Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Summary

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Abstract

Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.

Introduction

Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos¹. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)². Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.

Uma maneira comum de distinguir especificamente os processos celulares é por meio da manipulação genética. No entanto, as ferramentas disponíveis para estudos genéticos de A. baumannii são limitadas e, para confundir ainda mais o desenho experimental, isolados clínicos frequentemente são resistentes aos antibióticos rotineiramente usados para seleção em manipulações genéticas³. Um segundo obstáculo encontrado ao estudar especificamente bombas de efluxo é que elas são estritamente reguladas - muitas vezes por fatores desconhecidos - tornando difícil isolar com precisão e atribuir função a uma única bomba⁴. Vendo essa necessidade de expandir a caixa de ferramentas de pesquisa, desenvolvemos um sistema de expressão induzível baseado em mini-Tn7, de inserção de cópia única, que incorpora um Flp recombinase target (FRT), que permite a remoção do marcador de seleção ^5,6,7 (Figura 1). Criado primeiramente para Pseudomonas ^8,9,10, este elegante sistema de clonagem e expressão foi usado para gerar complementos de bomba de efluxo de cópia única em uma cepa deficiente em bomba de efluxo RND de A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: doravante referida como A. baumannii AB258) que geramos¹¹. Sendo capaz de estudar uma bomba de efluxo de cada vez e não sobrecarregar as células bacterianas com alta expressão de cópia (como geralmente visto com sistemas de expressão baseados em plasmídeos), pode-se aprender melhor sobre os aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de efluxo com interferência mínima e complicações reduzidas.

Este artigo descreve como usar o sistema mini-Tn7 para complementar um gene excluído de interesse, a bomba de efluxo de RND adeIJK, no cromossomo de A. baumannii AB258 através de uma série de etapas não complicadas realizadas ao longo de 9 dias⁷. O primeiro conjunto de etapas reintroduz os genes deletados da bomba de efluxo clonados no plasmídeo de inserção baseado em mini-Tn7 (Figura 2A) no único sítio de inserção attTn7 a jusante do gene glmS bem conservado (Figura 3A). Esse processo é facilitado por um plasmídeo auxiliar não replicativo (Figura 2B) que codifica os genes de transposase necessários para a inserção impulsionada por Tn7. O segundo conjunto de etapas utiliza um plasmídeo de excisão (Figura 2C) para a remoção mediada pela recombinase de Flp do gene da gentamicina flanqueado por sítios de TAF (Figura 3B) para criar uma cepa não marcada. Embora esse sistema seja usado para elucidar os papéis essenciais e possíveis inibidores das bombas de efluxo de RND com relação à resistência a antibióticos, ele pode ser usado para investigar qualquer gene de interesse.

Protocol

1. Preparação experimental

1. Purificar o plasmídeo pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plasmídeo de inserção, Figura 2A) com o gene de interesse.
   NOTA: Aqui, o gene de interesse é adeIJK. A concentração final do plasmídeo deve ser de ≥100 ng/μL.
2. Purificar o plasmídeo auxiliar (pTNS2)⁹ e o plasmídeo de excisão (pFLP2^ab)⁶ (Figura 2B,C, respectivamente), idealmente para uma concentração final de DNA plasmidial de ≥100 ng/μL.
3. Preparar 50 mL de água ultrapura estéril e 25 mL de caldo LB estéril (Lennox) (ver Tabela de Materiais).
4. Preparar um mínimo de 10 placas de ágar LB, cada uma com os seguintes aditivos: simples (sem aditivos), gentamicina (Gm) a 50 μg/ml, carbenicilina (Cb) a 200 μg/ml (para selecção através do gene de resistência à ampicilina) e sacarose a 5% (ver Tabela de Materiais).
5. Esticar a cepa a ser usada para inserção em ágar LB e incubar a 37 °C por 16-18 h. Aqui, A. baumannii AB258 é usado.
   NOTA: Este protocolo deve ser realizado em um ambiente estéril, tanto quanto possível, usando um queimador de Bunsen na bancada ou um armário de segurança biológica. Todos os consumíveis (pontas de pipeta, laços de inoculação, tubos de microfuga, etc.) precisam ser estéreis.

2. Preparação da cultura

1. Inocular uma única colônia de A. baumannii AB258 em 4 mL de caldo LB em um tubo de cultura estéril de 13 mL usando uma alça de inoculação estéril ou bastão de inoculação de madeira estéril.
   NOTA: Uma única cultura de 4 mL é usada para uma amostra e um controle. Aumentar o número de culturas em função do número de amostras necessárias.
2. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação (250 rpm).
3. Coloque um frasco de água destilada estéril (25-50 ml) a 4 °C durante a noite para utilização no passo 3.

3. Preparação de células eletrocompetentes

1. Colocar todos os tubos de microfuga estéreis de 1,5 mL (dois por cultura) e cubetas de eletroporação estéreis (dois por cultura) no gelo (ver Tabela de Materiais). Mantenha as amostras no gelo o máximo possível durante todo o procedimento.
2. Coloque o frasco de água estéril que foi armazenado a 4 °C sobre gelo.
3. Transfira 1,5 mL da cultura bacteriana noturna para um dos tubos de microfuge de 1,5 mL.
4. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min para pellet as células.
   NOTA: A centrifugação seria idealmente realizada a 4 °C, mas a centrifugação à temperatura ambiente é aceitável e não prejudicial.
5. Usando uma pipeta de 1 mL, remova todo o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
6. Adicione mais 1,5 mL de cultura bacteriana no mesmo tubo de microfuga. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min e, em seguida, remover todo o sobrenadante.
7. Repetir o passo 3,6 uma última vez com o 1 mL restante de cultura.
8. Adicione 1 mL de água estéril gelada ao pellet de célula e ressuspenda com pipetagem suave até que o pellet não fique mais no fundo do tubo de microfuga.
9. Centrifugar as células ressuspensas a 13.000 x g por 2 min.
10. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL. Não despeje o sobrenadante, especialmente nas etapas de lavagem subsequentes, quando as células tendem a formar pellets menos compactos.
11. Repita esta etapa de lavagem com água estéril gelada, passos 3.8 para passo 3.10, mais duas vezes.
12. Ressuspenda suavemente o pellet de célula final em 200 μL de água estéril gelada.
13. Transferir 100 μL da suspensão celular final para o segundo tubo de microfuga gelado de 1,5 mL. Esta segunda alíquota se tornará o controle negativo para eletroporação. Mantenha as amostras de células no gelo.

4. Eletroporação

1. Pré-aquecer 1 mL de caldo LB e uma placa de ágar LB + Gm⁵⁰ (preparada na etapa 1.4) para cada amostra e controle em uma estufa estática regulada para 37 °C.
2. Em um volume combinado de 5 μL ou menos, adicione 100-200 ng cada um dos plasmídeos auxiliares pTNS2 e o plasmídeo de inserção pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a uma alíquota de células eletrocompetentes.
3. Misture com batidas suaves na ponta dos dedos para garantir a mistura completa dos plasmídeos com as células eletrocompetentes sem introduzir bolhas.
4. Adicione um volume equivalente de água destilada estéril na alíquota da célula de controle negativo e misture delicadamente como acima.
5. Incubar as amostras no gelo por 20 min.
6. Transfira toda a amostra de células para uma cubeta de eletroporação gelada e, em seguida, coloque a cubeta de volta no gelo. Repita para a amostra de célula de controle negativa.
7. Eletroporar a amostra celular.
   1. Ligue o eletroporador e regule-o para 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (consulte Tabela de Materiais).
   2. Limpe a superfície da cubeta com um tecido macio para remover qualquer gelo ou umidade aderente.
   3. Insira a cubeta no eletroporator e dê o choque elétrico.
   4. Adicione imediatamente 0,9 mL de caldo LB pré-aquecido às células da cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar as células com o meio.
   5. Transfira toda a suspensão celular para um novo tubo de microfuga de 1,5 mL (temperatura ambiente).
   6. Verifique o valor da constante de tempo no eletroporador; Para melhores resultados, esse valor deve estar entre 4 e 6.
8. Repetir o procedimento de electroporação (passos 4.7.1 a passo 4.7.6) para a amostra de células de controlo negativas.
9. Incubar as amostras electroporadas a 37 °C durante 1 h a 250 rpm para permitir a recuperação celular.
10. Usando um espalhador de inoculação, espalhe 100 μL de cada amostra de célula eletroporada em uma placa de ágar LB + Gm⁵⁰ pré-aquecida.
    1. Centrifugar as amostras restantes a 13.000 x g por 2 min para peletizar as células.
    2. Após a remoção de todo o sobrenadante com pipeta, ressuspenda as células em 100 μL de caldo LB.
    3. Espalhe cada amostra inteira em placas individuais de ágar LB + Gm⁵⁰ pré-aquecidas.
       NOTA: A eficiência da eletroporação pode ser dependente da deformação. Ao eletroporar uma cepa pela primeira vez, pode ser informativo plaquear diferentes volumes, ou mesmo diluições, da amostra de eletroporação para garantir que as placas resultantes tenham colônias isoladas.
11. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.

5. Seleção de colônias transformadas para triagem baseada em PCR

1. Verifique as placas de eletroporação. O controle negativo não deve ter colônias; a amostra deve ter colônias distintas.
   NOTA: As placas com colónias, nesta etapa e em todas as etapas subsequentes em que são produzidas placas de ágar com colónias ou remendos, podem ser armazenadas a 4 °C até 3 dias antes de prosseguir.
2. Usando palitos estéreis, pegue até 10 colônias únicas das placas de ágar LB + Gm⁵⁰ e remende-as em uma placa de ágar LB + Gm⁵⁰ fresca.
3. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.

6. Verificação da inserção cromossômica por PCR de colônias

1. Remova as placas de ágar LB + Gm⁵⁰ contendo as colônias remendadas da incubadora.
2. Usando um palito estéril ou ponta de pipeta estéril, remova uma pequena porção (aproximadamente do tamanho de uma colônia grande) de um adesivo em 20 μL de água destilada estéril em um tubo de PCR de 0,2 mL; misture bem. A amostra de água deve ficar visivelmente turva à medida que as células são liberadas do palito. Prepare qualquer número de amostras que precisem ser examinadas, mas 6 devem ser suficientes.
3. Incubar o tubo de PCR contendo a suspensão bacteriana a 100 °C durante 5-10 min.
4. Usando uma minicentrífuga (ver Tabela de Materiais), gire a amostra na velocidade máxima fixa por 2 min para pellet de detritos celulares.
5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR de 0,2 mL e coloque-o no gelo. Esta amostra contém o DNA do molde para a reação de PCR.
   NOTA: Este modelo de DNA pode ser armazenado a -20 °C antes de prosseguir com a PCR.
6. Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New primer para frente, 0,18 μM Tn7R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Prepare um controle sem modelo (NTC), incluindo todos, exceto o DNA do modelo (consulte Tabela de Materiais).
7. Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 49 °C por 30 s e 72 °C por 30 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.
8. Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 2% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 382 pb. O NTC não deve ter bandas.
9. Identificar as amostras que produziram o produto PCR esperado. Preparar uma placa de estria em placas de ágar LB + Gm⁵⁰ a partir de qualquer um dos adesivos positivos para PCR; incubar a 37 °C durante 16-18 h. O objetivo é gerar uma placa com colônias únicas para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa marcada e como ponto de partida para a criação de uma cepa não marcada (descrita abaixo).

7. Remoção do marcador Gm^R usando pFLP2^ab

1. Siga o procedimento mencionado na etapa 2: Preparação da cultura. A amostra utilizada para o preparo da cultura noturna é uma única colônia a partir das placas de ágar LB + Gm⁵⁰ preparadas para gerar colônias discretas na etapa 6.9.
2. Siga o procedimento mencionado na etapa 3: Preparação de células eletrocompetentes. Preparar as células da cultura noturna para eletroporação.
3. Siga o procedimento mencionado no passo 4: Eletroporação. Aqui, o plasmídeo a ser introduzido nas células é o pFLP2^ab (100-200 ng), que removerá o gene de resistência à gentamicina, flanqueando o gene cromossomicamente inserido de interesse.
4. Após a recuperação das células durante 1 h (passo 4.9), espalhar 100 μL da amostra celular electroporada numa placa de ágar LB + Cb²⁰⁰ pré-aquecida (preparada no passo 1.4). Essa pressão seletiva garante que apenas as células que abrigam o plasmídeo de excisão^ab pFLP2 cresçam.
5. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.
6. Verifique a placa para colônias. A placa de controle negativo não deve ter colônias; a placa de amostra de ágar LB + Cb²⁰⁰ deve ter colônias distintas.
7. Usando palitos estéreis, remende até 20 colônias isoladas em uma placa de ágar LB + Cb²⁰⁰ e uma placa de ágar LB + Gm⁵⁰ .
8. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
9. Verifique se há remendos nas placas. Clones que crescem na placa de ágar LB + Cb²⁰⁰ , mas não na placa de ágar LB + Gm⁵⁰ , tiveram o gene de resistência à gentamicina removido da inserção original.
10. Selecionar as manchas resistentes à carbenicilina e suscetíveis à gentamicina para serem usadas em placas individuais de ágar LB suplementadas com 5% (p/v) de sacarose, o que força a expulsão do plasmídeo^ab pFLP2 da bactéria. Escolha até 10 colônias.
11. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
12. Verifique as placas para colônias.
13. Como confirmação final da perda de pFLP2^ab plasmidial, o patch cruzado 4-6 isolou colônias das placas de sacarose a 5% em uma placa de ágar LB + Cb²⁰⁰ e uma placa de ágar LB.
14. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
15. Escolha um clone que esteja crescendo na placa de ágar LB, e que seja sensível à carbenicilina para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa não marcada.
    1. A verificação genética da cepa não marcada pode ser realizada com PCR de colônia (passo 6: Verificando a inserção cromossômica por PCR de colônia) usando os primers que têm como alvo o gene de resistência à gentamicina.
    2. Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM Gm_F primer para frente, 0,18 μM Gm_R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Preparar um controle sem modelo (NTC) incluindo todos, exceto o DNA do modelo, e um controle positivo usando DNA da cepa marcada.
    3. Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 50 °C por 30 s e 72 °C por 40 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.
    4. Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 1% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 525 pb. O controle positivo deve ter uma única banda; as amostras e o NTC não devem ter bandas.

Results

O procedimento de inserção cromossômica leva apenas 2 h no total ao longo de 3 dias para ver um resultado-colônias crescendo em uma placa de ágar seletiva (Figura 1A-C). O número esperado de colônias na placa de transformação é dependente da deformação: pode-se ver 20-30 ou mesmo centenas de colônias, pois a inserção de Tn7 nos sítios attTn7 é específica e^eficiente9. O patch das colônias da placa de transformação em meios seletivos (Figura 4A) preserva a cepa transformada e fornece material de partida para a triagem da PCR das colônias (Figura 1E e Figura 4B). A triagem de colônias por PCR pode ser mantida a um mínimo - não mais do que 10 colônias devem ser processadas, e a maioria deve produzir um resultado positivo para inserção. O produto da PCR para os primers de triagem, ABglmS2_F_New e Tn7R (Tabela 1), é de 382 pb (Figura 4B raia 4); os controles negativos para a reação incluem A. baumannii selvagem ATCC 17978 (Figura 4B faixa 2), AB258 (Figura 4B faixa 3) e nenhum molde (Figura 4B faixa 5). As colônias positivas para PCR representam cepas complementadas e marcadas.

A remoção do gene de resistência à gentamicina (desmarcação) leva menos de 3 horas, abrangendo 6 dias, pois as células transformadas com o plasmídeo de excisão precisam ser escolhidas através de plaqueamento seletivo e, em seguida, o plasmídeo de excisão precisa ser curado da bactéria (Figura 1F). A excisão baseada na recombinação Flp-FRT é precisa e eficaz e deve resultar em ≥20 colônias na placa de transformação. As colônias que são cruzadas com carbenicillin (selecionando para resistência β-lactâmica conferida pelo plasmídeo de excisão) e gentamicina (procurando perda de resistência à gentamicina) devem ser todas resistentes à carbenicilina e sensíveis à gentamicina, respectivamente. O plasmídeo de excisão é forçado para fora da bactéria pelo crescimento em placas de ágar sacarose a 5%. O crescimento em sacarose força as células a eliminar o pFLP2^ab, pois o gene sacB no plasmídeo promove a conversão da sacarose em levans, um polissacarídeo tóxico para as bactérias^12,13. Todas as colônias que crescem em meios de sacarose a 5% devem então crescer apenas em placas de ágar LB simples; Não deve haver crescimento em placas de ágar carbenicilina. Colônias crescendo nas placas de ágar LB simples representam cepas não marcadas. A confirmação da perda do marcador gentamicina pode ser obtida pela PCR das colônias utilizando os iniciadores Gm_F e Gm_R (Tabela 1 e Figura 5). Este par de primers produz um amplicon de 525 pb apenas no controle positivo (a deformação marcada inicialmente criada, Figura 5 raia 4); tipo selvagem ATCC 17978 (Figura 5 faixa 2), AB258 (Figura 5 faixa 3), qualquer colônia testada (Figura 5 faixa 5) e o controle sem molde (Figura 5 faixa 6) não devem mostrar amplificação.

Uma vez confirmada a cepa não marcada, o teste funcional pode ser iniciado com ensaios fenotípicos. Aqui, a primeira escolha óbvia é determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de uma variedade de antibióticos: a ciprofloxacina é um substrato conhecido de AdeIJK, a tetraciclina pode ser removida por AdeIJK (a principal bomba de efluxo é a AdeAB), e a canamicina tem um efeito relativamente menor sobre A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Usando o método de microdiluição em caldo de acordo com as diretrizes do CLSI¹⁵, a cepa não marcada complementada AB258::adeIJK foi desafiada com cada antibiótico na ausência e presença de 50 μM IPTG; A cepa selvagem ATCC 17978 e a cepa AB258 deficiente em efluxo RND foram incluídas como controles (Tabela 2). No geral, a tendência observada nos valores de CIM conta a história esperada - diminuição da suscetibilidade de AB258::adeIJK à ciprofloxacina e tetraciclina com expressão induzida da bomba de efluxo, verificando que a inserção de adeIJK foi bem sucedida.

Figura 1: Visão geral do procedimento. (A) É preparada uma cultura noturna da estirpe de A. baumannii a complementar. (B) As células da cultura noturna são lavadas com água 3 vezes por centrifugação e mantidas em gelo. (C) Os plasmídeos de liberação e auxiliares são adicionados às células e incubados em gelo por 20 min. A amostra é eletroporada, o meio LB é adicionado e as células são recuperadas por 1 h a 37 °C. Uma alíquota de 100 μL de células é espalhada em placas de ágar LB + Gm⁵⁰ e incubada a 37 °C durante a noite. (D) As colônias da placa de transformação são remendadas em uma placa de ágar LB + Gm⁵⁰ e cultivadas durante a noite a 37 °C. (E) Colônias corrigidas são preparadas para PCR para rastrear a presença de um produto de amplificação abrangendo o local de inserção cromossômica. A amplificação por PCR é visualizada por eletroforese em gel de agarose. Amostras positivas para PCR representam a inserção bem-sucedida do gene de interesse no cromossomo e a criação de uma cepa marcada. (F) Uma colônia positiva para gentamicina é preparada como em etapas (A-C), com eletroporação do plasmídeo^ab pLFP2 para remover o de gentamicina da inserção cromossômica. O plaqueamento seletivo em ágar LB + Cb²⁰⁰ confirma a captação do plasmídeo. A duplicação de manchas em placas de ágar LB + Cb²⁰⁰ e LB + Gm⁵⁰ revela colônias de Cb^R e Gm^S confirmando a perda do de gentamicina da inserção. O crescimento de colônias selecionadas de Cb^R em sacarose a 5% cura o plasmídeo pLFP2^ab das células. Colônias da placa de sacarose a 5% são remendadas em ágar LB + Cb²⁰⁰ e ágar LB para revelar colônias^desejadas de Cb S e Gm^S e confirmar a criação da cepa não marcada. Gm⁵⁰, gentamicina a 50 μg/mL; Cb²⁰⁰, carbenicilina a 200 μg/mL; ^R, resistente; ^S, sensível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Plasmídeos utilizados neste protocolo. Mapas gerais de plasmídios de (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plasmídeo de inserção), (B) pTNS2 (plasmídeo auxiliar) e (C) pFLP2^ab (plasmídeo de excisão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema de inserção e desmarcação. (A) Inserção. O único sítio de inserção de Tn7 no cromossomo A. baumannii está localizado a 24 pb do final do gene glmS2. A co-eletroporação do plasmídeo de inserção e do plasmídeo auxiliar permite a complementação do gene de interesse (gene inserido, roxo) juntamente com o restante do de inserção (sítios de TAF para excisão do marcador, amarelo; gene accC1 para resistência à gentamicina, verde; lacIq gene para expressão induzível, azul) no cromossomo. (B) Desmarcação. A eletroporação da cepa de inserção complementada e marcada com o plasmídeo de excisão^ab pFLP2 facilita a remoção do gene de resistência à gentamicina (accC1, verde) via recombinação Flp-FRT (sítios FRT, amarelo), criando uma cepa não marcada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Transformação, correção e confirmação de inserção por PCR de colônia. Resultado representativo de (A) crescimento de colônias de transformação após patching e (B) amplificação por PCR de colônias com primers ABglmS_F_New (cinza) e Tn7R (laranja) para confirmar a inserção cromossômica. Faixa 1: Escada de DNA de baixo peso molecular; Faixa 2: ATCC 179798; Faixa 3: AB258; Faixa 4: AB258:: adeIJK-LAC-Gm; Faixa 5: controle sem modelo. A faixa esperada de 382 pb é rotulada. Note-se que os primers específicos da gentamicina (Gm_F e Gm_R, verde) também poderiam ser usados para afirmar a inserção cromossômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Confirmação da perda do marcador pela PCR da colônia. Resultado representativo da amplificação da PCR de colônias com primers específicos para gentamicina (Gm_F e Gm_R) para confirmar a perda do marcador antibiótico via excisão baseada em pFLP^ab. Faixa 1: escada de DNA de baixo peso molecular; Faixa 2: ATCC 179798; Faixa 3: AB258; Faixa 4: AB258:: adeIJK-LAC-Gm; Faixa 5: AB258::adeIJK; Faixa 6: controle sem modelo. A faixa esperada de 525 pb é rotulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cepas, plasmídeos e primers	Características relevantes	Referência
Mancha
A. baumannii ATCC 17978	Tipo de cepa	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmídeo
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpèreR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Este estudo
pTNS2	AmpèreR	9
pFLP2ab	pWH1266 origem ou replicação, sacB, AmpR	7
Primers	Sequência (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Este estudo
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Este estudo

Tabela 1: Cepas bacterianas, plasmídeos e primers utilizados neste protocolo. Gm, gentamicina; Ampicilina; ^R, resistente.

	Ciprofloxacina		Tetraciclina		Canamicina
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Mudança de dobra		4.01		4.03		0.25

Tabela 2: Testando a funcionalidade dos genes inseridos via suscetibilidade a antibióticos. Comparação dos valores de concentração inibitória mínima (CIM) para A. baumannii ATCC 17978, AB258, AB258::adeijk não induzido e AB258::adeIJK induzido por IPTG contra ciprofloxacina, tetraciclina e canamicina. Mudança de dobra = induzida (+ GPTI)/não induzida (− GPTI); nd = não determinado.

Discussion

Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifugação à temperatura ambiente é aceitável. Dada a crescente fragilidade das células durante as lavagens com água, a pipetagem suave também é crítica. Em segundo lugar, a eletroporação é sensível à presença de íons. Lavar as células com várias rodadas de peletização e ressuspender em água garante que o meio seja totalmente removido. Além disso, os plasmídeos devem ser purificados recentemente e podem ser eluídos em tampões de eluição de kit padrão (normalmente tampão TE), desde que a concentração de DNA plasmidial seja alta o suficiente. Nosso objetivo é adicionar <5 μL de plasmídeo a 100 μL de suspensão celular para manter a força iônica da amostra muito baixa, embora até 10 μL devam ser tolerados. Em terceiro lugar, placas seletivas de ágar devem ser preparadas conforme necessário para garantir a eficácia do antibiótico adicionado. Note-se que a carbenicilina foi usada em vez da ampicilina usual para seleção durante a transformação do plasmídeo de excisão, pFLP2^ab. A. baumannii é intrinsecamente resistente às aminopenicilinas (ampicilina)¹⁶; A substituição de uma carboxipenicilina (carbenicilina) permite a seleção contínua com a β-lactamase codificada por plasmídeos.

A otimização do protocolo experimental é mais matizada e irá variar entre diferentes espécies de Acinetobacter (ou mesmo cepas geneticamente manipuladas dentro da mesma espécie) e possivelmente os reagentes particulares usados no laboratório. Por exemplo, a tensão usada para eletroporação pode variar entre 1,8 e 2,5 kV, e as condições de termociclagem podem precisar ser ligeiramente alteradas dependendo da DNA polimerase usada para PCR. Dicas úteis a serem consideradas se as células estão crescendo mal após a eletroporação incluem reduzir a concentração de gentamicina nas placas de ágar de 50 μg/mL para 30 μg/mL e/ou estender o tempo de incubação das placas de ágar para ≥24 h. Em relação aos passos para a remoção do de gentamicina, melhor sucesso pode ser obtido com placas de ágar LB com sacarose a 10% e/ou incubação a 30 °C por ≥24 h se a resistência à carbenicilina persistir.

Numerosos métodos de preparação de células de A. baumannii para uso com eletroporação podem ser encontrados na literatura, mas eles frequentemente incluem uma etapa de subcultivo após a cultura noturna inicial e, em seguida, uma longa fase de crescimento para uma densidade óptica prescrita. Descobrimos que uma cultura simples da noite para o dia pode ser usada com a mesma eficácia. A eletroporação de A. baumannii tem sido bem descrita, e os leitores podem obter mais informações sobre este aspecto específico do protocolo^{aqui 17,18}. As principais vantagens deste sistema de complementação gênica cromossômica mini-Tn7 em comparação com um sistema de complementação baseado em plasmídeos são a capacidade de regular o nível de expressão do gene complementado através do sistema repressor lacI^q controlável por IPTG e a escolha de remover o marcador de gentamicina (gene aacC1) via os locais de FRT flanqueando. Observou-se que a tolerância das células à expressão de bombas de efluxo pode variar dependendo da bomba inserida. Por exemplo, as células são mais sensíveis à expressão de AdeIJK em comparação com AdeABC ou AdeFGH; isso pode ser resolvido modificando a concentração de IPTG em condições de cultura. A remoção do marcador antibiótico reduz o risco mutacional para a cepa devido à pressão de seleção constante e também permite investigações irrestritas de suscetibilidade aos antibióticos³.

Este sistema mini-Tn7 tem sido utilizado com sucesso com espécies de Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ e Acinetobacter ^5,6,21,22, porém existem algumas limitações. Por exemplo, em A. baumannii há apenas um sítio de inserção attTn7 funcional no genoma⁵, de modo que uma cepa pode ser criada com múltiplas deleções, mas apenas um gene de cada vez pode ser complementado. Além disso, esse sistema ainda não se mostrou eficaz para bactérias Gram-positivas¹⁰.

Bombas de efluxo de RND são importantes facilitadores da resistência a antibióticos em A. baumannii. O que os torna tão poderosos é sua estrutura de três partes que se estende pelas membranas interna e externa, permitindo a remoção de antibióticos do periplasma para fora da célula. As bombas RND mais estudadas e onipresentes - designadas AdeABC, AdeFGH e AdeIJK - demonstraram eliminar antibióticos abrangendo todas as classes. A elucidação detalhada da função da bomba de efluxo fornecerá um bom ponto de partida para projetar novas opções terapêuticas contra cepas multirresistentes. O uso da deformação de deleção da bomba RND tripla AB258 e a complementação de uma bomba de cada vez permite o estudo de cada bomba independente das outras, discernindo para cada um seus perfis de substrato exclusivos e inibidores mais eficazes. É claro que as bombas de efluxo também têm um papel "diário" na função normal da bactéria. A compreensão desses papéis poderia levar à paralisação indireta das bombas, o que, por sua vez, interromperia o efluxo de antibióticos, possivelmente tornando as bactérias multirresistentes suscetíveis aos antibióticos comumente usados mais uma vez. Geralmente, o sistema mini-Tn7 pode ser usado para introduzir qualquer gene de interesse para estudo detalhado ou marcadores úteis, por exemplo, proteínas fluorescentes para imagens microscópicas⁶.

A crescente prevalência de bactérias multirresistentes é uma preocupação para todos nós. A compreensão dos mecanismos protetores fornecidos pelas bombas de efluxo em patógenos como A. baumannii é fundamental para combater infecções graves. Este sistema cromossômico de expressão gênica de cópia única é uma ferramenta poderosa para estudos mecanísticos, bem como para identificar inibidores para impedir a função da bomba de efluxo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de PCR de 0,2 mL	VWR	20170-012	Para preparações de fervura de colônias e reações de PCR
Tubos de microfuga de 1,5 mL	Sarstedt	72-690-301
Tubos de cultura de 13 mL de uso geral, Pyrex	Fisher	14-957K	Vasos de cultura líquida
6x tampão de carregamento de DNA	Froggabio	LD010	Corante de carregamento de amostra de eletroforese em gel de agarose
Acético ácido, glacial	Fisher	351271-212	Componente de tampão de corrida de gel de agarose
Agar	Bioshop	AGR003	Meio de crescimento sólido
Agarose	BioBasic	D0012	Separação eletroforética de produtos de reação de PCR; usado em uma concentração de 0,8– Unidade
eletroforese em gel de agarose	Fisher	29-237-54	Eletroforese em gel de agarose; separação de produtos de reação de PCR
Carbenicilina	Fisher	50841231	Meios seletivos
Tampas de tubos de cultura	Fisher	13-684-138	Fechamento de aço inoxidável para tubos de cultura de 13 mL Conjunto
trifosfato de desoxinucleotídeo (dNTP) Biobasic		DD0058	componente de reação de PCR; fornecido como 100 mM cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP; misturado e diluído para 10 mM cada dNTP
Aquecedor de banho/bloco seco	Fisher	88860023	Isotemp banho seco digital para preparações de fervura
Cubetas de eletroporação	VWR	89047-208	Cuvetes de eletroporação de 2 mm com tampa redonda
Eletroporador	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz eletroporador
Brometo de etídio	Fisher	BP102-1	Visualização de produtos de reação de PCR e marcador de ADN em gel de agarose
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Gel de agarose componente tampão de corrida
Gentamicina	Biobasic	GB0217	Para a preparação de meios seletivos
Glicerol	Fisher	G33	Preparação de estoques bacterianos para armazenamento de longo prazo em um freezer ultrabaixo
Incubadora (agitação)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubadora Agitador para crescimento de cultura líquida
Incubadora (estática)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubadora Forno Modelo 550D para crescimento de cultura sólida (ágar LB)
Alça de inoculação	Sarstedt	86.1562.050	Colônias de listras em placas de ágar
Espalhador de inoculação	Sarstedt	86.1569.005	Espalhamento de cultura em placas de ágar
Caldo de lisogenia (LB) caldo, Lennox	Fisher	BP1427	Meios de crescimento líquidos (20 g/L: 5 g/L de cloreto de sódio, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura)
Microfuga	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 para centrifugação de amostras
Mini-centrífuga	Fisher	S67601B	Centrifugação de tubos de PCR de 0,2 mL Placas de Petri
	SPL Life Sciences	10090	Para meios de crescimento sólidos (placas de ágar): 90 x 15 mm
Pipetas	Mandel	Várias	pipetas de canal único Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Fonte de alimentação	Biorad	1645050	PowerPac Fonte de alimentação básica para eletroforese
Primers Componente de	IDT	NA	PCR; específico para o gene de interesse; preparado a 100 μ M conforme indicado na folha de especificações do produto
Sucrose	BioBasic	SB0498	Para a preparação de meios contra-seletivos para remoção do plasmídeo pFLP2ab de A. baumannii
Taq DNA polimerase	FroggaBio	T-500	Componente de reação PCR; polimerase fornecida com um termociclador 10x tampão
	Biorad	1861096	Modelo T100 para PCR
Palitos de dente	Fisher	S24559	Para remendar colônias em placas de ágar
Base Trizma Sigma		T1503	Componente de tampão de execução de gel de agarose
Água ultrapura	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	Sistema de purificação de água MilliQ: água ultra pura para preparação de meios e soluções e lavagem de células
Marcador de DNA de ampla gama	Biobasic	M103R-2	Determinação do tamanho de produtos de PCR em um gel de agarose
Varas de inoculação de madeira	Fisher	29-801-02	Inoculação de culturas com colônias de placas de ágar