O presente protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX) usando tecido de osteossarcoma humano.
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Artigo de método
Estabelecimento de modelo de camundongo xenoenxerto derivado de pacientes com tecidos de osteossarcoma humano
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O osteossarcoma é o tumor ósseo maligno primário mais comum em crianças e adolescentes. Apesar do desenvolvimento de novos planos de tratamento nos últimos anos, o prognóstico para pacientes com osteossarcoma não melhorou significativamente. Portanto, é crucial estabelecer um modelo pré-clínico robusto com alta fidelidade. O modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preserva fielmente as características genéticas, epigenéticas e heterogêneas das malignidades humanas para cada paciente. Consequentemente, os modelos PDX são considerados modelos in vivo autênticos para estudar vários tipos de câncer em estudos de transformação. Este artigo apresenta um protocolo abrangente para criar e manter um modelo de camundongo PDX que espelha com precisão as características morfológicas do osteossarcoma humano. Isso envolve o transplante imediato de tecido de osteossarcoma humano recém-ressecado em camundongos imunocomprometidos, seguido de passagem sucessiva. O modelo descrito serve como uma plataforma para estudar o crescimento, resistência a drogas, recidiva e metástase do osteossarcoma. Além disso, auxilia na triagem da terapêutica alvo e no estabelecimento de esquemas de tratamento personalizados.
Introdução
O osteossarcoma é uma malignidade óssea primária derivada de células do lobo interósseo e é mais comum em adolescentes e crianças. Ocorre frequentemente na epífise da diáfise longa e é caracterizada por alta malignidade, metástase precoce e mau prognóstico 1,2. A metástase pulmonar é a principal causa de morte em pacientes com osteossarcoma. A taxa de sobrevida em 5 anos de pacientes com osteossarcoma não metastático é de 65% a 70%3. No entanto, nos últimos 40 anos, a taxa de sobrevida em 5 anos (apenas 20%) dos pacientes com osteossarcoma metastático não melhorou significativamente, e 25% dos pacientes com osteossarcoma apresentam metástases no momento do diagnóstico4. Atualmente, as drogas de primeira linha para o tratamento do osteossarcoma chegaram a um consenso, mas ainda existem diferenças significativas no esquema quimioterápico e no tempo de tratamento5. É importante realizar experimentos pré-clínicos baseados em modelos animais apropriados para obter regimes de quimioterapia mais eficazes.
Atualmente, os modelos comumente usados para experimentos pré-clínicos de osteossarcoma incluem cultura de células in vitro baseada em linhagem celular e xenoenxertos derivados de células in vivo (CDX), bem como xenoenxertos derivados de pacientes (PDX)6,7.
As linhagens celulares são convenientes para cultura e uso em estudos in vitro , ou para transplante em camundongos imunodeficientes para estabelecer modelos de CDX8. No entanto, as linhagens celulares cultivadas in vitro podem não refletir com precisão a heterogeneidade das malignidades e as características individuais dos pacientes devido a possíveis mutações que ocorrem para se adaptar ao ambiente de cultura in vitro durante passagens repetidas. Além disso, eles não possuem o microambiente e o sistema imunológico necessários para o crescimento e desenvolvimento do tumor in vivo. Embora os modelos de CDX ofereçam algumas vantagens sobre a cultura de células in vitro , eles ainda podem não refletir totalmente as características individuais dos pacientes com osteossarcoma, embora os tecidos tumorais obtidos a partir de modelos de CDX tenham heterogeneidade intratumoral e representação do sistema imunológico limitadas em comparação com as linhagens celulares cultivadas in vitro9. Portanto, estabelecer um modelo pré-clínico com alta fidelidade é crucial.
Os modelos PDX envolvem o transplante imediato de tecidos cancerígenos humanos recém-ressecados em camundongos imunodeficientes. Esse método permite a preservação fiel das características genéticas, epigenéticas e heterogêneas das neoplasias malignas humanas para cada paciente, mesmo após passagens sucessivas em camundongos. Além disso, os modelos PDX são conhecidos por prever com precisão resultados clínicos posteriores10, tornando-os ferramentas valiosas para a criação de tratamentos individualizados e o avanço da pesquisa em medicina de precisão11.
Este trabalho descreve o procedimento para estabelecer um modelo PDX em camundongos imunodeficientes por meio do transplante de tecido de osteossarcoma humano. Esses modelos servem como plataformas para a realização de experimentos pré-clínicos para osteossarcoma.
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Protocolo
Todos os estudos envolvendo tecidos humanos foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética Institucional do Hospital Longhua, afiliado à Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (Xangai, China) (2013LC52), e o consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque. O número IACUC para este estudo em animais é PZSHUTCM221017013. Camundongos CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl machos com quatro semanas de idade receberam dieta para roedores irradiados com leão duplo GB 14924.3 e água estéril, e foram alojados em gaiolas de camundongos IVCs com cinco camundongos por gaiola, sob condições de FPS com um ciclo claro/escuro de 12 horas. A Tabela de Materiais inclui informações detalhadas sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Preparação do tecido de osteossarcoma humano
NOTA: Neste estudo, o tecido do osteossarcoma humano foi ressecado12 da lesão do fêmur de um paciente com osteossarcoma de 15 anos antes da quimioterapia.
- Armazene imediatamente o tecido de osteossarcoma recém-ressecado em uma solução protetora de tecido para maximizar a preservação da ativação das células do osteossarcoma após o enxágue com solução salina fisiológica estéril.
NOTA: Os tecidos de osteossarcoma recém-ressecados devem ser transplantados para camundongos o mais rápido possível. Eles podem ser armazenados na solução protetora tecidual por no máximo 24 horas antes do transplante. Os tecidos de osteossarcoma usados para modelagem devem ser de pacientes que não receberam quimioterapia. A atividade das células tumorais de pacientes que receberam quimioterapia será pobre, levando à falha no estabelecimento do modelo e perda de alta fidelidade. - Transfira os tecidos de osteossarcoma recém-ressecados armazenados na solução protetora tecidual para o laboratório o mais rápido possível.
- Preparar instrumentos e materiais experimentais para o estabelecimento do modelo PDX: bisturis (Figura 1A); pinça oftálmica (Figura 1B,C); tesoura oftálmica (Figura 1D); agulha de sutura (Figura 1E); linha de sutura (Figura 1F); porta-agulha reto (Figura 1G); caneta de marcação (Figura 1H).
NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam esterilizados em autoclavagem antes do uso. - Enxágue os tecidos do osteossarcoma duas vezes com soro fisiológico estéril pré-resfriado em um capuz estéril.
- Remova áreas do tecido osteossarcoma com sangramento e necrose.
- Corte o tecido de osteossarcoma limpo em 3 mm3 pedaços com um bisturi em uma placa de cultura contendo solução salina fisiológica estéril pré-resfriada e mantenha-o no gelo.
2. Estabelecimento de modelos PDX por transplante de tecido de osteossarcoma na região do flanco de camundongos
- Administrar analgesia pré-operatória de meloxicam (5 mg/kg/24 h) por injeção subcutânea em ratinhos e colocar os ratinhos nus em campos cirúrgicos estéreis. Forneça suporte térmico durante todo o procedimento.
- Induza a anestesia em camundongos, expondo-os a 3% de isoflurano e 97% de oxigênio. Depois que os camundongos estiverem completamente anestesiados, transfira-os para o cone do nariz e mantenha a anestesia com isoflurano a 1,5% e oxigênio a 98,5%.
- Aperte os dedos dos pés para garantir que os ratos estejam completamente anestesiados e espere mais tempo se ainda houver espasmos ou reações convulsivas.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados com equipamento estéril em capuz estéril. Evite o ressecamento dos camundongos durante a anestesia, aplicando pomada oftálmica nos olhos. - Prenda o mouse em decúbito lateral (Figura 2A). Desinfete um lado da região do flanco do camundongo para transplante de tecido de osteossarcoma 3 vezes com rodadas alternadas de iodopovidona e bolas de algodão desinfetante com etanol a 70%.
NOTA: A desinfecção cirúrgica é realizada em um padrão circular, começando no centro e espiralando para fora. - Marque o local da incisão cirúrgica na pele com um marcador.
- Faça uma incisão de 5 mm da pele aos tecidos subcutâneos com bisturi (Figura 2B).
- Levante a pele do lado superior da margem da incisão com uma pinça oftálmica usando a mão esquerda e faça a dissecção romba para cima sob a derme dos camundongos com um porta-agulha reto usando a mão direita (Figura 2C).
- Segure a pele da parte superior da incisão com a pinça oftálmica usando a mão esquerda e coloque o tecido do osteossarcoma sob a pele aproximadamente 5 mm acima da margem da incisão com uma pinça oftálmica usando a mão direita para transplantar o tecido do osteossarcoma (Figura 2C).
NOTA: Certifique-se de que o tecido do osteossarcoma seja transplantado logo abaixo da derme da pele. A dissecção romba é realizada com uma pinça de dissecção reta e romba, como um porta-agulha reto, para evitar penetrar na cavidade torácica do camundongo enquanto encontra a camada dérmica da pele do camundongo. - Suturar a incisão com sutura absorvível com 2-3 pontos para uma incisão de 5 mm (Figura 2D).
- Retorne os camundongos para gaiolas limpas e monitore-os até que se recuperem completamente da anestesia.
NOTA: O PDX estabelecido pelo transplante do tecido do osteossarcoma humano é designado como passagem 0 (P0), o PDX estabelecido pelo transplante do tecido PDX em P0 é designado como passagem 1 (P1), seguido por P2 e P3.
3. Coleta de tecidos tumorais PDX
- Meça o volume do tumor uma vez por semana. Quando o tamanho do tumor atingir 1500 mm3, eutanasiar os camundongos usando o método de luxação cervical após a inalação de CO2 . Os desfechos humanos incluem ulceração tumoral ou problemas com a mobilidade dos membros anteriores.
NOTA: Meça o diâmetro longo (a) e o diâmetro curto (b) do tumor usando um paquímetro. Calcule o volume do tumor (V) usando a fórmula: V = 1/2 × a × b2. - Posicione o camundongo lateralmente para expor o tumor e desinfete a pele no local do tumor com uma bola de algodão embebida em álcool.
- Use uma tesoura oftálmica para separar todo o tumor. Pese a massa tumoral usando uma balança eletrônica.
4. Exame patológico de tecidos clínicos primários e tumorais PDX
- Fixe os tecidos tumorais13 em um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de formalina tamponada neutra a 10% por 24 h. Enxágue bem os tecidos tumorais com água corrente para remover o fixador.
- Desidrate e incorpore os tecidos tumorais em parafina14.
- Corte os tecidos tumorais e faça o exame histológico de rotina15.
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Resultados
Este protocolo descreve o procedimento detalhado para estabelecer um modelo de camundongo PDX, preservando as características morfológicas do osteossarcoma humano após o transplante imediato de tecido de osteossarcoma humano recém-ressecado e passagens sucessivas em camundongos. Aqui, um modelo de camundongo PDX foi estabelecido com sucesso usando tecido de osteossarcoma humano.
A Figura 3A mostra um camundongo representativo de PDX em P0, dois meses após o transp...
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Discussão
Os modelos PDX podem simular as características dos cânceres humanos e manter mais semelhança com o tumor primário, incluindo alterações genéticas e genômicas, histologia, heterogeneidade e perfil de expressão gênica 16,17,18,19. Portanto, eles preservam os fenótipos moleculares e genótipos de pacientes com câncer, fornecendo abordagens inovadoras para estudar ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por doações de (1) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (2) Projeto de construção do Centro de Pesquisa de Alta Prioridade de Xangai (2022ZZ01009); (3) Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600); (4) Centro de Inovação Colaborativa de Xangai de Transformação Industrial da Preparação da MTC Hospitalar e (5) Projetos de Pesquisa dentro do Orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução neutra de formalina a 10% | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Fixe os tecidos |
| Autoclave | Japão Hiryama Company | HVE-50 | Instrumentos cirúrgicos de esterilização |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | |
| Paquímetro | Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Meça o volume do tumor |
| Prato (60 mm) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Amostra de amostra durante o transplante |
| Bolas de algodão desinfetante | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Desinfetar a pele de camundongos |
| Luvas estéreis descartáveis | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Operação estéril |
| Leão duplo irradiado dieta para roedores Suzhou | Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. | GB 14924.3 | Balança eletrônica de alimentação animal |
| Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Pese o peso do tumor | |
| Eosin | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Hematoxilina eosina corante |
| Hematoxilina | Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | Hematoxilina eosina corante |
| Isoflurano | Shenzhen RWD Vida Technology Co., Ltd | VETEASY | Anestesia com camundongos |
| Gaiola de camundongos IVCs | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | de marca de barreira animal |
| Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Marque a incisão cirúrgica | |
| Microscópio óptico Olympus | Japonês Empresa | BH20 | Fatias de tecido |
| de varredura Pomada oftálmica | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | Evite olhos secos de camundongos durante a anestesia |
| Tesoura oftálmica | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Corte a pele |
| Pinças oftálmicas | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Segure tecidos de osteossarcoma durante o transplante |
| Parafina | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | enterrado da parafina do tecido do osteossarcoma |
| Lyca Microsystem (Shanghai) que troca Co., Ltd. | RM2235 | Osteossarcoma seção de tecido | |
| fisiológico | solução salina Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Enxágue e armazenamento temporário de tecido de osteossarcoma |
| Bisturis | Fábrica de instrumentos cirúrgicos de Xangai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Separação do tecido do osteossarcoma e fazer incisões cirúrgicas |
| Capuz estéril | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Mesa de operação cirúrgica |
| estéril Henan | Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Fornecer área de cirurgia estéril |
| Suporte de agulha reta | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Suturar a |
| ferida Linha de sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Suturar a ferida |
| Agulha de sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Suturar a |
| ferida Solução protetora de tecido | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD | BC-CFM-03 | Manter a atividade das células teciduais |
| Tubo (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Instale a solução de fixação de formalina |
Referências
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Reimpressões e permissões
