco do laser de leitura no cantilever, (ii) botão para ajustar a posição do laser de leitura no cantilever, (iii) botão para ajustar a posição horizontal do laser no fotodiodo, (iv) botão para ajustar a posição vertical do laser no fotodiodo, e (v) botões para ajustar a posição do laser de acionamento fototérmico no cantilever. (B) Um close-up do cantilever na vista da seção transversal da cabeça com o estágio de amostra, onde (vi) é o clipe de mola segurando o cantilever. O canal para injeção de líquido está marcado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Amostra de DNA 3PS fotografada com AC10 a uma taxa PORT de 100 kHz em diferentes taxas de linha. (A) 100 Hz (3,9 ciclos de oscilação por pixel), (B) 200 Hz (1,95 ciclos de oscilação por pixel) e (C) 500 Hz (0,78 ciclos de oscilação por pixel). As imagens foram tiradas em pontos de ajuste de 350 pN ou menos. Barra de escala 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Deflexão do cantilever, curva de interação e qualidade de imagem nas taxas PORT de 100 KHz e 500 kHz. (A) Deflexão do cantilever (oscilação livre do cantilever próxima, mas sem tocar a superfície em azul, e a oscilação do cantilever quando o cantilever está intermitentemente em contato com a superfície em vermelho), (B) curva de interação e (C) respectiva qualidade de imagem para taxa de PORT de 100 kHz. (D) Deflexão do cantilever (oscilação livre do cantilever próxima, mas sem tocar a superfície em azul, e a oscilação do cantilever quando o cantilever está intermitentemente em contato com a superfície em vermelho), (E) curva de interação e (F) respectiva qualidade de imagem para taxa PORT de 500 kHz. As imagens foram tiradas a uma taxa de linha de 100 Hz. Barra de escala 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeito da tensão de entrada CA pico a picotensão de entrada de deslocamento DC. Efeito do aumento da tensão de entrada CA pico a pico (A) e (B) tensão de entrada deslocada CC na oscilação pico a pico do cantilever. Efeito do aumento (C) da tensão de entrada CA pico a pico e (D) da tensão de entrada de deslocamento CC na potência do laser CA e CC. Qualidade de imagem mínima (circulada em azul) e máxima (circulada em vermelho) (E) tensão de entrada CA pico a pico e (F) tensão de entrada de deslocamento CC. Ao aumentar a tensão de entrada CA pico a pico, a tensão de entrada de deslocamento CC foi mantida em 600 mV. Ao aumentar a tensão de entrada de deslocamento CC, a tensão de entrada CA pico a pico foi mantida em 200 mV. A integridade da amostra é comprometida para a configuração de alta potência. A taxa de PORT foi mantida em 100 kHz e a taxa de linha em 100 Hz. Barra de escala de 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Ao obter imagens de amostras biológicas delicadas, os modos de imagem de rosqueamento fora da ressonância no AFM são particularmente úteis, pois podem controlar diretamente as forças de interação ponta-amostra¹⁰. Entre eles, o modo PORT se destaca pelas maiores taxas de oscilação que pode atingir, o que possibilita maiores taxas de varredura. Como o PORT aciona diretamente e apenas o cantilever com um laser, ele permite a excitação em frequências muito mais altas do que os modos convencionais de derivação fora da ressonância, principalmente ao usar cantilevers ultracurtos com altas frequências ressonantes⁵. No entanto, ao usar o PORT para HS-AFM, deve-se ter cuidado com os parâmetros de imagem para obter uma boa qualidade de imagem.

Conforme ilustrado na Figura 2, aumentar as taxas de varredura sem aumentar simultaneamente as taxas de PORT levará a imagens de baixa qualidade. Primeiro, as taxas de PORT que resultam em menos de um ciclo de oscilação por pixel reduzirão drasticamente a qualidade da imagem. A velocidade de imagem é inerentemente limitada pela taxa na qual o cantilever sonda a superfície com controle de força de amostra de ponta apropriado. No PORT, o controle de feedback atua discretamente no final de cada ciclo de oscilação³⁴. Essa taxa de amostragem limitada induz um atraso puro no ciclo de feedback, limitando assim a largura de banda de feedback alcançável. Se a taxa de mudança de topografia se tornar muito rápida para rastrear na taxa de amostragem PORT, a topografia não poderá mais ser detectada ou rastreada com precisão pelo loop de feedback. A taxa de PORT, portanto, precisa ser aumentada para resolver fielmente a amostra em velocidades de superfície mais altas. No entanto, a frequência de ressonância do cantilever limita intrinsecamente a taxa máxima de PORT que podemos usar. Se a taxa PORT estiver próxima da frequência de ressonância do cantilever, a deflexão medida pelo método da alavanca óptica não representa mais fielmente as forças da ponta da amostra. Para obter uma curva apropriada da interação da ponta-amostra, a largura de banda mecânica do modilhão e a largura de banda elétrica do sistema do AFM devem ser grandes bastante detectar componentes de Fourier da curva da deflexão que são diversas vezes aquele da freqüência do PORTO. Se qualquer uma dessas larguras de banda for muito baixa, a curva de interação não mostra mais o corte unilateral (Figura 3A), mas sim um comportamento senoidal (Figura 3D) que obscurece a interação real da amostra de ponta (Figura 3E). Isso leva a um controle de força deficiente na imagem (Figura 3F). Mesmo cantilevers menores exibindo alta frequência de ressonância, que possuem ao mesmo tempo baixas constantes de mola, são necessários para aumentar ainda mais a taxa de PORT. Tais altas taxas de PORTA e velocidades de varredura apresentam um desafio para a eletrônica AFM, exigindo um software cuidadoso e um design eletrônico que apresente as altas larguras de banda necessárias e estratégias otimizadas de processamento de sinal digital.

Uma das vantagens do PORTO comparado ao AFM de alta velocidade do modo de batida é que a velocidade de amostragem de superfície pode ser ajustada. No AFM de batida do modo, a taxa de amostragem de superfície é dada pela frequência da ressonância do cantilever. Ao operar em PORT bem abaixo da frequência de ressonância cantilever, assumimos que cada amostragem de superfície fornece um ponto de dados válido. Como tal, a largura de banda de detecção de PORT é dada pela frequência de Nyquist na metade da taxa de PORT. No caso do modo de derivação, a largura de banda de detecção é dada por f₀/2Q³⁵. Com os últimos desenvolvimentos em PORT, podemos aumentar gradualmente a taxa de PORT até a frequência de ressonância. Nessa situação, o PORT e o modo de derivação tornam-se quase idênticos porque, nessas frequências, o PORT não pode detectar com precisão a interação da amostra em balanço com a ponta, conforme mostrado na Figura 3E. Ao operar na frequência de ressonância, a maior amplitude de oscilação do PORT em comparação com o modo de derivação torna-se uma desvantagem. O objetivo de aumentar a taxa de imagem PORT, portanto, continua sendo aumentar a frequência de ressonância do cantilever para manter a operação com a taxa PORT muito abaixo da frequência de ressonância.

À medida que aumentamos a taxa de PORT para permitir taxas de varredura mais rápidas, enfrentaremos outro problema inerente à excitação fototérmica em balanço: em frequências mais altas, a amplitude de oscilação diminui devido a uma diminuição na eficiência da excitação fototérmica, eventualmente a ponto de precisarmos aumentar a potência do laser, resultando no aumento da temperatura da amostra. O aumento da taxa de PORT sobrecarregará o balanceamento da potência do laser e da amplitude de oscilação, uma vez que uma potência de excitação mais alta é necessária para compensar uma eficiência de atuação reduzida que leva a danos à amostra. Em níveis mais altos de potência do laser, não podíamos mais observar a amostra, apesar de usar o ponto de ajuste de força mais baixo possível (painéis à direita nas Figuras 4E, F). Precisamos ter cuidado com a forma como aumentaremos a amplitude de oscilação do cantilever e aumentaremos a potência do laser. Existem dois parâmetros que podemos ajustar para aumentar a potência do laser. Primeiro, a entrada CA pico a pico que controla o sinal senoidal enviado ao diodo laser para variar senoidalmente a intensidade de potência do laser fornecida. Em segundo lugar, a tensão de entrada de deslocamento CC que mantém o diodo laser no regime de condução e, portanto, no laser. Um aumento do primeiro deve ser combinado com um aumento do segundo, uma vez que um aumento na amplitude do sinal CA enviado ao laser requer um aumento da tensão CC para evitar cruzar o limiar do laser. No entanto, apenas a entrada CA pico a pico influencia a amplitude de oscilação do cantilever, conforme exibido na Figura 4A. As tensões CC não levam a variações nas amplitudes de oscilação (Figura 4B). Assim, se quisermos atuação senoidal, precisamos definir a tensão CC para a tensão mínima que permite que o laser de diodo esteja no regime de laser. Alternativamente, podemos minimizar o aquecimento desligando e ligando periodicamente o diodo laser durante cada ciclo de oscilação, em vez de usar um acionamento senoidal completo⁵. A oscilação de temperatura necessária para acionar o cantilever na excitação fototérmica pode ser alcançada de forma mais eficiente desligando o laser durante uma parte do ciclo, o que diminui a temperatura do cantilever e, portanto, leva à flexão do cantilever. Isso minimizará a energia fornecida ao cantilever e à amostra e, assim, diminuirá a temperatura total nos arredores, mitigando os danos causados pelo calor da amostra.

Neste estudo, mostramos os limites dos parâmetros de imagem no HS-PORT que evitam danos à amostra de calor e controle adequado de feedback. Compreender esses limites ajudará a fazer o melhor uso do estado atual do método PORT AFM, permitindo um melhor controle sobre a interação ponta-amostra e ajudando a preservar o estado nativo dos motivos de DNA nessas medições. Graças às altas taxas de varredura alcançadas combinadas com um bom controle de feedback, o PORT nos permitiu obter imagens claras e detalhadas do DNA 3PS e suas interações ^7,8,36. Com a possibilidade de maior velocidade de imagem e controle direto da força da ponta da amostra²³, podemos rastrear o crescimento e a reorganização dos conjuntos biomoleculares com mais precisão e observar a dinâmica detalhada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Descontinuado
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Unidade de eletroforese
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	termociclador para recozimento
Configuração personalizada de AFM	Laboratório para Instrumentação Bio-Nano, Instituto de Bioengenharia Interfaculdade, Escola de Engenharia, Ecole Polytechnique Fé d & eacute; rale Lausanne		Obtido através do Laboratório para Instrumentação Bio-Nano
EDTA	ITW Reagents	A5097	Em buffer de recozimento
Medidor de Potência a Laser	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical  Console do medidor de energia e energia
Fonte de alimentação 3AP animada, MP-310	Major Science	MP-310 Fonte de	alimentação de eletroforese
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	Em buffer de recozimento
TBE	Thermo Scientific	327330010	Tampão de corrida para eletroforese
TRIS	Bio-Rad	1610719	Em buffer de recozimento