Quantificação da coluna dendrítica usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios

As espinhas dendríticas são saliências de dendritos, muitas vezes compreendendo o local pós-sináptico das sinapses glutamatérgicas ^1,2. As espinhas dendríticas são de particular interesse no campo da plasticidade sináptica. As espinhas são frequentemente alteradas quando a força sináptica muda, tornando-se maiores e mais fortes na potenciação sináptica de longo prazo ou menores e mais fracas na depressão sináptica de longo prazo 3,4,5,6,7. Além da plasticidade sináptica, o perfil das espinhas dendríticas muda ao longo da vida. No desenvolvimento inicial, há um período de formação e crescimento da espinha dendrítica, seguido pela poda da espinha dendrítica até atingir um estado estacionário ^8,9,10. No cérebro envelhecido, a perda da coluna acompanha o encolhimento do cérebro e o declínio cognitivo¹¹. Além disso, muitos distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos são caracterizados por espinhas dendríticas aberrantes. Várias regiões cerebrais em indivíduos afetados com esquizofrenia têm menos espinhas dendríticas, provavelmente resultantes de poda sináptica alterada¹². Os transtornos do espectro do autismo também são caracterizados por patologias da coluna dendrítica¹³. A perda da coluna dendrítica é uma marca registrada da doença de Alzheimer e Parkinson^14,15. Dada a ampla gama de tópicos de pesquisa que abrangem investigações sobre as propriedades da coluna dendrítica, as técnicas para quantificação precisa da coluna vertebral são de suma importância.

A coloração, ou seja, o método de Golgi, ou a marcação de neurônios por meio de preenchimento de corante ou expressão de proteínas fluorescentes são métodos comuns para visualização da coluna dendrítica 16,17,18. Uma vez visualizados, os espinhos podem ser analisados com uma variedade de clientes de software gratuitos e disponíveis comercialmente. A saída desejada da análise é um fator importante para determinar qual software será mais útil. Fiji é uma opção de software viável para questões centradas na densidade da coluna dendrítica. No entanto, essa técnica depende em grande parte da contagem manual demorada que pode introduzir o potencial de viés. Novos plug-ins, como o SpineJ, permitem a quantificação automática, além de permitir uma análise mais precisa do pescoço da coluna^{vertebral 19}. Uma desvantagem dessas abordagens é a perda de uma análise tridimensional para determinar o volume da coluna, já que o SpineJ é limitado a pilhas de imagens bidimensionais. Além disso, a obtenção de informações sobre o subtipo de coluna torna-se um desafio por meio desses processos. Os quatro subtipos predominantes da coluna, fino, cogumelo, atarracado e filopodia, todos conotam funções individuais e são amplamente classificados por morfologia²⁰. Os espinhos finos são caracterizados por pescoço alongado e cabeça definida²¹. Os espinhos de cogumelo têm uma cabeça de espinha muito maior e pronunciada²². Os espinhos atarracados são curtos e têm pouca variação entre a cabeça e o pescoço²³. Os filopódios são espinhos imaturos com pescoço longo e fino e sem cabeça obviamente observável²⁴. Embora a classificação forneça informações valiosas, os espinhos existem em um continuum de dimensões. A classificação em categorias é baseada em intervalos de medidas morfológicas ^25,26. Medir manualmente as espinhas para classificação aumenta a carga logística para os pesquisadores nessa abordagem.

Outras opções de software com foco específico na análise tridimensional da coluna dendrítica são mais adequadas para investigações sobre o volume da coluna e as propriedades do subtipo 27,28,29,30,31. Apesar da dificuldade apresentada pela análise tridimensional, como baixa resolução do plano z e esfregaço, essas opções de software permitem a reconstrução tridimensional confiável de dendritos e espinhas dendríticas de maneira semiautomatizada guiada pelo usuário. A classificação automática de espinhos identificados em seus subtipos também é um recurso presente em alguns desses pacotes de software de análise de coluna. Isso pode melhorar as preocupações com a carga de trabalho potencial e o viés experimental. O Neurolucida 360 é um software disponível comercialmente que permite a identificação e classificação tridimensional confiável e reprodutível da coluna dendrítica³². Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para preparar efetivamente o tecido fixo, adquirir imagens e, finalmente, quantificar e classificar as espinhas dendríticas usando este software.

Todos os procedimentos com animais seguiram as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA usando animais em pesquisa intramural e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Mental.

1. Preparação de fatias fixas do hipocampo

1. Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina (cetamina: 100 mg / kg; Xilazina: 8 mg/kg). Valide a anestesia por meio de pinça de cauda e afixe o mouse na placa de perfusão.
2. Usando uma tesoura cirúrgica grande, remova a pele e o pelo do peito, permitindo uma visualização mais fácil da caixa torácica subjacente.
3. Faça um corte horizontal abaixo da largura da caixa torácica, evitando o fígado e o diafragma. Usando uma pinça fina, puxe o processo xifóide para cima e corte cada lado lateral da caixa torácica. Vire a caixa torácica para a região do pescoço e prenda no lugar usando uma pinça hemostática.
4. Insira uma agulha borboleta 21 G no ventrículo esquerdo do coração e comece a perfundir com temperatura ambiente 1x PBS a aproximadamente 5 mL / min. Faça um pequeno corte no átrio direito com uma pequena tesoura cirúrgica. Perfunda com PBS até que a solução que sai do átrio fique clara.
5. Desligue a bomba de perfusão para garantir que nenhuma bolha entre na tubulação. Coloque a tubulação de PBS em paraformaldeído a 4% (PFA) gelado em PBS. Perfundir com PFA a uma taxa de 5 mL/min até que o animal esteja totalmente enrijecido, aproximadamente 25 mL.
   NOTA: Certifique-se de que o PFA esteja fresco (não mais de 1 semana se o estoque for armazenado a 4° C) para uma fixação ideal.
6. Remova a pele da superfície do crânio com uma pequena tesoura cirúrgica. Faça um corte sagital médio com uma pequena tesoura cirúrgica ao longo da fissura central do crânio. Faça cortes laterais rostral ao bulbo olfatório e sobre o cerebelo.
7. Abra o crânio com uma pinça fina para expor o cérebro. Usando uma espátula, retire o cérebro suavemente dos bulbos olfatórios e coloque 4% de PFA em PBS durante a noite.
   NOTA: Para um protocolo mais abrangente de perfusão de roedores, consulte Gage et ^al.33.
8. Crioproteja o cérebro fixo substituindo o PFA a 4% por 15% de sacarose em PBS por 1 dia. Em seguida, substitua a sacarose a 15% por sacarose a 30% em solução de PBS por 1 dia até que o cérebro afunde na solução.
9. Remova o cérebro da solução de sacarose e coloque-o em uma placa de Petri com PBS. Corte o cerebelo e o bulbo olfatório usando uma lâmina de bisturi.
10. Coloque uma pequena quantidade, de 1-2 cm de diâmetro, de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na superfície do suporte da amostra. Monte o cérebro coronalmente ao suporte da amostra com a superfície de corte caudal na OCT. Congele rapidamente o cérebro colocando o suporte da amostra em gelo seco pulverizado até ficar visivelmente congelado, aproximadamente 5-7 min.
11. Certifique-se de que o ângulo da lâmina do criostato esteja ajustado entre 0° e 5° para produzir seções uniformes. Ajuste o ângulo da placa do rolo para um achatamento ideal da fatia. Consulte o manual do equipamento para obter instruções específicas.
12. Coloque o suporte da amostra no criostato com a superfície ventral do cérebro mais próxima da lâmina. Corte o cérebro em seções dorsais do hipocampo de 30 μm, descartando todas as fatias rostral ao hipocampo.
    NOTA: Esta parte do protocolo pode ser adaptada a qualquer região cerebral desejada de sua escolha. As etapas 1.9 a 1.12 mudariam dependendo da região de interesse.
13. Transfira as fatias dorsais do hipocampo para PBS. Usando um pincel, monte suavemente as seções do hipocampo em uma lâmina de microscópio. Remova qualquer excesso de solução com cotonetes ou lenços umedecidos.
14. Aplique 100 μL de meio de montagem rígido na lâmina do microscópio cobrindo todas as fatias de cérebro. Para evitar bolhas, abaixe a lamínula lentamente usando uma pinça no meio de montagem. Se formarem bolhas, bata suavemente na lamínula com uma pinça para permitir que escapem. Deixe os slides endurecerem durante a noite antes de fazer a imagem.

2. Imagem confocal de alta resolução

1. Use oculares de baixa ampliação para identificar células fluorescentes. Mude para uma objetiva de 63x (NA = 1,4) ou superior, aplicando meio de imersão adequado à objetiva.
   NOTA: Para obter os melhores resultados, utilize um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de 63x ou superior.
2. Identifique segmentos dendríticos bem marcados com sobreposição limitada para aquisição de imagens. Defina a potência e o ganho do laser para garantir que os dendritos fluorescentes não estejam saturados. Além disso, reduzir a velocidade de digitalização pode fornecer melhor resolução de imagem.
3. Adquira pilhas z abrangendo os segmentos dendríticos completos para análise futura. Pilhas Z maiores que 10 μm são indesejáveis devido ao potencial adicional de sobreposição dendrítica no plano z.
   NOTA: Utilize o menor tamanho de passo z disponível (0,2-0,7 μm) e 1 tamanho de orifício de unidade arejada. O tamanho menor do passo resulta em mais imagens na pilha z, compensando a resolução Z limitada de muitos microscópios.
4. Opcional: Se disponível, utilize a respectiva funcionalidade do software de deconvolução do microscópio para desconvolução de imagens. Isso permitirá imagens de alta resolução.

3. Quantificação da coluna dendrítica

1. Abra o Neurolucida 360 (v2022.1.1 ou posterior). Abra o arquivo de imagem no software de análise da lombada (Arquivo > Abrir > Imagem). Certifique-se de que o arquivo de imagem esteja visível na janela principal e no ambiente 3D. Se a janela do ambiente 3D não aparecer, clique com o botão esquerdo do mouse em Ambiente 3D na barra de ferramentas superior da janela principal na guia Trace (Figura Suplementar 1)
   NOTA: Esta seção do protocolo pode ser adaptada para qualquer imagem dendrítica, não exclusivamente dendritos de tecido de camundongo.
2. Enquanto estiver na guia Alterar exibição de imagem da janela Ambiente 3D, certifique-se de que a imagem seja exibida como Volume 3D na caixa Exibir imagem como. Na caixa Configurações de pilha de imagens da guia Imagem, selecione Projeção máxima no menu suspenso Mostrar superfície como. (Figura 2 suplementar)
3. Identifique um segmento dendrítico adequado para rastreamento.
   1. Clique com o botão esquerdo do mouse na ferramenta Mover ponto de pivô na barra de ferramentas superior da janela Ambiente 3D . Clique com o botão esquerdo do mouse no dendrito desejado para definir um novo ponto de pivô. Isso mudará a orientação para permitir um zoom eficaz.
   2. Restabeleça a orientação original clicando com o botão esquerdo do mouse no ícone Redefinir orientação. Depois de definir o ponto de pivô, clique com o botão esquerdo do mouse na ferramenta Mover ponto de pivô para começar a traçar o dendrito. (Figura 2 suplementar).
      NOTA: O dendrito ideal é aquele com sobreposição limitada com outros dendritos em qualquer um dos planos de coordenadas e não se cruzando com outro dendrito ou superficial para outro abaixo. Dendritos em baixa proximidade com outros no plano XY também são preferíveis para evitar a atribuição inadequada de espinhos vizinhos ao dendrito traçado. Também deve ser notado que dendritos de diferentes espessuras, ordens e distâncias do soma têm diferentes densidades de espinha dendrítica^34,35. Isso precisa ser levado em conta no projeto experimental. Dendritos de ordem secundária <1,5 μm de espessura são candidatos ideais para rastreamento (Figura 1).
4. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Árvore da janela Ambiente 3D . Clique com o botão esquerdo do mouse em Guiado pelo usuário para o modo de rastreamento e Kernels direcionais como o método em Opções de rastreamento guiadas pelo usuário.
5. Clique com o botão esquerdo no dendrito quando um kernel circular aparecer para iniciar o traçado. Mova o cursor ao longo do segmento dendrítico. Isso preencherá os kernels automaticamente. Se os kernels não estiverem sendo preenchidos automaticamente, consulte o passo 3.51.
   1. Mova suavemente o cursor para frente e para trás no dendrito até que os grãos sejam preenchidos. Clique com o botão esquerdo para preservar os kernels detectados existentes. Se os kernels pararem de preencher, clique com o botão esquerdo quando um kernel for preenchido mais abaixo no dendrito para colocar um manualmente. Clique com o botão direito do mouse para finalizar o traçado. Certifique-se de que o dendrito traçado tenha no mínimo 7 μm de comprimento (Figura Suplementar 3).
6. Verifique a precisão do traçado dendrítico usando todas as três direções do ambiente 3D, inclinação, guinada e rotação, clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando a janela Ambiente 3D . Identifique os pontos onde o traçado dendrítico está fora do local apropriado no dendrito. Pode haver casos em que parece traçado com precisão de cima para baixo, mas na dimensão z, os pontos não estão no dendrito (Figura 2).
7. Para corrigir segmentos dendríticos traçados incorretamente, clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar no menu Árvore . Clique com o botão esquerdo do mouse no dendrito de interesse e, em seguida, clique com o botão esquerdo em Pontos.
8. Mova os pontos colocados incorretamente de volta para o segmento dendrítico clicando e arrastando. Exclua pontos irrelevantes clicando com o botão esquerdo do mouse no ponto e clicando no botão Excluir . Altere o tamanho dos pontos se o dendrito não estiver adequadamente preenchido. Para alterar o tamanho do ponto, clique com o botão esquerdo do mouse em um ponto e ajuste o controle deslizante de espessura para alterar o tamanho (Figura Suplementar 4).
   NOTA: Dendritos inadequadamente preenchidos podem resultar na identificação de espinhos falsos que são componentes do segmento dendrítico. Por outro lado, o preenchimento excessivo dos dendritos pode obscurecer os espinhos verdadeiros.
9. Repita as etapas 3.3-3.8 para vários dendritos na imagem antes de prosseguir com a identificação da coluna vertebral na etapa 3.10.
10. Clique com o botão esquerdo na guia Lombada na janela Ambiente 3D. Defina as configurações de detecção para Faixa externa, Altura mínima e Contagem mínima de voxels. Dependendo da preparação, os valores predefinidos podem precisar ser alterados no caso de uma justificativa clara e específica para as alterações. As condições predefinidas são Faixa Externa: 2,5 μm, Altura Mínima: 0,3 μm, Contagem Mínima de Voxels: 10 Voxels.
    NOTA: Diferentes preparações, como culturas de células versus tecidos agudos, bem como diferentes pontos de tempo de desenvolvimento, exigirão critérios diferentes que devem ser derivados da literatura existente. Também é vital observar que alterar as configurações de detecção pode alterar significativamente os resultados. Por exemplo, uma altura mínima mais alta pode excluir espinhos curtos. As configurações de detecção devem permanecer consistentes durante todo o curso do experimento.
11. Defina a Sensibilidade do detector para 70% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar tudo. Isso preencherá os espinhos identificados por essa sensibilidade do detector em todos os dendritos. Se desejar selecionar espinhos de uma maneira específica do dendrito, clique com o botão esquerdo na caixa Clique na imagem para detectar tudo no galho mais próximo e clique com o botão esquerdo em cada dendrito manualmente com diferentes sensibilidades de detector.
    NOTA: Nesta fase, é normal que nem todas as espinhas dendríticas sejam preenchidas. Da mesma forma, os não espinhos podem ser preenchidos incorretamente. A sensibilidade inicial de 70% também é flexível; Isso pode mudar dependendo da preparação.
12. Examine os espinhos selecionados por esta sensibilidade do detector clicando e arrastando o dendrito em todas as três direções. Se a maioria dos espinhos detectados não estiver totalmente preenchida, prossiga para a etapa 3.12.1. Se os espinhos detectados estiverem cheios demais, vá para a etapa 3.12.2. Se os espinhos detectados parecerem estar adequadamente preenchidos, prossiga para a etapa 3.13.
    1. Aumente a sensibilidade do detector em 5% a 10% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar tudo novamente. Isso substituirá todos os espinhos detectados anteriormente por novos com maior sensibilidade. Repita conforme necessário até que os espinhos detectados estejam adequadamente preenchidos.
    2. Diminua a Sensibilidade do Detector em 5%-10% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar Tudo novamente. Isso substituirá todos os espinhos detectados anteriormente por novos com menor sensibilidade . Repita conforme necessário até que os espinhos detectados estejam adequadamente preenchidos.
13. Clique com o botão esquerdo do mouse em Manter lombadas existentes na guia Lombada do ambiente 3D. Se a opção Clique na imagem para detectar tudo na filial mais próxima tiver sido selecionada, desmarque-a.
    NOTA: Ao marcar Manter Espinhos Existentes , garante que os espinhos dendríticos recém-identificados manualmente não substituirão os espinhos identificados anteriormente. Certifique-se de que esta caixa esteja selecionada antes de continuar para não substituir o trabalho anterior.
14. Clique com o botão esquerdo em Mover ponto de pivô e clique com o botão esquerdo no dendrito, exigindo mais detecção de coluna para definir o ponto de pivô.
    1. Desmarque Mover ponto de pivô. Identifique uma coluna dendrítica não preenchida. Aumente a sensibilidade do detector de 10% a 20% além da detecção anterior e clique com o botão esquerdo na lombada. Se a lombada detectada estiver sub ou sobrecarregada, prossiga para a etapa 3.14.3 ou 3.14.4. Se a lombada não for preenchida, a mensagem Não é possível detectar uma lombada no local selecionado será exibida. Nesse caso, prossiga para a etapa 3.14.2.
    2. Aumente a sensibilidade do detector de forma incremental, possivelmente acima de 100%, até que a coluna seja detectada e preenchida adequadamente. Se a lombada for detectada, mas preenchida inadequadamente, prossiga para a etapa 3.14.3. Se a lombada estiver cheia demais, prossiga para a etapa 3.14.4 (Figura 3).
    3. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar e clique com o botão esquerdo na lombada subpreenchida. Clique com o botão esquerdo em Remover. Desmarque a guia Editar . Aumente a sensibilidade em 5% a 10% e clique com o botão esquerdo na lombada. Repita esta etapa se a lombada ainda estiver subcheia.
    4. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar e clique com o botão esquerdo na lombada cheia demais. Clique com o botão esquerdo em Remover. Desmarque a guia Editar . Diminua a sensibilidade em 5% a 10% e clique na lombada. Repita esta etapa se a lombada ainda estiver cheia demais.
15. Repita as etapas 3.14-3.14.4 até que todos os espinhos identificados pela identificação visual tenham sido detectados. Verifique novamente o dendrito em busca de espinhos pertencentes a dendritos vizinhos, espinhos falsos correspondentes a nenhum sinal verdadeiro ou segmentos potenciais de dendrito rotulados erroneamente como espinha. Exclua essas lombadas falsas com a função Remover .
16. Examine os espinhos identificados no dendrito. Em alguns casos, vários espinhos podem aparecer como uma espinha conglomerada. Se uma lombada parecer abranger duas, clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar . Clique com o botão esquerdo na lombada e clique com o botão esquerdo em Ocultar seleção. Depois de confirmar uma lombada de conglomerado, na guia Editar , clique com o botão esquerdo do mouse em Mostrar Seleção e selecione Dividir. Se mais de dois espinhos estiverem em um conglomerado, essa etapa pode precisar ser repetida (Figura 4).
    NOTA: Se a coluna do conglomerado não se dividir após a etapa 3.16, remova a coluna . Em seguida, selecione a coluna mais intensa do conglomerado com uma sensibilidade mais baixa. Uma vez que a coluna mais intensa esteja preenchida, aumente a sensibilidade para selecionar a outra coluna não preenchida. Alternativamente, excluir a coluna do conglomerado e aumentar a sensibilidade pode permitir a divisão adequada.
17. Com todos os espinhos visualmente identificáveis detectados e preenchidos adequadamente, na guia Lombada , clique com o botão esquerdo do mouse em Classificar tudo para classificar os espinhos em quatro subtipos: fino, cogumelo, atarracado e filopódios (Figura 5).
    NOTA: Os parâmetros de classificação da lombada podem ser alterados na janela Configurações da caixa Classificação na guia Lombada . Tal como acontece com as configurações do detector, uma justificativa clara para alterar os parâmetros existentes é fortemente encorajada. Os valores predefinidos são relação cabeça-pescoço: 1,1, relação comprimento-cabeça: 2,5, tamanho da cabeça do cogumelo: 0,35 μm, comprimento do filopódio - 3 μm.
18. Na barra de ferramentas superior da janela Ambiente 3D, selecione Salvar e visualizar no Neurolucida Explorer. O Neurolucida Explorer é onde os dados são coletados dos rastreamentos. O trabalho será salvo como um arquivo .dat contendo todos os traçados e lombadas.
19. Na janela Explorer, na guia Exibir , clique com o botão esquerdo em Selecionar tudo para destacar todos os dendritos e espinhos.
20. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Analisar na barra de ferramentas superior. Clique com o botão esquerdo do mouse no menu suspenso Estrutura . Clique com o botão esquerdo em Análise de estrutura ramificada.
21. Dependendo das variáveis de interesse, qualquer uma das análises pode ser selecionada. Os dois mais úteis para questões centradas na densidade da coluna vertebral e no volume médio da coluna vertebral são Cada árvore > cada dendrito e Espinhos > detalhes da coluna. Selecione OK e os dados aparecerão em duas janelas separadas.
22. Copie os dados para uma planilha para posterior compilação e análise.
    NOTA: A árvore individual será separada por dendrito, mas o volume da coluna não será. Usando a função de classificação na planilha, os detalhes da lombada podem ser filtrados por feições.

A utilização eficaz deste método de análise começa com a seleção de segmentos dendríticos para traçado. Conforme descrito na Figura 1, os dendritos ideais para rastreamento não estão próximos a outros dendritos. Dendritos executados em paralelo podem resultar na identificação inadequada de espinhos de um dendrito vizinho. Os dendritos que se cruzam diretamente ou correm perpendicularmente em um plano z diferente também adicionam dificuldade significativa ao traçado dendrítico preciso. Também é importante observar as diferenças na espessura dos dendritos. Conforme relatado anteriormente, existem diferenças importantes na densidade da coluna vertebral com dendritos de espessura variável36. Também pode haver diferenças no mesmo dendrito com o aumento da distância do ponto de ramificação37. O rastreamento de dendritos da mesma ordem e espessura, idealmente com origens de pontos de ramificação semelhantes, pode controlar a heterogeneidade existente da densidade da coluna dendrítica. Identificar o ponto de ramificação em algumas preparações pode ser inviável, mas a espessura do dendrito deve sempre ser um fator controlável no rastreamento do dendrito. O traçado preciso dos segmentos dendríticos é vital para a obtenção de resultados precisos a partir dessa análise. É necessário garantir que todos os pontos do dendrito traçado estejam realmente dentro do dendrito. Visualizar o dendrito tridimensional de diferentes direções pode ajudar nesse processo. Conforme demonstrado na Figura 2A, B, a visão de cima para baixo mostra o que parece ser um dendrito devidamente traçado. Na vista lateral; no entanto, vários pontos não estão localizados no próprio dendrito. Esses problemas não estão presentes na vista lateral da Figura 2C. Também é vital garantir que os dendritos sejam preenchidos adequadamente durante o rastreamento. Um dendrito subpreenchido pode resultar em pedaços de dendritos sendo identificados inadequadamente como espinhos. Um dendrito cheio demais pode impedir que espinhos verdadeiros sejam identificados devido ao limite mínimo de altura. Essa avaliação manual do rastreamento guiado pelo usuário é fundamental para permitir uma análise precisa da coluna dendrítica.

A identificação de espinhas dendríticas também requer uma abordagem guiada pelo usuário. Usar a função "Detectar tudo" para definir o limite de sensibilidade uniforme do detector é inadequado por vários motivos. Usar o recurso "Detectar tudo" é útil para identificar os espinhos mais óbvios, mas o preenchimento desses espinhos deve ser verificado para verificar. Os espinhos identificados com a inicial "Detectar tudo" podem estar subpreenchidos. Para corrigir isso, a coluna identificada deve ser excluída individualmente e depois reidentificada manualmente em uma sensibilidade mais alta do detector ( Figura 3A-C ). Isso garante que a coluna seja preenchida adequadamente. Há uma heterogeneidade substancial na sensibilidade do detector necessária para espinhos que deve ser contabilizada manualmente. Aumentar a sensibilidade do detector para detectar todos pode resultar em lombadas excessivamente preenchidas, que também requerem correção manual (Figura 3D). Um problema adicional com a sensibilidade inadequada do detector é a criação inadequada de uma espinha conglomerada, uma espinha dendrítica preenchida que engloba várias espinhas. Dois espinhos próximos um do outro podem ser fundidos incorretamente em um conglomerado de espinhos (Figura 4A, B). O software de detecção de lombada possui um recurso "Split", que pode ser usado para separar espinhas que foram mescladas por enchimento excessivo. O recurso "Split" permite que os espinhos individuais sejam prontamente gerados a partir do conglomerado O rastreamento preciso de dendritos e o preenchimento da coluna dendrítica permitem uma classificação precisa em subtipos de coluna. A classificação da coluna vertebral depende da morfologia das espinhas preenchidas e da distância dos dendritos, portanto, cada etapa do processo desempenha um papel na classificação morfológica (Figura 5).

Devido à necessidade de seleção manual e limiar, é crucial seguir um padrão uniforme para todas as análises. Isso é especialmente pertinente se vários usuários contribuírem para a análise de dados. Para garantir que todos os investigadores que realizam a análise estejam seguindo o mesmo padrão, os investigadores devem comparar os dados dos mesmos dendritos rastreados. Isso pode reduzir o potencial de viés do experimentador, garantindo que cada pesquisador esteja identificando espinhas com base em critérios compartilhados e uniformes de maneira cega. Há também a possibilidade de viés de um único pesquisador entre dias ou mesmo no mesmo dia devido à fadiga. Isso deve ser monitorado durante todo o processo de análise de dados. Para garantir ainda mais a validade da análise, comparar os resultados iniciais com os publicados na literatura garante que o protocolo está sendo efetivamente seguido. É fundamental observar que essa comparação só será eficaz se a preparação e os parâmetros forem compartilhados. Diferenças na coloração, aquisição de sinais fluorescentes, ordem e espessura dos dendritos ou região do cérebro podem contribuir para resultados diferentes 8,36. No caso de resultados publicados ausentes, o uso de vários pesquisadores para validar a identificação da coluna permite maior confiança na confiabilidade e reprodutibilidade da análise. Uma pasta de análise suplementar foi incluída neste manuscrito. Esta pasta contém arquivos de imagens de amostra de segmentos dendríticos, dendritos rastreados, dendritos rastreados com espinhos identificados e classificados e saída de dados (Tabela Suplementar 1, Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 4). Novos usuários podem treinar neste conjunto de dados para praticar os procedimentos descritos neste artigo. Os resultados gerados pelo usuário dentro de 10% do conjunto de dados de amostra fornecido são considerados aceitáveis para reproduzir o padrão de análise. Devido aos critérios potencialmente subjetivos de uma coluna totalmente preenchida e à necessidade de exame manual de espinhas detectadas automaticamente, a variância entre e dentro dos pesquisadores é uma parte normal da análise. Caso os resultados gerados excedam esse limite; no entanto, uma comparação lado a lado deve ser realizada para determinar instâncias de diferentes volumes de lombadas, bem como espinhas incluídas ou excluídas incorretamente. O conjunto de dados de amostra pode ser reanalisado até que o limite aceitável seja atingido.

Figura 1: Seleção de dendritos para análise da coluna dendrítica. (A) Exibição de volume 3D de imagens confocais z-stack tiradas de dendritos proximais CA1 na linha de camundongos transgênicos THY1-YFP. Observe a heterogeneidade da ordem dos dendritos com dendritos primários mais espessos em ovais azuis e dendritos mais finos, secundários e terciários em ovais rosa. (B) Os candidatos ideais para o rastreamento de dendritos são denotados por ovais verdes. Observe a espessura e interseções limitadas, sobreposições e proximidade com outros dendritos. O oval vermelho denota segmentos dendríticos a serem evitados para rastreamento dendrítico devido a altas interseções, sobreposições e proximidade com outros dendritos. Dendritos primários mais espessos também não são candidatos adequados para rastreamento. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Traçando com precisão os segmentos dendríticos. (A) Exibição de volume 3D de imagens confocais de pilha z tiradas de dendritos proximais CA1 na linha de camundongos transgênicos THY1-YFP a serem rastreadas por meio do método de kernel direcional guiado pelo usuário. Barra de escala = 10 μm. (B) Exemplo de traçado de dendrito ruim. O dendrito parece estar devidamente rastreado na visão de cima para baixo. A vista lateral mostra que o dendrito está indevidamente preenchido com pontos que se desviam do dendrito. (C) Exemplo de um traçado dendrito adequado. A vista de cima para baixo parece semelhante a B, mas a vista lateral difere substancialmente. O dendrito em C é devidamente traçado, conforme indicado por ser totalmente preenchido, sem desvios do dendrito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Preenchimento preciso de espinhas dendríticas usando seleção manual. (A) Exibição de volume 3D de imagens confocais de pilha z tiradas de dendritos proximais CA1 na linha de camundongos transgênicos THY1-YFP de uma coluna vertebral aguardando detecção manual. Barra de escala = 0,5 μm. (B) Exemplo de uma coluna dendrítica subpreenchida. Há um sinal fluorescente substancial ainda visível devido ao enchimento incompleto. (C) Exemplo de uma coluna dendrítica devidamente preenchida. A presença de uma "coroa" de sinal quase invisível ao redor do exterior do preenchimento é o padrão para preencher com precisão as espinhas dendríticas. (D) Exemplo de uma coluna dendrítica superlotada. A sensibilidade do detector é muito alta, resultando em uma coluna cheia demais. O preenchimento ultrapassou as fronteiras da fluorescência e tem uma coroa quase imperceptível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Divisão de espinhas dendríticas de conglomerados. (A) Exibição de volume 3D de imagens confocais de pilha z tiradas de dendritos proximais CA1 na linha de camundongos transgênicos THY1-YFP com duas espinhas próximas. Barra de escala = 0,15 μm. (B) Um exemplo de dois espinhos independentes preenchidos incorretamente como uma espinha dendrítica conglomerada. (C) Após o uso do recurso "Split", a coluna do conglomerado é dividida em duas espinhas dendríticas distintas e devidamente preenchidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Identificação e classificação da coluna dendrítica em subtipos. (A) Exibição de volume 3D de imagens confocais z-stack tiradas de dendritos proximais CA1 na linha de camundongos transgênicos THY1-YFP de um segmento dendrítico traçado isolado para quantificação e classificação da coluna dendrítica. Barra de escala = 5 μm. (B) Segmento dendrítico traçado com todos os espinhos dendríticos identificados e examinados para garantir o preenchimento e a divisão adequados. O software atribui cores arbitrariamente às lombadas identificadas nesta etapa. (C) Classificação de todos os espinhos dendríticos identificados em subtipos usando parâmetros definidos no software. Azul = cogumelo, amarelo = fino e verde = atarracado. Os filopódios não estão presentes devido à idade desse tecido. (D) Imagens representativas de cogumelos, espinhos finos e atarracados não preenchidos (superior) e preenchidos (inferior). Barra de escala = 0,3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1 suplementar: Acessando o ambiente 3D. Pilha Z de imagens confocais visualizadas na interface do software. A navegação do ambiente 3D na guia Trace no visualizador principal foi destacada em amarelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Parâmetros de imagem e configurações de orientação para o ambiente 3D. Visualizador de ambiente 3D para imagens confocais z-stack. Os parâmetros na guia Alterar exibição de imagem destacada indicada por setas amarelas são definidos como Exibir imagem como: Volume 3D e Mostrar superfície como: Projeção máxima. Mover ponto de pivô e redefinir orientação são identificados por setas amarelas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Traçado do segmento dendrítico. (A) Volume 3D de imagens confocais de pilha z para rastreamento de dendritos. Com a guia da árvore, os kernels guiados pelo usuário e direcionais selecionados, o rastreamento começa colocando o kernel inicial no dendrito com um clique esquerdo. (B) Propagação de kernels direcionais para baixo do dendrito seguindo o movimento do cursor. (C) Clicar com o botão esquerdo mais abaixo no dendrito preenche os núcleos direcionais. (D) Exemplo de kernels direcionais que não povoam dendritos. Em vez disso, um kernel solitário está presente mais abaixo no segmento. (E) Clicar com o botão esquerdo no kernel solitário preenche o dendrito entre os dois pontos. Clicar com o botão direito do mouse encerra o rastreamento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Pontos de ajuste em dendritos traçados. (A) Segmento dendrito traçado pendente de ajuste de ponto. A edição de dendritos requer que as guias "Árvore" e "Editar" sejam selecionadas. Ambos são destacados em amarelo. Dendrito foi selecionado para edição com um clique esquerdo. (B) Selecionar a guia de pontos, destacada em amarelo, permite a seleção de pontos individuais no segmento dendrítico. O ponto verde tem uma espessura de 1,2 μm. (C) Ponto ajustado para preencher o dendrito com mais precisão. O novo valor de espessura do ponto verde é de 0,6 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: Resultados da análise de imagem de amostra. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Exemplos de traçados de imagens com dendritos e spines.dat Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Exemplos de traçados com dendrites.dat Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Exemplo de imagem dendrítica file.czi Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Arquivo de imagem de dendrito de amostra.jpx Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.