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Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

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DOI:

10.3791/66479

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24 de maio de 2024

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

Um procedimento de punção para formação de trombo hemostático é apresentado aqui. Os trombos formados são grandes e têm centenas de mícrons de diâmetro. Portanto, as abordagens de imagem de volume são apropriadas. Sugerimos microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada como uma abordagem de alta resolução disponível para muitos e detalhamos um protocolo preparativo.

Resumo

A hemostasia, o processo de controle fisiológico normal do dano vascular, é fundamental para a vida humana. Todos nós sofremos pequenos cortes e perfurações de vez em quando. Na hemostasia, a agregação plaquetária autolimitada leva à formação de um trombo estruturado no qual a cessação do sangramento vem do fechamento do orifício pelo lado de fora. A caracterização detalhada dessa estrutura poderia levar a distinções entre hemostasia e trombose, um caso de agregação plaquetária excessiva levando à coagulação oclusiva. Uma abordagem baseada em imagem para a estrutura do trombo da ferida por punção é apresentada aqui, que se baseia na capacidade da microscopia eletrônica de seção fina de visualizar o interior dos trombos hemostáticos. A etapa mais básica em qualquer protocolo experimental baseado em imagem é uma boa preparação da amostra. O protocolo fornece procedimentos detalhados para a preparação de feridas por punção e trombos ricos em plaquetas em camundongos para microscopia eletrônica subsequente. Um procedimento detalhado é fornecido para a fixação in situ do trombo da ferida de punção em formação e seu processamento subsequente para coloração e incorporação para microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica é apresentada como a técnica de imagem final devido à sua capacidade, quando combinada com o seccionamento sequencial, de visualizar os detalhes do interior do trombo em alta resolução. Como método de imagem, a microscopia eletrônica fornece amostragem imparcial e uma saída experimental que escala de nanômetros a milímetros em 2 ou 3 dimensões. É citado um software de microscopia eletrônica freeware apropriado que suportará microscopia eletrônica de área ampla, na qual centenas de quadros podem ser combinados para fornecer imagens em escala nanométrica de seções transversais inteiras de trombos de feridas de punção. Assim, qualquer sub-região do arquivo de imagem pode ser facilmente colocada no contexto da seção transversal completa.

Introdução

A formação de um trombo de punção que leva à cessação do sangramento é um dos eventos mais essenciais da vida1. No entanto, apesar dessa essencialidade, o conhecimento do que ocorre estruturalmente durante a formação do trombo, seja em uma veia, uma artéria, um evento aterosclerótico ou um coágulo oclusivo, tem sido limitado pela resolução e profundidade da imagem. A microscopia óptica convencional é limitada em profundidade quando comparada a um trombo de ferida por punção totalmente formado, 200 a 300 μm em Z1, e em nível de resolução quando comparada ao tamanho das organelas plaquetárias e seu espaçamento, geralmente inferior a 30 nm2. A microscopia de luz de dois fótons pode produzir a profundidade necessária de imagem, mas não melhora significativamente a resolução. Os avanços mais recentes na microscopia de luz, por exemplo, técnicas de super-resolução, ainda são limitados pela resolução, na prática ~ 20 nm em XY e duas vezes isso em Z, e limitados em profundidade, não mais do que a microscopia de luz convencional. Além disso, a microscopia de luz de super-resolução, como grande parte da microscopia de luz de pesquisa, é baseada na microscopia de fluorescência, uma técnica que é inerentemente tendenciosa para um pequeno conjunto de proteínas candidatas para as quais existem bons anticorpos ou boas construções marcadas3. Em conclusão, a microscopia eletrônica de varredura convencional pode, no máximo, visualizar a superfície do trombo rico em plaquetas em formação.

Para superar essas limitações técnicas para caracterizar a estrutura do trombo, tivemos três objetivos. Primeiro, produza de forma reprodutível uma ferida de punção definida em uma veia ou artéria de camundongo que possa ser prontamente estabilizada in situ por fixação química. Em segundo lugar, aplique um procedimento preparativo que enfatize a preservação da membrana, um objetivo consistente com o objetivo de definir a posição das plaquetas individuais dentro do trombo em formação. Terceiro, use uma técnica de visualização imparcial que, em uma única imagem, possa ser dimensionada entre nanômetros e quase milímetros.

A microscopia eletrônica montada de área ampla foi escolhida como uma das principais técnicas de visualização final por um único motivo importante: na imagem de microscópio eletrônico, vê-se uma vasta gama de características dentro de uma célula que delineia suas organelas e características dentro das organelas. Pequenos objetos, como ribossomos, podem ser reconhecidos. Essa gama de recursos é vista porque as manchas de metais pesados densos em elétrons, uranila, chumbo e ósmio, que são usadas para microscopia eletrônica para produzir contraste, ligam-se a uma ampla gama de moléculas. Em uma imagem de microscópio eletrônico, vê-se muito do que está lá, enquanto com as abordagens de imunofluorescência e marcação de proteínas, vê-se apenas o que acende. Isso significa, por exemplo, os locais de antígeno presentes em uma determinada espécie de proteína individual. No caso de uma molécula marcada, geralmente uma proteína, é o(s) local(is) onde essa proteína está. Todas as outras moléculas são escuras e não iluminadas. No entanto, essa escolha de microscopia eletrônica é prática? Um trombo de ferida por punção tem um tamanho de 300 por 500 μm e, com um tamanho de pixel de 3 nm, é uma imagem de 100.000 por 167.000 pixels. Uma câmera de microscópio eletrônico de alta qualidade tem 4000 por 4000 pixels. Isso significa que aproximadamente 1000 quadros devem ser costurados/misturados para fornecer uma única imagem. Essa é uma possibilidade que está presente na maioria dos microscópios eletrônicos fabricados nos últimos 15 anos. A platina do microscópio é computadorizada e as imagens podem ser costuradas com um computador. Essa é a lógica que levou às escolhas subjacentes à formulação do protocolo apresentado.

Conclusivamente, apresentamos abaixo uma série de etapas que fornecem uma ferida reprodutível na veia ou artéria de camundongos que, em seguida, seguindo as etapas de fixação in situ e as etapas de incorporação posteriores, podem ser visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada em escala nm e na imagem costurada visualizada em escala próxima de mm, a escala do in situ real trombo fixo. Escalabilidade desse tipo é necessária para entender a formação de trombos como um problema em hematologia / saúde e como um sistema de biologia do desenvolvimento no qual as plaquetas são o principal tipo de célula. Esses avanços oferecem uma grande virtude da microscopia eletrônica, ou seja, vê-se o que está lá, não apenas o que acende. Para um protocolo detalhado sobre a preparação de amostras para microscopia eletrônica de varredura facial em bloco serial (SBF-SEM), o leitor é direcionado para um artigo recente de Joshi et al.4.

Protocolo

Os experimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Aqui, foram usados camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas do tipo selvagem de 8 a 12 semanas de idade. Esses camundongos são adultos jovens com pouco acúmulo de gordura. Os mesmos procedimentos são aplicáveis a mutantes de camundongos para várias proteínas importantes para a hemostasia, como o fator de von Willebrand ou a glicoproteína plaquetária VI (GPVI)5,6. Todos os equipamentos, instrumentos cirúrgicos, reagentes e outros materiais utilizados são mostrados na Figura 1 e listados na Tabela de Materiais.

1. Ferida de punção da veia jugular/artéria femoral 1,7

  1. Anestesia do mouse
    1. Coloque o mouse na câmara de indução e gire o vaporizador de isoflurano para uma configuração de alta taxa de fluxo (500 mL / min, 3% de isoflurano). O isoflurano é escolhido porque tem pouco efeito no diâmetro dos vasos sanguíneos.
      CUIDADO: A exposição prolongada ao isoflurano pode causar efeitos adversos à saúde. O uso de um vaporizador de baixo fluxo, recipientes de captura de gás anestésico e boa ventilação ambiente podem reduzir bastante a exposição.
    2. Quando o mouse parecer adormecido, aperte um dos dedos do mouse para ver se o mouse reage. Nesse caso, coloque o mouse de volta na câmara de indução por alguns minutos e tente o teste de pinça novamente. Se o mouse não reagir, coloque-o em decúbito dorsal na placa de aquecimento (previamente coberta com papel alumínio).
    3. Abaixe o vaporizador para uma taxa de fluxo baixa (100 mL/min, 1,75% de isoflurano). Coloque o nariz do mouse no cone do nariz. Estenda cada membro e prenda com fita adesiva pequenos pedaços.
    4. Insira a sonda de temperatura retal e ajuste a temperatura para 37 °C no controlador de temperatura. Prenda o cabo da sonda de temperatura com fita adesiva para evitar que a sonda seja puxada acidentalmente.
  2. Incisão no rato
    1. Usando o aparador, raspe o pescoço e o peito do camundongo (para a veia jugular) ou a parte interna da perna direita (para a artéria femoral). Limpe as aparas de pele com uma compressa com álcool. Se necessário, passe por cima da área novamente com a tesoura para remover qualquer pelo restante.
    2. Limpe a área novamente com uma compressa com álcool para limpar todos os recortes. É muito importante que a área esteja o mais limpa possível. Confirme o plano cirúrgico da anestesia por meio de uma pinça no dedo do pé.
    3. Usando uma tesoura e uma pinça romba, levante e corte a pele sobre a veia jugular direita. Corte uma janela redonda na pele grande o suficiente para expor a veia jugular e parte do tecido circundante.
  3. Limpeza da veia jugular (os mesmos princípios se aplicam à artéria femoral)
    1. Usando a técnica de dissecção romba, afaste suavemente os gânglios adiposos e linfáticos, bem como o tecido conjuntivo.
      NOTA: Alguma limpeza geral ao redor do vaso ocorre nesta etapa; No entanto, uma limpeza cuidadosa e completa ocorrerá sob o microscópio depois que a veia jugular for fixada em paraformaldeído por 24 horas.
    2. Encha uma seringa de 20 ml com solução salina normal aquecida a 37 °C. Coloque a seringa na bomba de perfusão da seringa. Conecte a agulha borboleta 27G e o tubo associado à seringa.
    3. Defina a bomba de seringa para uma vazão de 0.5 mL/min. O fluxo suave de solução salina lavará o sangue da veia/artéria perfurada. Posicione o fluxo de solução salina alguns mm ao lado do local da punção, não diretamente sobre ele.
  4. Punção da veia jugular/artéria femoral
    1. Inicie o cronômetro. Obtenha uma agulha hipodérmica 30G (diâmetro nominal de 300 μm) para a veia jugular e uma agulha hipodérmica 33G (diâmetro de 200 μm) para a artéria femoral. O uso de uma agulha menor fornece apenas um tempo de sangramento um pouco mais longo para a situação arterial de pressão mais alta.
    2. Vire o chanfro para cima. Posicione a agulha em um ângulo de 25° sobre a veia jugular/artéria femoral. Observe a hora.
    3. Perfure rapidamente o recipiente, certificando-se de perfurar apenas a parte superior do recipiente. Tenha cuidado para não perfurar o fundo do vaso também. Observe o momento em que o sangramento para completamente.
    4. Aguarde o tempo adequado para obter a formação de trombos (Figura 2A) antes de iniciar a fixação da perfusão (ou seja, 1, 5, 10 ou 20 minutos para obter diferentes estágios de desenvolvimento do trombo). Eutanásia do animal por exsanguinação ou siga as diretrizes institucionais locais para a eutanásia.
  5. Realização da fixação da perfusão transcárdica
    1. Configure a bomba peristáltica antes do início da cirurgia. Coloque dois tubos cônicos de 50 mL em um rack de tubos de ensaio. Encha um tubo com solução fixadora de paraformaldeído a 4% preparada em solução tampão de cacodilato de sódio (cacodilato de sódio 0,2 M, cloreto de sódio 0,15 M em pH 7,4) para estudos de punção jugular e encha o outro tubo com solução tampão de cacodilato de sódio.
      NOTA: As condições detalhadas aqui são suficientes para o caso de baixa pressão da jugular e são então modificadas para o caso de alta pressão de uma artéria. Para os estudos do sistema de alta pressão com artérias, ou seja, a artéria femoral, o fixador de paraformaldeído é complementado com glutaraldeído a 0,1% e a fixação por gotejamento externo é combinada com fixação de perfusão.
    2. Coloque a extremidade de captação da tubulação da bomba no tubo que contém a solução tampão. Conecte uma agulha borboleta 27G com tubulação associada à extremidade de saída da tubulação da bomba e coloque a agulha em um béquer limpo.
    3. Defina a bomba peristáltica para uma vazão de 10 mL/min. Ligue a bomba de perfusão.
    4. Quando a solução tampão começar a fluir da agulha para o copo, desligue a bomba. O tubo e a agulha estão agora preparados para a perfusão transcárdica.
    5. Exponha a cavidade torácica fazendo um corte na linha média na pele da parte superior do esterno até alguns milímetros após a parte inferior do esterno usando uma tesoura de dissecação e uma pinça romba. Faça incisões transversais ao longo da base da caixa torácica, começando na linha média e cortando de medial para lateral de cada lado.
    6. Imediatamente antes de iniciar a perfusão transcárdica, abra rapidamente a caixa torácica e reflita cada lado para expor o coração.
    7. Ligue a bomba peristáltica. Coloque a ponta da agulha borboleta 27G na base do ventrículo esquerdo.
    8. Enquanto segura a agulha segura no ventrículo esquerdo, faça uma fenda na aurícula direita usando uma tesoura de dissecação afiada para permitir que o sangue e o fluido de perfusão fluam. Anote a hora no cronômetro.
    9. Perfundir com solução tampão por 3 min para eliminar o sangue do sistema circulatório. Enquanto ainda segura a agulha segura no ventrículo esquerdo, desligue a bomba peristáltica e mova a extremidade de captação do tubo da bomba peristáltica para o tubo de 50 mL que contém a solução fixadora.
    10. Anote a hora no cronômetro. Ligue novamente a bomba peristáltica e perfunda com a solução fixadora por 7 min. Desligue a bomba peristáltica.
    11. Retire a agulha do ventrículo esquerdo e coloque-a em um copo de resíduos. Coloque a extremidade de captação da tubulação da bomba em um copo de água destilada.
    12. Ligue a bomba peristáltica e deixe fluir aproximadamente 20 mL de água através da tubulação e sair a agulha 27G para o copo de resíduos para limpar a tubulação. Certifique-se de deixar toda a água sair da tubulação e da agulha antes de desligar a bomba.

2. Coleta de amostras para microscopia eletrônica

  1. Após a fixação da perfusão complementada com um fixador externo inicial de 2 min no caso de feridas de punção da artéria femoral, dissecar cuidadosamente a porção da veia jugular/artéria femoral que contém o local da punção e o trombo (Figura 2A). Com uma tesoura afiada, faça um corte diagonal na extremidade distal do segmento do vaso e faça um corte reto na extremidade proximal do segmento do vaso.
    NOTA: Fazer cortes dessa maneira ajuda a orientar o vaso mais tarde e a identificar a direção do fluxo sanguíneo no vaso.
  2. Mergulhe o segmento do recipiente em paraformaldeído fresco à temperatura ambiente a 4% em solução tampão de cacodilato de sódio (cacodilato de sódio 0,2 M, cloreto de sódio 0,15 M a pH 7,4) e coloque em temperatura ambiente por 1 h.
  3. Transferir o tecido fixo para 4 °C durante 24 h. No dia seguinte, pegue uma placa de cultura de 35 mm contendo um tapete de silicone de ~ 5 mm de espessura (preparado com antecedência de acordo com as instruções do fabricante). Despeje uma solução tampão de cacodilato de sódio suficiente no prato para submergir o segmento da veia fixa.
  4. Durante a visualização sob um microscópio óptico (ampliação de ~ 15x), transfira cuidadosamente o tecido para o prato de 35 mm contendo a solução tampão e prenda cada extremidade do vaso no tapete de silicone usando pinos de minúcia de aço inoxidável e pinças finas.
  5. Limpe cuidadosamente o segmento da veia jugular/artéria femoral usando uma microtesoura e uma pinça muito fina.
    1. Apenas para veia jugular: Remova um dos pinos e, usando a microtesoura, corte longitudinalmente a parede do vaso oposta ao local da punção/trombo. Abra suavemente o recipiente e, usando 4 a 5 pinos (cada um cortado ao meio com um alicate), prenda-o no tapete de silicone com o lado intraluminal voltado para cima.
  6. Aspire a solução tampão, substitua-a rapidamente por uma solução de paraformaldeído a 1% em solução tampão de cacodilato de sódio e tampe o prato. Não deixe o tecido secar em nenhum momento. Mantenha-o sempre submerso em fluido.
  7. Armazenar o tecido a 4 °C até ao momento de o processar para microscopia electrónica (figura 2B). Processar algumas amostras de feridas de punção da veia jugular/artéria femoral para imagem por SBF-SEM4 e outras para imagem por WA-TEM 8,9. As etapas WA-TEM são descritas em detalhes abaixo.
    CUIDADO: Realize todos os trabalhos envolvendo formaldeído, óxido de propileno, OsO4 e 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) em uma capela de exaustão química. Estes são produtos químicos perigosos. A exposição ao OsO4 pode causar cegueira e morte.
    NOTA: Todos os volumes de enxágue e mancha são pelo menos 2x o volume da amostra. A solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pode ser substituída pelo tampão cacodilato de sódio 0,1 M. Durante o procedimento de fixação, é muito importante nunca deixar as amostras secarem, pois isso afetaria significativamente a ultraestrutura. Use tubos de polipropileno.

3. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada (WA-TEM)

NOTA: Esta etapa representa um ponto de decisão no qual o investigador está se comprometendo a se preparar para o WA-TEM. Este procedimento preparativo não suporta SBF-SEM. Para o volume EM de SBF-SEM, toda a coloração deve ser feita antes de ser incorporada em plástico. Consulte4 para obter um protocolo de preparação SBF-SEM.

  1. Lave a amostra de tecido no prato de 35 mm 2x com solução salina balanceada de Hank (HBSS) ou PBS em temperatura ambiente (RT). Mantenha a amostra fixada, permitindo rastrear a orientação da amostra por meio dessas etapas preparativas.
  2. Fixe com 0,8 mL de 0,05% de verde malaquita / 2,5% de glutaraldeído / 0,1 M de cacodilato de sódio (pH 6,7 - 7,0) por 20 min no gelo.
  3. Remova o fixador e lave a amostra 4x por 5 min cada com cacodilato de sódio 0,1 M. Remova o cacodilato de sódio 0,1 M.
  4. Sufixo com 0,8 mL de 0,8% K3Fe(CN)6 ou K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 em 0,1 M de cacodilato de sódio. Coloque uma tampa sobre o prato para manter a luz do lado de fora (OsO4 é sensível à luz). Manchar por 20 min a 1 h em RT.
  5. Remova o OsO4 e enxágue 4x por 5 min cada com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Remova o tampão de cacodilato de sódio e core com ácido tânico a 1% por 20 min no gelo.
  6. Remova o ácido tânico e lave por 5 min com tampão de cacodilato de sódio 0.1 M 1x e 2x por 5 min cada com água destilada de grau molecular (DI).
  7. Corar com acetato de uranilo (UA) a 0,5% durante 1 h RT ou durante a noite a 4 °C no escuro.
  8. Remova o acetato de uranila e enxágue 5x por 5 min cada com água destilada de grau molecular. Antes da última lavagem e enquanto a amostra ainda estiver submersa em água DI, corte o tapete de silicone ao redor da amostra fixada com uma lâmina de barbear. Levante este pequeno pedaço de tapete de silicone da placa e coloque-o em um tubo de polipropileno.
    NOTA: É importante que a amostra permaneça presa à peça de silicone enquanto estiver no tubo. A mudança para tubos de polipropileno nesta etapa é necessária porque o óxido de propileno usado nas etapas subsequentes degradará o poliestireno das placas de 35 mm.
  9. Após remover o último tampão, enxágue brevemente 1x com etanol a 25%. Descarte o etanol a 25% e incube com etanol a 25% por 3 min no gelo.
  10. Remova o etanol a 25%. Enxágue brevemente 1x com etanol a 50%. Descarte o etanol a 50% e incube com etanol a 50% por 3 min no gelo.
  11. Remova o etanol a 50% e enxágue brevemente 1x com etanol a 75%. Descarte o etanol 75% e incube com etanol 75% por 3 min no gelo.
  12. Remova o etanol a 75% e enxágue brevemente 1x com etanol a 95%. Descarte o etanol a 95% e incube com etanol a 95% por 3 min no gelo.
  13. Retire o etanol a 95% e lave 3x, pelo menos 10 min de cada vez, com etanol a 100% (prova 200). Remova o etanol 100% e adicione óxido de propileno (PO). Enxágue 3x pelo menos 10 min cada, com PO.
  14. Prepare a mistura de resina conforme descrito abaixo.
    1. Aqueça os componentes de resina a 60 °C para liquefazer totalmente. Misture bem 12,5 mL de Embed-218, 7,5 mL de Araldite 502 e 27,5 mL de DDSA em um tubo de 50 mL a 60 ° C. Esta mistura pode ser conservada durante 6 meses a 4 °C. Aqueça-o a 60 °C antes de usar. Alíquota a quantidade necessária antes do uso.
  15. Incorpore os exemplos conforme descrito abaixo.
    1. Coloque uma alíquota da mistura de resina em um tubo e adicione 20 μL / mL de ativador DMP-30. Misturar bem rodando a 60 °C; a cor deve escurecer.
    2. Diluir esta alíquota de resina activada em 50% em PO e deixar que a resina e o PO se misturem completamente.
    3. Remova o último enxágue PO do sample contendo tubo e substitua-o pela mistura de 50% de resina / PO, quase enchendo o tubo completamente. Gire a amostra durante a noite em temperatura ambiente.
    4. No dia seguinte, misture uma nova alíquota de resina (1 mL por amostra) com 20 μL/mL de DMP-30.
  16. Coloque a amostra em um prato de polipropileno com um pequeno volume de mistura de resina / PO a 50% do tubo de amostra sob um microscópio de dissecação (ampliação de ~ 6x) e retire cuidadosamente os pinos do tecido. Transfira apenas o tecido para outra placa de polipropileno contendo uma pequena quantidade de resina 100% com um ativador DMP-30.
  17. Encha um molde de incorporação de silicone com a resina 100% com o ativador DMP-30 e coloque cuidadosamente a amostra no molde. Coloque o molde no forno e leve ao forno a 60 °C por pelo menos 48 h. A amostra preparada é mostrada na Figura 2B.
  18. Realize imagens de microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada (WA-TEM) conforme descrito em10,11. Veja a Figura 3 para uma representação do processo que vai de uma punção inicial a um trombo de 1 minuto renderizado tridimensionalmente. A inclusão de um protocolo detalhado para imagens de microscopia eletrônica WA-TEM montada não está incluída aqui e está além do escopo dos presentes protocolos de preparação de amostras.
    NOTA: WA-TEM é uma capacidade subestimada da maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão modernos com platina computadorizada. O software shareware que suporta essas funções10,11 está disponível no grupo do Dr. David Mastronarde, da Universidade do Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Resultados

Quantificação dos efeitos da droga no tempo de sangramento da ferida perfurocortante
Os tempos de sangramento da ferida por punção fornecem um modelo fisiológico de risco de droga que pode ser prontamente realizado em camundongos. Os resultados que vêm de um experimento de ferida de punção são preditivos. Aqui, mostramos uma curva de sangramento dose-resposta do dabigatrano. A dabigatrana, um inibidor da trombina, é usada como anticoagulante oral de ação direta, o chamado DOAC12. O modelo de ferida de punção da veia jugular foi usado para avaliar o risco inerente a diferentes doses de dabigatrana por meio de sangramento prolongado potencial por meio da formação tardia de trombos em camundongos. Uma dose variável de 15, 50 ou 150 μg/kg de dabigatrana foi administrada por via intravenosa (i.v.) 20 minutos antes da punção da veia jugular. Mostramos as médias do tempo de sangramento em várias concentrações de dabigatrana (Figura 4). Ao nível da dose, observa-se um prolongamento significativo do tempo de sangramento, p <0,051. Isso indica um fator de risco significativo no uso da droga em humanos. Experimentalmente, a droga nessas doses tem um efeito significativo na ultraestrutura do trombo em formação.

Avaliação do estado de ativação plaquetária em um trombo de ferida por punção
A abordagem WA-TEM fornece uma visão geral de uma área da ferida em um único plano quando vista em menor ampliação e muitos detalhes em maior ampliação (Figura 5). Os detalhes obtidos podem ser colocados diretamente no contexto da visão geral. Usamos essa abordagem para avaliar o recrutamento de plaquetas em forma de discoide para um trombo de ferida de punção. As plaquetas circulantes são discóides, daí o nome, e contêm um conjunto completo de grânulos secretores. Uma questão-chave tem sido como as plaquetas circulantes podem ser recrutadas para o trombo em crescimento sem perturbar as propriedades de fluxo livre das plaquetas restantes. Nosso trabalho aponta para uma hipótese Tether e Activate na qual as plaquetas circulantes são recrutadas para o trombo, uma a uma, por meio de um processo de amarração como plaquetas discóides contendo um conjunto completo de organelas2. A evidência para isso vem do WA-TEM de trombos da veia jugular 1 min após a punção. Após a secção para produzir fatias completas de trombo do meio da ferida ainda sangrando, fotografamos 500-800 quadros, 4.000 por 4.000 pixels, tamanho de pixel de 3,185 nm em uma grade raster XY retangular em toda a dimensão do trombo em seção transversal usando um estágio automatizado e um microscópio eletrônico de transmissão usando o software SerialEM10. Os quadros foram então costurados usando o software eTomo, parte do conjunto de programas IMOD11. Isso resulta em uma única imagem de tamanho variável, por exemplo, 120.000 pixels por 90.000 pixels que são tela cheia com zoom baixo, 0,02, ou em detalhes com zoom mais alto, 0,25 a 1,0 usando o software 3DMOD, novamente uma parte do conjunto de programas IMOD (Figura 5). Na rede, a análise orientada por software descobriu que as plaquetas discóides associadas ao trombo e ligadas perifericamente dentro do orifício de punção foram espaçadas como contas em uma corda. A uma curta distância dentro do trombo, a forma discóide era menos distinta e as plaquetas estavam mais fortemente associadas umas às outras. Mais profundamente dentro do trombo, as plaquetas eram arredondadas, bem compactadas e parcialmente degranuladas. Uma sequência de morfologia sugeriu a ligação inicial das plaquetas ao trombo por meio de uma molécula de longa ligação, provavelmente fator de von Willebrand, e que quaisquer outras etapas de ativação plaquetária estavam restritas ao interior do trombo em formação. Assim, o recrutamento de plaquetas para o trombo pode ocorrer sem perturbar a circulação do sangue dentro da veia jugular.

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Figura 1: Configuração cirúrgica para realizar um experimento de trombo de ferida por punção da veia jugular/artéria femoral. O equipamento cirúrgico (A) e os instrumentos (B) são cuidadosamente organizados para eficiência do movimento, uma vez que o tempo é crítico durante o experimento. (C) Após a fixação da perfusão, a porção do vaso que contém o trombo da ferida puncionada é fixada a um tapete de silicone em uma placa de cultura de 35 mm durante a visualização ao microscópio óptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Indo de um vaso sanguíneo para amostras de plástico incorporadas que serão seccionadas para WA-TEM ou SBF-SEM. (A) Uma artéria femoral com uma ferida de punção e formação de trombo extravascular acumulada (círculo e seta) é mostrada. (B) Um trombo (círculo e seta) é embutido em plástico para seccionamento para WA-TEM com um micrótomo para imagens 2D subsequentes. (C) Um trombo (círculo e seta) é embutido em plástico, aparado para dar uma vara curta, menor que 1 mm, para fixação a um pino dentro de uma câmara de imagem SBF-SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Ferida de punção para formação de trombo: Um esquema do fluxo preparativo de uma ferida de punção (A) para uma fatia de imagem de um trombo de veia jugular pós-punção de 1 minuto (B). A parede do vaso é rotulada em azul na fatia da imagem, os pequenos pontos pretos próximos à parede do vaso são glóbulos vermelhos e os agregados plaquetários do trombo aparecem como áreas cinza-escuras. Esta figura foi modificada de1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Um exemplo de dados, em forma de gráfico, gerados em um experimento de ferida de punção da veia jugular. Uma curva de sangramento dose-resposta do dabigatrano é mostrada. Esta figura foi modificada de1. As médias de tempo de sangramento em várias concentrações de dabigatrana são mostradas junto com barras de erro indicando mais ou menos desvio padrão. A análise estatística usando o teste t de Student indicou um valor de p de <0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Imagens WA-TEM de uma fatia costurada para formar uma montagem. (A) Quadros individuais de alta resolução são coletados e depois costurados com o objetivo de colocar recursos em um contexto maior. (B) Ao aumentar o zoom, detalhes importantes podem ser destacados no contexto (poli: leucócitos polimorfonucleares, endo: endotélio e col: fibras de colágeno). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Apresentamos um procedimento detalhado de punção para produção de trombos hemostáticos em veias jugulares e artérias femorais, sua fixação de perfusão in situ e processamento de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada. Os procedimentos gerais são úteis para gerar trombos hemostáticos para análise ultraestrutural e para comparar tempos de sangramento em camundongos experimentais, por exemplo, camundongos tratados com diferentes tipos e dosagens de produtos farmacêuticos. Também é útil para comparar os tempos de sangramento em camundongos do tipo selvagem de controle com os tempos de sangramento em camundongos knockout (ou seja, nocautes para várias glicoproteínas em plaquetas que interagem com ligantes adesivos) e subsequente microscopia eletrônica de alta resolução. O protocolo pode ser prontamente adaptado à análise de imunofluorescência como leitura primária com a perda de características que tornam a microscopia eletrônica uma escolha forte. Por outro lado, a imunofluorescência é uma ferramenta primordial para localizar proteínas dentro de uma estrutura. Como acontece com qualquer protocolo técnico, existem algumas etapas que são mais críticas do que outras e há etapas dentro do protocolo que podem ser tratadas como pontos de escolha importantes para a análise subsequente.

As etapas críticas, os pontos de escolha para análise subsequente e as limitações são descritos a seguir. A etapa real da punção da agulha: A ferida de punção é feita com uma agulha de seringa mantida em um ângulo de 25° em relação à veia ou artéria. Isso minimiza a chance de perfuração em ambos os lados da veia ou artéria. Um ângulo de 90°, por outro lado, maximiza as chances de não raspar a camada endotelial intravascular ou danificar a matriz de colágeno extravascular na parte externa do vaso sanguíneo, mas acarreta um risco maior de perfurar ambos os lados da veia ou artéria. A escolha é de experiência, mãos e confiança.

A fixação primária aqui é feita com paraformaldeído perfundido, uma pequena molécula contendo um único grupo aldeído reativo. Por conter um único grupo quimicamente reativo, o paraformaldeído tem pouca tendência a reticular componentes celulares e pouca tendência a destruir a antigenicidade e, portanto, em suma, é considerado um fixador comparativamente fraco do glutaraldeído, um fixador comum para microscopia eletrônica, que contém dois aldeídos reativos e, portanto, produz muito mais reticulação molecular13. Este é um degrau in situ projetado para preservar a estrutura. As etapas de perfusão limpam os glóbulos vermelhos não presos ao trombo da preparação. Isso dá uma preparação livre da maioria dos glóbulos vermelhos e facilita o foco nas propriedades plaquetárias. Exploramos o uso de fixação in situ com uma mistura de glutaraldeído/paraformaldeído aplicada extravascularmente. Este procedimento é eficaz, particularmente em uma situação de alto fluxo/pressão. No entanto, ele fixa os glóbulos vermelhos circulantes no lugar. Isso pode complicar a análise de segmentação subsequente de micrografias eletrônicas para a forma e composição dos agregados plaquetários que formam o trombo da ferida de punção. O uso de glutaraldeído complica muito os procedimentos alternativos de imunofluorescência devido ao alto nível de autofluorescência gerado pelo fixador.

A fixação / dispersão do vaso sanguíneo fixo em uma almofada de silicone é crucial para localizar o trombo para fins de incorporação. Nesta etapa, a orientação da amostra em relação ao fluxo sanguíneo é rastreada e conhecida para as etapas subsequentes. O orifício de punção e o trombo formado podem ser facilmente localizados no vaso sanguíneo aberto. Em contraste, o trombo é difícil de encontrar em vasos sanguíneos intactos e excisados. Isso seria especialmente verdadeiro em uma amostra rica em glóbulos vermelhos circulantes fixos. Ser capaz de rastrear onde a agulha no palheiro está localizada é crucial.

Após a abertura do vaso sanguíneo e a fotografia de onde o trombo formado, orifício de punção, está localizado apresenta um ponto de escolha. No protocolo geral, as etapas subsequentes apresentadas são específicas para preparar a amostra para WA-TEM. Nesta etapa, outras escolhas de protocolo podem ser feitas. Por um lado, a amostra pode ser processada para microscopia de imunofluorescência em vez de microscopia eletrônica. Por outro lado, a amostra pode ser processada para microscopia eletrônica de varredura de face de bloco serial (SBF-SEM ou outra abordagem de microscopia eletrônica de volume) em vez de WA-TEM. As etapas de processamento para SBF-SEM são decididamente diferentes porque, para se preparar para este procedimento, todas as etapas de coloração de metais pesados para microscopia eletrônica devem ser feitas pré-incorporação4.

As etapas de coloração de metais pesados neste protocolo são projetadas para destacar membranas versus ribossomos e cromossomos, complexos biológicos ricos em ácido nucléico. Outros protocolos de coloração de metais pesados podem ser usados, por exemplo, Storrie e Attardi14 e Liu et al.15.

A atenção às diferenças nas veias e artérias é importante. A maior pressão da artéria em relação à veia deve ser compensada16,17. Por exemplo, uma agulha de menor diâmetro é usada para produzir a ferida da artéria femoral versus a ferida jugular. Isso compensa a pressão mais alta, dando um tempo de cessação do sangramento quase igual. No procedimento de punção da veia jugular, é dada preferência ao uso de paraformaldeído como fixador em condições hipertônicas, pois o paraformaldeído, como um pequeno fixador único contendo aldeído, age rapidamente, mas é um fixador fraco que tende a deixar a antigenicidade intacta. Isso significa que os protocolos descritos aqui podem ser complementados por estudos de localização mediados por anticorpos no nível do microscópio óptico ou eletrônico18,19. No caso da ferida de punção da artéria femoral, o glutaraldeído, um fixador de reticulação mais forte, é usado em conjunto com o paraformaldeído em um tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4, para estabilizar e fixar trombos arteriais. Essa modificação é necessária para compensar a pressão arterial mais alta de uma artéria em relação a uma veia. No caso arterial, a concentração de cacodilato de sódio é a metade da concentração utilizada na solução fixadora de trombos da veia jugular.

O procedimento de processamento de amostras para microscopia eletrônica apresentado aqui é adaptado ao WA-TEM e fornece informações de microscopia eletrônica de volume limitado. O WA-TEM produz uma série limitada de imagens de alta resolução, com tamanho de pixel de 3,185 nm ou menor, em seções transversais de trombos completos paralelas ou perpendiculares ao fluxo1. Uma combinação de facas de vidro e diamante é usada para produzir manualmente uma série de seções transversais a uma estimativa de 10%, 25%, 50%, 75% e 90% no trombo. Alcançar seções transversais completas de trombos requer imagens de centenas de quadros com uma câmera de qualidade de microscópio eletrônico de 4.000 x 4.000 pixels. As molduras são então costuradas. São necessários cerca de 400 a 800 quadros para obter uma imagem de seção transversal completa. O WA-TEM pode ser complementado pelo SBF-SEM. O SBF-SEM produz uma série de imagens sequenciais da face do bloco à medida que é progressivamente cortada em pequenos passos com uma faca de diamante dentro do vácuo da câmara de imagem SEM1. Essas imagens podem ser reunidas para fornecer uma renderização tridimensional completa do trombo em formação. Como o micrótomo está dentro da câmara de imagem SEM, todas as etapas de coloração para SBF-SEM devem ser feitas pré-incorporação. A combinação dessas duas abordagens de microscópio eletrônico permite obter imagens com resolução de ~ 3 nm ou mais em um número limitado de seções transversais, WA-TEM, ou em toda a profundidade do trombo de ferida de punção de tamanho quase milimétrico, SBF-SEM. A visualização das imagens WA-TEM costuradas no software 3DMOD10 permite a manipulação rápida entre vários níveis de zoom, de modo que mesmo visualizações de alta resolução possam ser colocadas em contexto dentro da seção transversal total da largura do trombo.

Em conclusão, apresentamos um protocolo comprovado para a produção de trombos de punção em camundongos, fixando-os in situ e processando-os para microscopia eletrônica de forma que o trombo possa ser facilmente localizado dentro da veia ou artéria e sua orientação em relação ao fluxo sanguíneo traçado. Vários pontos de decisão são apresentados para que o usuário possa fazer escolhas sobre como as amostras serão analisadas. Nós nos concentramos na preparação para microscopia eletrônica que destaca as membranas versus outros componentes da célula. No final, a parte do protocolo que é mais geral para outras investigações é a apreciação pelos autores de que a microscopia eletrônica de transmissão de área ampla (WA-TEM) é uma abordagem de montagem que suporta o conhecimento em nanoescala de células, ou seja, plaquetas dentro de uma grande estrutura, tamanho próximo ao milímetro, aqui o trombo em formação. A capacidade resultante de colocar detalhes dentro do contexto geral é a força central da combinação das várias etapas em um procedimento completo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este estudo.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos colegas da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas (Jerry Ware e Sung W. Rhee), da Universidade da Pensilvânia (Tim Stalker e Lawrence Brass), da Universidade de Kentucky (Sidney W. Whiteheart e Smita Joshi) e do Instituto Nacional de Bioimagem e Bioengenharia dos Institutos Nacionais de Saúde (Richard D. Leapman e Maria A. Aronova) com quem aprendemos muito. Os autores expressam gratidão à American Heart Association e ao National Heart Lung and Blood Institute dos National Institutes of Health (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 ao BS e subprêmios do NIH concede R01 HL146373 e R35 HL150818) pelo apoio financeiro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% Solução salina normalMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint conjunto de veias do couro cabeludoMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint agulhas hipodérmicasMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint agulhas hipodérmicas especiaisMedlineNDA26393
50 mL Tubos cônicosFisher Scientific06-443-20
Almofadas de Preparação de Álcool (70% Álcool Isopropílico)de Alumínio MDS090670ZMedline
Fisher Scientific01-213-100
Placa de Aquecimento AnimalPhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Microscopia Eletrônica Sciences10900
Axiocam 305 Câmera de Microscopia Colorida R2Carl Zeiss426560-9031-000
Seringas BD Luer-Lok, 20 mLMedlineB-D303310Z
Fisher ScientificC79-500
Placas de Cultura de Células 35mm x 10mmCorning Inc.Aplicadores com
ponta de algodão430165 MedlineMDS202055H
DMP-30 AtivadorMicroscopia Eletrônica Sciences13600
Dodecenil Anidrido Succínico / DDSAMicroscopia Eletrônica Sciences13700
Pinça de Curativo, 5", curva, serrilhada, ponta estreitaPinça de Curativo Integra Miltex6-100
, 5", padrão, serrilhadoIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinaMicroscopia Eletrônica Sciences14900
Álcool Etílico, anidro 200 provaMicroscopia Eletrônica Sciences15055
Rack de Tubo de 4 Vias Fisherbrand FisherScientific03-448-17
Temporizador Digital FisherbrandFisher Scientific14-649-17
Bomba de Infusão de Seringa Única Fisherbrandde Gaze 7801001Fisher Scientific
2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
Glutaraldeído (Solução a 10%)Microscopia Eletrônica Sciences16120
Isoflurano Anestesia Inalante Líquida, 100 mLMedline66794-017-10
Estilo Joalheiro Micro-Fino Fórceps, Estilo 5FIntegra Miltex17-305Precisa de 2 pares.
Tubo de Bomba L/S, Silicone, L/S 15; 25 FtVWRMFLX96410-15
L-Ácido AspárticoFisher ScientificBP374-100
Nitrato de ChumboFisher ScientificL-62
Malaquita Verde 4Cabeça
Masterflex L/S Easy-Load IIVWRMFLX77200-62
Cortador de Fio Masterflex L/S Variable SpeedDigital Drive VWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" FisherScientific50-191-9855
Tetróxido de Ósmio 4% Solução AquosaCiências de Microscopia Eletrônica 19150
Paraformaldeído (Solução de 16%)Controlador
Physitemp InstrumentsTCAT-2LV
Ferrocianeto de potássioSigma-AldrichP-8131
Óxido de propileno, Ciências deMicroscopia Eletrônica20401
Copos de Vidro PyrexSonda deFisher Scientific 02-555-25B
para RatosPhysitemp InstrumentsRET-3
Fita Invisível Scotch Magic, 3/4" x 1000"3M Company305289
Tampão de Cacodilato de Sódio 0.2M, pH 7.4Microscopia Eletrônica Sciences11623
SomnoFlo Vaporizador Eletrônico de Baixo FluxoKent ScientificSF-01
SomnoFlo Kit Inicial para RatosKent ScientificSF-MSEKIT
Pinos Minutien de AçoInoxidável Fine Science Ferramentas26002-10
Estereomicroscópio steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopia495015-9880-010
Sylgard 184 Elastômerode Silicone World Precision InstrumentsSYLG184tapete de silicone
Microscopia EletrônicaÁcido Tânico21700
Tiocarbohidrazida (TCH)Sigma-Aldrich88535
Microscopia EletrônicaSciences 22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Pinça de Curativo para Olhos Von Graefe, 2.75", Curvada, SerrilhadaIntegra Miltex18-818 Precisa de2 pares.
Wagner TesouraFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Aparador de AnimaisBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopia410135-1001-000
Folha Cloreto de Cálcio Esponjas de Bomba de Temperatura Physitemp da Sciences 15710 de Reagente ACS Temperatura Retal de Ciências de Acetato de Uranila

Referências

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