Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Summary

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Abstract

A termogênese mediada pelo tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel importante na regulação do metabolismo, e sua morfologia e função podem ser grandemente impactadas por estímulos ambientais em camundongos e humanos. Atualmente, a MTD interescapular murina (BATi), localizada entre duas escápulas no flanco dorsal superior de camundongos, é o principal depósito de MTD utilizado pelos laboratórios de pesquisa para estudar a função das MTD. Recentemente, alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos foram identificados em camundongos, incluindo um análogo ao tecido adiposo marrom supraclavicular humano. Ao contrário do iBAT, o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) está situado na camada intermediária do pescoço e, portanto, não pode ser acessado tão facilmente.

Para facilitar o estudo de scBAT de camundongos recém-identificados, é apresentado aqui um protocolo detalhando os passos para dissecar scBAT intacta de camundongos pós-natais e adultos. Devido ao pequeno tamanho do scBAT em relação a outros depósitos adiposos, os procedimentos foram modificados e otimizados especificamente para o processamento do scBAT. Entre essas modificações está o uso de um microscópio dissecante durante a coleta de tecidos para aumentar a precisão e homogeneização de amostras de scBAT congeladas para aumentar a eficiência da análise subsequente de qPCR. Com essas otimizações, a identificação, a aparência morfológica e a caracterização molecular da scBAT podem ser determinadas em camundongos.

Introduction

O aumento da prevalência da obesidade nos EUA e no mundo tem despertado grande interesse na compreensão de sua etiologia e na identificação de potenciais tratamentos ^1,2. O tecido adiposo desempenha um papel vital no metabolismo, e a desregulação do tecido adiposo pode levar ao desenvolvimento da obesidade. Geralmente, existem dois tipos de tecido adiposo, tecido adiposo branco e marrom. Enquanto o tecido adiposo branco (TAB) pode armazenar energia química e secretar fatores endócrinos, o tecido adiposo marrom (BAT) pode utilizar energia química para gerar calor e manter a temperatura corporal no frio ^3,4. Devido a essa habilidade única, a ativação da MTD também pode aumentar o gasto energético e melhorar a sensibilidade à insulina⁵.

A MTD exerce sua função através da termogênese sem tremores, um processo mediado pela proteína desacopladora 1 (UCP1)⁶. Mamíferos, incluindo camundongos e humanos, possuem quantidades variáveis de BAT. A visão clássica da MTD é que esses tecidos adiposos são mais abundantes em camundongos e lactentes do que em humanos adultos. O iBAT, localizado no flanco dorsal superior entre as escápulas, é o depósito de MTD mais estudado em camundongos. Através da aplicação de exames de imagem com radioisótopos e biópsias, estudos recentes identificaram vários depósitos de MTD em humanos adultos. Alguns deles, incluindo os depósitos encontrados no pescoço profundo e região supraclavicular, não haviam sido previamente identificados em camundongos ou outros animais modelo7,8,9,10,11. Entre esses depósitos BAT, o scBAT é o depósito mais frequentemente visto em humanos adultos. Para entender melhor a origem e a contribuição molecular desses depósitos BAT recém-encontrados em humanos, é essencial identificar depósitos equivalentes em camundongos que permitam manipulações genéticas e moleculares para rastrear e testar o papel funcional desses depósitos. Assim, nós e outros identificamos alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos em diferentes localizações anatômicas em camundongos, incluindo MTD scBAT^12,13, BAT perivascular torácica ^14,15, BAT perirrenal¹⁶ e BAT periaórtica¹⁷. O scBAT de camundongo se assemelha anatomicamente ao scBAT humano e morfologicamente se assemelha ao iBAT clássico, expressando altos níveis de UCP1¹².

Ao contrário do iBAT de camundongo, que pode ser facilmente dissecado, o scBAT está situado na camada intermediária do pescoço de camundongos, abaixo das glândulas salivares e ao longo da veia jugular externa. O isolamento deste depósito para análises histológicas e moleculares pode ser um desafio. Aqui, descrevemos em detalhes o procedimento para dissecar scBAT de camundongos pós-natais e adultos e processar este depósito para histologia e análise de expressão gênica.

Protocol

Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados em camundongos machos C57BL/6J com idade entre 3 semanas e 3 meses de idade. Antes da dissecção, todos os camundongos foram eutanasiados usando o procedimento aprovado de eutanásia de dióxido de carbono em roedores. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Dissecção de scBAT

1. Coloque a carcaça do rato na bancada e limpe a tesoura cirúrgica e a pinça de ponta superfina com etanol 70%.
2. Borrife o pescoço ventral do rato com etanol a 70% para molhar o pelo e minimizar a contaminação do pelo.
3. Fazer uma incisão bilateral, de aproximadamente 1,5 cm, ao longo das clavículas.
4. A partir das extremidades da incisão anterior, corte longitudinalmente em direção às orelhas, com aproximadamente 1 cm de comprimento. Isso formará uma incisão quadrada em forma de U ao redor do pescoço (Figura 1A,B).
   NOTA: scBAT encontra-se na camada intermediária do pescoço. A camada superficial, composta pela pele, tecido adiposo subcutâneo e glândulas salivares, fica exposta durante essa etapa. A camada intermediária, juntamente com a scBAT, contém as veias jugulares e os músculos do pescoço. A camada profunda do pescoço, contendo MTD cervical profunda e veias arteriais e jugulares, é exposta pela remoção do músculo esquelético.
5. Coloque o camundongo sob um microscópio dissecante e coloque o pescoço exposto em foco (Figura 1C).
   NOTA: Este passo adicional aumenta muito a precisão da coleta de tecidos, necessária dado o pequeno tamanho do scBAT.
6. Exponha totalmente as glândulas salivares, levantando as secções da pele incisada com pinças.
7. Usando tesoura cirúrgica e pinças, desconecte o tecido que conecta as glândulas salivares ao tecido ao redor das clavículas e umas às outras.
8. Exponha os depósitos de scBAT levantando as glândulas salivares. Procure a MTD ao longo da veia jugular externa e possivelmente conectada à face inferior das glândulas salivares. Identifique-o pela sua cor alaranjada, que se destaca contra o tecido circundante.
9. Segure o tecido adiposo alvo com pinça e descasque-o suavemente para longe das glândulas salivares.
10. Uma vez descolado das glândulas salivares, continue a desconectar o scBAT da veia jugular externa e da musculatura do pescoço até que os depósitos de ambos os lados do pescoço possam ser removidos inteiros.
11. Inspecionar cada amostra dissecada de scBAT sob o microscópio dissecante (Figura 1D,E), usando pinça para remover qualquer tecido conjuntivo restante.
12. Coloque cada amostra num frasco para injetáveis de cintilação de vidro contendo 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e retire o rato do microscópio.

2. Processamento e coloração de hematoxilina e eosina (H&E) da scBAT (ilustrada na Figura 2A)

1. Substitua o PBS (passo 1.12) por 10 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% frio e coloque o frasco para injetáveis num nutador, balançando a 4 °C durante a noite para fixar o scBAT.
   NOTA: A fixação de perfusão pode ser aplicada em camundongos pós-natais, especialmente adultos, quando for necessário processamento adicional para análise imuno-histoquímica.
2. No dia seguinte, remova a solução de PFA do frasco para injetáveis com uma pipeta de transferência estéril e substitua-a por 10-15 ml de PBS. Coloque o frasco para injetáveis num nutador e rocha durante 30 minutos à temperatura ambiente. Substitua o PBS por solução salina a 0,85% e continue balançando por mais 30 min à temperatura ambiente.
   NOTA: A solução salina é solução salina a 0,85% (NaCl) p/v em água tratada com DEPC (livre de RNase). O PBS pode ser substituído pela solução salina nesta e na etapa seguinte.
3. Retire o soro fisiológico a 0,85% com uma pipeta de transferência e adicione 10 mL de solução salina a 70% de etanol/solução fisiológica a 0,85% ao frasco para injetáveis. Guarde o frasco para injetáveis num frigorífico a 4 °C durante a noite ou até estar pronto para a incorporação em parafina.
   NOTA: PBS pode ser usado se 0,85% de soro fisiológico não estiver disponível. scBAT deve ser processado o mais rápido possível para facilitar a secção e melhor morfologia do tecido.
4. Antes da incorporação da parafina, desidrate o scBAT através de uma série de trocas de etanol para remover a água do tecido.
   1. Para começar, remova o etanol 70% / soro fisiológico 0,85% do frasco para injetáveis com uma pipeta de transferência e adicione 10-15 mL de álcool desidratante a 95%, balançando o frasco para injetáveis em um nutador à temperatura ambiente por 1 h. Repita esta etapa uma vez.
      NOTA: O etanol pode ser usado no lugar de soluções de álcool desidratante.
   2. Em seguida, substitua o Álcool Desidratante 95% por 10-15 mL de Álcool Desidratante 100% e continue balançando em um nutador por 1 h. Reabasteça com novo álcool 100% desidratante e continue a balançar por várias horas ou durante a noite, dependendo da quantidade de scBAT no frasco.
5. Para limpar scBAT para incorporação, adicione 10 mL de tolueno ao frasco para injetáveis e continue balançando em um nutador até que scBAT esteja transparente, aproximadamente 6-8 h.
   NOTA: A duração do tempo necessário para alcançar uma compensação satisfatória depende do tamanho do scBAT. Recomenda-se começar a limpar imediatamente pela manhã para que a infiltração e incorporação possam ocorrer à tarde.
6. Para incorporar scBAT em cera de parafina, remova o tolueno e adicione 10 mL de cera de parafina de infiltração derretida ao frasco para injetáveis. Colocar o frasco para injetáveis num forno a 65 °C durante 1 h. Repita este passo com cera nova.
   NOTA: Comece a derreter os pellets de cera em um forno durante a noite antes de começar a incorporar para garantir que a cera esteja totalmente líquida.
7. Substitua a cera de parafina de infiltração por cera de parafina de incorporação e coloque o frasco para injetáveis à mesma temperatura durante 1 h. Repita esta etapa uma vez.
   NOTA: O estágio de infiltração pode ser interrompido e continuado mais tarde. Retire o frasco para injetáveis do forno e guarde-o à temperatura ambiente até estar pronto para continuar.
8. Incorpore o tecido colocando-o primeiro em um molde de incorporação de tecido, adicione cera de incorporação derretida ao molde e reoriente o tecido sob um estereomicroscópio. Em seguida, coloque um de incorporação em cima da cera e continue a despejar cera de incorporação por cima dela até que esteja cheia e a tampa de incorporação seja presa ao bloco de cera. Transfira o bloco para uma geladeira a 4 °C durante a noite para deixar a cera enrijecer e encolher antes de remover o molde metálico.
9. Seccionar o scBAT com um micrótomo a uma espessura de 5-6 μm¹⁸, três a quatro cortes por lâmina de microscópio, e colocar em um banho de flutuação de seção de parafina quente a ~42 °C para permitir que as seções de tecido lisem.
10. Transfira as seções para as corrediças e coloque-as na vertical contra o banho de flutuação para permitir que a água escorra das lâminas.
11. Transfira as corrediças para um rack de coloração inoxidável e coloque o rack em uma bancada de secagem de corrediças para secar durante a noite.
    NOTA: As lâminas de parafina podem ser armazenadas a longo prazo à temperatura ambiente antes de um processamento adicional ser alcançado.
12. Realizar a coloração H&E¹⁹. Para começar, coloque as lâminas em um rack de coloração e, em seguida, coloque o rack em um frasco de coloração com xileno por 40 s. Repita esta etapa uma vez.
    NOTA: Se a parafina ainda estiver visível após os dois estágios, aguarde até que ela tenha se dissolvido completamente antes de continuar.
13. Para reidratar o tecido, coloque a cremalheira deslizante em um frasco de coloração preenchido com Álcool Desidratante 100% por duas etapas de 20 s, seguidas por uma etapa de 15 s em Álcool Desidratante 95% e uma lavagem final de 15 s em ddH₂O.
14. Coloque as lâminas em uma placa de coloração preenchida com solução de hematoxilina por 75 s para obter a coloração nuclear e, em seguida, enxágue as lâminas em uma placa de coloração com ddH₂O por 45 s.
    NOTA: O tempo pode ser ajustado dependendo da cor da mancha desejada.
15. Diferenciar a coloração mergulhando as lâminas em uma placa de coloração preenchida com solução de etanol de HCl por 15 s e, em seguida, transferir as lâminas para outro enxágue ddH₂O por 15 s.
    NOTA: A solução de HCl-etanol é preparada de acordo com um método publicado¹⁹.
16. Para coloração citoplasmática, colocar a lâmina em uma solução de contracoloração Eosina Y por 15 s.
17. Desidratar o tecido mergulhando as lâminas por 15 s cada em três estágios sequenciais de solução de álcool desidratante a 95%, depois dois banhos sequenciais de álcool desidratante 100% - o primeiro por 15 s e o segundo por 45 s - para terminar a desidratação.
18. Finalmente, transferir as lâminas para um banho de xileno por 45 s para reaclimatar o tecido a solventes orgânicos. Após essa etapa, a coloração é concluída; Remova o tecido da solução.
19. Aplique o meio de montagem em cada lâmina e cubra-o dentro de um exaustor de fumaça química. Seque durante a noite antes de fazer a imagem. Os resultados das imagens são mostrados na Figura 2B.

3. Análise da expressão gênica de scBAT

1. Coleta de Tissue (moagem)
   1. Depois de dissecar scBAT, coloque imediatamente o tecido em um tubo de microcentrífuga, faça um furo na parte superior do tubo com uma agulha estéril e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
      NOTA: As principais etapas do protocolo descritas aqui são ilustradas na Figura 3A. Fazer um furo na parte superior do tubo antes de deixá-lo cair em nitrogênio líquido impede que o tubo estoure devido à mudança repentina de pressão.
   2. Encha um copo plástico com nitrogênio líquido e deixe um pilão e espátula fina de molho.
      NOTA: É importante manter a temperatura de todas as ferramentas e amostras de tecido o mais fria possível, próxima à temperatura do nitrogênio líquido, durante todo o procedimento para evitar que o tecido descongele. O tecido adiposo descongelado é muito aderente e torna o pó mais desafiador. Remova apenas ferramentas e amostras de banhos de nitrogênio líquido imediatamente antes do uso.
   3. Pegue uma amostra de tecido congelado de cada vez e despeje-a de seu tubo de microcentrífuga na argamassa.
   4. Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido à argamassa e, em seguida, use o pilão para triturar o tecido congelado até que ele esteja completamente pulverizado.
      OBS: Se o tecido começar a ficar macio ou pegajoso em algum momento, ele está descongelando; despeje mais nitrogênio líquido na argamassa.
   5. Use a espátula fina para raspar cuidadosamente e transferir o tecido pulverizado de volta para o tubo de microcentrífuga. Despeje nitrogênio líquido na argamassa enquanto raspa para coletar restos de tecido antes de transferir com uma espátula. Repita as etapas de transferência até que todo o tecido seja retirado da argamassa.
   6. Limpe a argamassa com um limpador de papel leve e etanol 70% antes de despejar a próxima amostra para moer. Conservar o tecido em pó num congelador a -80 °C a longo prazo.
2. Isolamento de RNA total
   1. Preparação
      1. Limpe a bancada, pipetas, suportes de ponta e suportes de tubo com etanol 70% e descontaminante de superfície para remover a RNase.
      2. Acione a máquina centrífuga para atingir 4 °C.
      3. Aquecer a solução de eluição a 70 °C.
      4. Diluir a DNase I misturando 5 μL de DNase I reconstituída com 75 μL de solução de diluição de DNase por amostra. Colocar a solução de DNase I no gelo até à sua utilização.
   2. Procedimento
      1. Para cada amostra, rotule dois tubos de microcentrífuga, dois tubos de retenção de coluna (dois tubos de microcentrífuga graduada sem tampa) e uma mini coluna de ligação.
      2. Adicionar 500 μL de solução de isolamento de RNA a cada amostra e sonicar usando um motor de pilão pellet por 30 s.
      3. Obtenha uma seringa para cada amostra e pipete para cima e para baixo 10x para lisar ainda mais o tecido. Certifique-se de que nenhum sólido seja visível após a seringa.
      4. Adicionar 250 μL de clorofórmio e vórtice ocasionalmente enquanto aguarda 5 minutos para que as amostras incubem à temperatura ambiente.
      5. Centrifugar a 21.000 × g por 20 min a 4 °C.
      6. Transfira a porção aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga e adicione uma quantidade equivalente de etanol 70% (~500 μL).
         NOTA: A porção aquosa superior deve ser clara, a inferior deve ser a solução de isolamento de RNA vermelho, e entre as duas camadas devem estar alguns sólidos indesejados.
      7. Transferir 500 μL do novo lisado para a coluna de ligação. Centrifugar a 18.000 × g por 60 s e, em seguida, descartar o filtrado.
      8. Repita a etapa anterior com o lisado restante para obter todo o RNA na coluna de ligação.
      9. Adicionar 700 μL de lavagem de baixa estringência à coluna de ligação, centrifugar por 30 s e descartar o filtrado.
      10. Adicionar 80 μL de DNase I diluída a cada coluna de ligação. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      11. Adicionar 700 μL de lavagem de alta rigor, centrifugar por 30 s e descartar o filtrado.
      12. Adicione 700 μL de lavagem de baixo rigor, centrifugar por 60 s e descartar o filtrado.
      13. Mova as colunas de ligação para a^2ª nova coluna sem tampa que prende o tubo e centrífuga por 2 minutos para garantir que todos os líquidos sejam removidos da coluna de ligação.
      14. Mover as colunas de ligação para um novo tubo de microcentrífuga e adicionar 30 μL de solução de eluição aquecida. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
      15. Centrifugar por 2 min para coletar o RNA eluído no fundo do tubo de microcentrífuga.
      16. Medir a concentração total de RNA usando um espectrofotômetro.
          NOTA: Se a pureza total do ARN for baixa, indicada por um valor de 260/280 inferior a 2,0 ou 260/230 inferior a 1,8, após o passo 3.2.2.12., as amostras podem ser novamente lavadas com lavagem de baixo rigor, seguidas de serem lavadas com etanol a 80% antes de continuarem com o passo 3.2.2.13.
      17. Conservar o ARN num congelador a -80 °C.
   3. Transcrição reversa (RT)
      1. Em uma tira de tubo de PCR, adicionar 0,5-1 μg de RNA total diluído em água tratada com DEPC a um total de 8 μL para cada amostra de RNA em um poço diferente.
         NOTA: A quantidade de RNA usada para transcrição reversa pode ser aumentada ou reduzida de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Adicionar 1 μL de Oligo dT e 1 μL de dNTPs a cada amostra no tubo de PCR. Certifique-se de que o volume total é de 10 μL por amostra.
      3. Coloque a tira do tubo de PCR em um termociclador e coloque-a em 65 °C por 5 min seguido de 4 °C indefinidamente.
      4. Após 5 min a 65 °C, retire a tira do tubo de PCR e coloque o tubo no gelo por pelo menos 2 min. Após incubação no gelo, adicionar cinco reagentes: 4 μL de tampão de primeira fita 5x, 2 μL de MgCl₂ 25 mM, 2 μL de TDT 0,1 M, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa para cada amostra. Certifique-se de que o volume total seja agora de 20 μL por amostra.
      5. Coloque a tira do tubo de PCR de volta no termociclador e ajuste o programa para 50 °C por 50 min, depois 85 °C por 5 min, depois 4 °C indefinidamente.
      6. Quando o programa atingir 4 °C, retire a tira e adicione 1 μL de Ribonuclease H (RNase H).
         NOTA: RNase H é usado para remover qualquer molde de RNA restante na reação RT; nesta etapa, o RNA desejado já deve ser convertido em cDNA.
      7. Coloque a tira de volta no termociclador e funcione 37 °C por 20 min e, em seguida, 4 °C indefinidamente.
      8. A transcrição reversa está completa; medir a concentração de cDNA usando um espectrofotômetro.
      9. Diluir o cDNA para 250 ng/μL; armazenar o cDNA em um freezer de -80 °C ou -20 °C.
   4. PCR quantitativo (qPCR)
      1. Faça uma planilha para organizar a posição de cada primer e amostra na placa qPCR de 96 poços.
         NOTA: Um dos primers precisa ser um gene de referência para normalizar a expressão de todos os outros genes de interesse, como o 36B4.
      2. Faça uma mistura mestre de primer para cada combinação "primer + amostra". Para cada reação de qPCR, adicione 3 μL de Água de Grau de Biologia Molecular, 5 μL de mistura mestre de enzima qPCR, 0,5 μL de primer para frente e 0,5 μL de primer reverso, o que soma 9 μL por reação. Adicione 1 μL de cDNA por reação para fazer um total de 10 μL por reação.
         NOTA: O padrão é ter três réplicas técnicas para cada combinação "primer + amostra", então cada mistura mestre deve ser 4x das quantidades acima.
      3. Adicionar 1 μL de cDNA para cada réplica a cada mistura mestra de primers. Se cada mistura mestre for 4x, pipete 4 μL de cada amostra de cDNA em seu próprio tubo marcado.
      4. Finalmente, pipetar 10 μL de cada mistura de reação na placa qPCR de 96 poços nas posições determinadas pela planilha.
      5. Sele a placa com um selo adesivo espesso e, em seguida, centrifugar a placa de 96 poços a 450 × g a 20 °C por 2 minutos.
         NOTA: É fundamental que a placa esteja totalmente selada para evitar que as amostras evaporem durante a termociclagem. Use limpadores de papel leves para pressionar a vedação na placa, especialmente nas bordas.
      6. Execute a placa em um instrumento de PCR em tempo real. Programe a reação de PCR de acordo com as instruções do fabricante: 2 min a 50 °C, seguido por mais 2 min a 95 °C e, finalmente, 40 ciclos de 15 s a 95 °C e 30 s a 60 °C. Os resultados da análise da expressão gênica da qPCR são mostrados na Figura 3B.

Results

Ao contrário do iBAT, que se situa na camada subcutânea do dorso entre duas escápulas, o scBAT situa-se na camada intermediária do pescoço, estendendo-se profundamente entre as camadas do músculo esquelético e a glândula salivar à medida que cresce ao longo da veia jugular externa (Figura 1A). Dissecar scBAT não é tão simples quanto o iBAT. Aqui, fornecemos um procedimento detalhado que inclui etapas cruciais para a dissecação da scBAT intacta de camundongos adultos e pós-natais (Figura 1B,C). Após a abertura do pescoço com o protocolo fornecido, uma fina camada de scBAT pode ser identificada sob um microscópio dissecante e descascada da glândula salivar conectada e da veia jugular externa com um par de pinças (Figura 1D,E). Para avaliar a morfologia do depósito, scBAT recém-isolado foi processado usando o procedimento de processamento fornecido combinado com um procedimento de coloração de H&E previamente publicado¹⁹ (Figura 2A). Como mostrado na Figura 2B, a scBAT possui estruturas teciduais típicas de depósitos de MTD e é composta por muitos adipócitos pequenos e multiloculares em camundongos saudáveis pós-natais e adultos. Para avaliar os níveis de expressão gênica no scBAT, o RNA foi extraído de depósitos isolados de scBAT usando os procedimentos fornecidos (Figura 3A). Os níveis de expressão dos genes de interesse podem então ser avaliados por métodos padrão de RT-qPCR (Figura 3A). Como mostrado na Figura 3B, os níveis de expressão diferencial de genes envolvidos na mediação da função scBAT, incluindo Pparg, o regulador mestre do desenvolvimento de BAT; Fabp4 e Glut4, dois transportadores de nutrientes; e Ucp1 e Ppargc1a, dois genes envolvidos na termogênese, podem ser prontamente determinados. Para comparação, o RNA foi extraído de iBAT isolado, e a expressão dos genes listados acima também foi avaliada usando os procedimentos fornecidos (Figura 3A). Os níveis de expressão desses genes são relativamente semelhantes entre esses dois depósitos. (Figura 3B).

Figura 1: Localização anatômica da scBAT e processo de sua dissecção. (A) localização da scBAT na camada intermediária do pescoço. (B) A camada superficial do pescoço antes e depois da remoção da pele. Barra de escala = 250 μm. Linhas amarelas pontilhadas delineiam a área que deve ser exposta após a incisão em U. (C) Imagem de uma carcaça de camundongo colocada sob um microscópio dissecante para aumentar a clareza visual durante a dissecção. (D,E) Imagens representativas da camada intermediária do pescoço antes e depois da remoção do scBAT de camundongos com 3 semanas e 3 meses. Barra de escala = 250 μm. Linhas amarelas pontilhadas delineiam depósitos bilaterais expostos a scBAT; n = 2. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; SFI = camada superficial; SG = glândula salivar; tr = traqueia; JV = veia jugular externa; sm = músculo esquelético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Processamento scBAT para coloração H&E. (A) Fluxograma ilustrando as principais etapas do processamento scBAT para coloração H&E. Após a dissecção do tecido, este é fixado sequencialmente, desidratado, incorporado, seccionado e corado. (B) Imagens representativas de scBAT corado por H&E de camundongos com idade de 3 semanas e 3 meses; n = 3 para cada estágio de desenvolvimento; barra de escala = 250 μm para imagens com aumento menor; barra de escala = 50 μm para imagens de maior aumento. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; PFA = paraformaldeído; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Preparação do RNA do scBAT para análise da expressão gênica. (A) Fluxograma ilustrando as etapas de isolamento de RNA e análise RT-qPCR da expressão gênica scBAT. Devido ao seu pequeno tamanho e textura macia, congelar o depósito de scBAT e moê-lo em nitrogênio líquido é crucial para o isolamento bem-sucedido do RNA. (B) Expressão relativa de genes marcadores, incluindo Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 e Ppargc1a, em scBAT e iBAT isolados de camundongos machos com 3 meses de idade, n = 5. Os dados são apresentados como média ± MEV.36B4 foi usado como um gene housekeeping para normalização. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; RT-qPCR = transcrição reversa-PCR quantitativo; LN₂ = nitrogênio líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Neste protocolo, apresentamos em detalhes os procedimentos de dissecação e processamento de scBAT para análises de H&E e expressão gênica. Como o scBAT reside na camada intermediária do pescoço e fica ao longo das grandes veias, o isolamento desse depósito requer técnica precisa. Especificamente, para obter uma visão clara do depósito, recomendamos colocar o camundongo sob um microscópio dissecante após a abertura do pescoço. Usando um par de pinças de ponto superfino para descascar a glândula salivar e as veias circundantes, deve-se tomar cuidado para evitar perfurar as veias. O sangramento excessivo pode dificultar a localização do scBAT. Para processar scBAT para coloração de H&E, adaptamos o uso de um protocolo publicado¹⁹ com pequenas modificações para incluir o uso de PFA 4%, álcoois desidratantes e um solvente orgânico, tolueno, para processamento de tecidos, como mostrado na seção protocolo. Todo o procedimento leva ~6 dias para ser concluído, e as lâminas coradas com H&E podem ser fotografadas no dia seguinte após a conclusão da coloração.

A RT-QPCR utilizando RNA como material de partida é o método mais utilizado para análise da expressão gênica no campo da biologia do tecido adiposo. Como o scBAT é um depósito de MTD relativamente pequeno em comparação com o iBAT, a obtenção de RNA suficiente para a expressão gênica pode ser difícil. Para aumentar o rendimento de RNA, recomendamos a aplicação de etapas sequenciais de preparação de lisado conforme descrito na seção de protocolo, começando por pulverizar o tecido usando um pilão e argamassa enquanto congelado. Usando este método de preparação de lisado, obtivemos com sucesso uma amostra de RNA de alto rendimento e alta qualidade para análise da expressão gênica de scBAT de um camundongo adulto. Este método de preparação de lisado também pode ser aplicado para obter lisados proteicos de alta qualidade a partir de scBAT para western blotting com o uso de tampão de lise proteica.

Usando o iBAT de camundongos, os pesquisadores adquiriram conhecimento substancial sobre a função BAT na termogênese e metabolismo. A recente identificação de alguns depósitos de BAT não reconhecidos anteriormente em camundongos e humanos, incluindo scBAT, revelou a necessidade de mais estudos antes que possamos entender completamente a contribuição fisiológica da BAT em camundongos e humanos adultos. Particularmente, estudos que iluminem as origens, funções e envolvimento desses depósitos de MTD recém-encontrados na termogênese e no metabolismo regional ou de corpo inteiro são necessários.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Álcool desidratante 95% (Flex 95)	Epredia	8201
Álcool desidratante 100% (Flex 100)	Placa PCR de	8101
	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Moldes de Base 7326804
(para incorporação)	Tissue-Tek	4122
BD 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Termociclador Tubos			Bio-Rad
2 mL Centrífuga	Fisherbrand	02-681-453
	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Instrumento de PCR em Tempo Real	Bio-Rad	12011319
Clorofórmio	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Meio de montagem de baixa viscosidade	Epredia	83104
Água tratada com DEPC	Ambion	AM 9906
Microscópio de Dissecação	Nikon
de diluição SMZ1500 DNase	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Solução de eluição	Bio-Rad	7326801
EM 400 em meio de incorporação de parafina	Leica Biosystems	3801320
Eosina Y (0,5% p/v)	RICCA	2858-16
Fórmula R Meio de infiltração parafina	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill # 3 Hematoxilina	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (para HCL-Etanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI de Incorporação	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Etanol Puro da Koptec - 200 Provas (para 70% de Etanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher	Scientific R0971
1.7 mL	Avantor	87003-294
(selos adhseive)	Bio-Rad	MSB1001
Micrótomo	Leica Biosystems	RM2245
Grau de Biologia Molecular Água	Corning	46-000-CM
Argamassa Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (para 0,85% de solução salina)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Espectrofotômetro NanoDrop	Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
Tube Strip	Avantor	76318-802
Pilão por Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Motor de Pellets de Pilão	Kimble	749540-0000
Tampão de fosfato salina (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (para a frente) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen lab Oligo banco de dados
Primer: 36B4 (reverso) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverso) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab Oligo banco de dados
Primer: Glut 4 (primer direto) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Oligo banco de dados
Primer: Glut 4 (reverso) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo banco de dados
Primer: PPARg (encaminhar) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserva) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverso) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo banco de dados
Primer: Ucp1 (encaminhamento) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverso) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			de banco de dados Oligo do laboratório
Chen (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (descontaminante de superfície)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Inibidor de Rnase (RNase Out)	de 10777019		Invitrogen
(vidro)	Microscopia eletrônica Sciences	72632
Bancada de secagem de slides	Eletrotérmica (Cole-Parmer)	MH6616
Rack de coloração inoxidável	Microscopia eletrônica Ciências	70312-54
Microscópio estéreo (para incorporação)	Olympus	SZ51
Tesoura de medição	McKesson	43-1-104
Pinça de dissecação reta de ponta superfina	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Lâminas de Microscópio	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Transcriptase Reversa (Inclui 5x Tampão de Primeira Fita e 0.1M DTT)	Seringa Invitrogen	18080044
SUR-VET com agulha 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (mistura mestre de enzimas qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Conjunto de coloração manual de lâminas Tissue-Tek (frascos)	Microscopia eletrônica Ciências	SKU: 62540-01
Tolueno	Fisher Chemical	T324-1
Pipeta de transferência	Avantor	414004-005
Xileno	Fisher Chemical	X3P-1GAL