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Artigo de método

Quantificação da coluna dendrítica usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios

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DOI:

10.3791/66493

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27 de setembro de 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

Neste artigo

Resumo

As espinhas dendríticas são compartimentos pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias. Alterações na morfologia da coluna dendrítica ocorrem durante o neurodesenvolvimento, envelhecimento, aprendizado e muitos distúrbios neurológicos e psiquiátricos, ressaltando a importância de uma análise confiável da coluna dendrítica. Este protocolo descreve a quantificação da morfologia da coluna dendrítica de forma precisa e reprodutível usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios.

Resumo

As conexões sinápticas permitem a troca e o processamento de informações entre os neurônios. O local pós-sináptico das sinapses excitatórias é freqüentemente formado nas espinhas dendríticas. As espinhas dendríticas são estruturas de grande interesse em pesquisas centradas em plasticidade sináptica, neurodesenvolvimento e distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Os espinhos dendríticos sofrem modificações estruturais durante sua vida útil, com propriedades como número total de espinhos, tamanho da coluna dendrítica e subtipo morfologicamente definido alterando em resposta a diferentes processos. Delinear os mecanismos moleculares que regulam essas alterações estruturais das espinhas dendríticas depende da medição morfológica. Isso exige uma análise precisa e reprodutível da coluna dendrítica para fornecer evidências experimentais. O presente estudo descreve um protocolo detalhado para quantificação e classificação da coluna dendrítica usando o Neurolucida 360 (software de reconstrução automática de neurônios tridimensionais). Este protocolo permite a determinação das principais propriedades dendríticas da coluna, como densidade total da coluna, volume da cabeça da coluna vertebral e classificação em subtipos da coluna, permitindo assim a análise eficaz dos fenótipos estruturais da coluna dendrítica.

Introdução

As espinhas dendríticas são saliências de dendritos, muitas vezes compreendendo o local pós-sináptico das sinapses glutamatérgicas 1,2. As espinhas dendríticas são de particular interesse no campo da plasticidade sináptica. As espinhas são frequentemente alteradas quando a força sináptica muda, tornando-se maiores e mais fortes na potenciação sináptica de longo prazo ou menores e mais fracas na depressão sináptica de longo prazo 3,4,5,6,7. Além da plasticidade sináptica, o perfil das espinhas dendríticas muda ao longo da vida. No desenvolvimento inicial, há um período de formação e crescimento da espinha dendrítica, seguido pela poda da espinha dendrítica até atingir um estado estacionário 8,9,10. No cérebro envelhecido, a perda da coluna acompanha o encolhimento do cérebro e o declínio cognitivo11. Além disso, muitos distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos são caracterizados por espinhas dendríticas aberrantes. Várias regiões cerebrais em indivíduos afetados com esquizofrenia têm menos espinhas dendríticas, provavelmente resultantes de poda sináptica alterada12. Os transtornos do espectro do autismo também são caracterizados por patologias da coluna dendrítica13. A perda da coluna dendrítica é uma marca registrada da doença de Alzheimer e Parkinson14,15. Dada a ampla gama de tópicos de pesquisa que abrangem investigações sobre as propriedades da coluna dendrítica, as técnicas para quantificação precisa da coluna vertebral são de suma importância.

A coloração, ou seja, o método de Golgi, ou a marcação de neurônios por meio de preenchimento de corante ou expressão de proteínas fluorescentes são métodos comuns para visualização da coluna dendrítica 16,17,18. Uma vez visualizados, os espinhos podem ser analisados com uma variedade de clientes de software gratuitos e disponíveis comercialmente. A saída desejada da análise é um fator importante para determinar qual software será mais útil. Fiji é uma opção de software viável para questões centradas na densidade da coluna dendrítica. No entanto, essa técnica depende em grande parte da contagem manual demorada que pode introduzir o potencial de viés. Novos plug-ins, como o SpineJ, permitem a quantificação automática, além de permitir uma análise mais precisa do pescoço da colunavertebral 19. Uma desvantagem dessas abordagens é a perda de uma análise tridimensional para determinar o volume da coluna, já que o SpineJ é limitado a pilhas de imagens bidimensionais. Além disso, a obtenção de informações sobre o subtipo de coluna torna-se um desafio por meio desses processos. Os quatro subtipos predominantes da coluna, fino, cogumelo, atarracado e filopodia, todos conotam funções individuais e são amplamente classificados por morfologia20. Os espinhos finos são caracterizados por pescoço alongado e cabeça definida21. Os espinhos de cogumelo têm uma cabeça de espinha muito maior e pronunciada22. Os espinhos atarracados são curtos e têm pouca variação entre a cabeça e o pescoço23. Os filopódios são espinhos imaturos com pescoço longo e fino e sem cabeça obviamente observável24. Embora a classificação forneça informações valiosas, os espinhos existem em um continuum de dimensões. A classificação em categorias é baseada em intervalos de medidas morfológicas 25,26. Medir manualmente as espinhas para classificação aumenta a carga logística para os pesquisadores nessa abordagem.

Outras opções de software com foco específico na análise tridimensional da coluna dendrítica são mais adequadas para investigações sobre o volume da coluna e as propriedades do subtipo 27,28,29,30,31. Apesar da dificuldade apresentada pela análise tridimensional, como baixa resolução do plano z e esfregaço, essas opções de software permitem a reconstrução tridimensional confiável de dendritos e espinhas dendríticas de maneira semiautomatizada guiada pelo usuário. A classificação automática de espinhos identificados em seus subtipos também é um recurso presente em alguns desses pacotes de software de análise de coluna. Isso pode melhorar as preocupações com a carga de trabalho potencial e o viés experimental. O Neurolucida 360 é um software disponível comercialmente que permite a identificação e classificação tridimensional confiável e reprodutível da coluna dendrítica32. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para preparar efetivamente o tecido fixo, adquirir imagens e, finalmente, quantificar e classificar as espinhas dendríticas usando este software.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais seguiram as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA usando animais em pesquisa intramural e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Mental.

1. Preparação de fatias fixas do hipocampo

  1. Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina (cetamina: 100 mg / kg; Xilazina: 8 mg/kg). Valide a anestesia por meio de pinça de cauda e afixe o mouse na placa de perfusão.
  2. Usando uma tesoura cirúrgica grande, remova a pele e o pelo do peito, permitindo uma visualização mais fácil da caixa torácica subjacente.
  3. Faça um corte horizontal abaixo da largura da caixa torácica, evitando o fígado e o diafragma. Usando uma pinça fina, puxe o processo xifóide para cima e corte cada lado lateral da caixa torácica. Vire a caixa torácica para a região do pescoço e prenda no lugar usando uma pinça hemostática.
  4. Insira uma agulha borboleta 21 G no ventrículo esquerdo do coração e comece a perfundir com temperatura ambiente 1x PBS a aproximadamente 5 mL / min. Faça um pequeno corte no átrio direito com uma pequena tesoura cirúrgica. Perfunda com PBS até que a solução que sai do átrio fique clara.
  5. Desligue a bomba de perfusão para garantir que nenhuma bolha entre na tubulação. Coloque a tubulação de PBS em paraformaldeído a 4% (PFA) gelado em PBS. Perfundir com PFA a uma taxa de 5 mL/min até que o animal esteja totalmente enrijecido, aproximadamente 25 mL.
    NOTA: Certifique-se de que o PFA esteja fresco (não mais de 1 semana se o estoque for armazenado a 4° C) para uma fixação ideal.
  6. Remova a pele da superfície do crânio com uma pequena tesoura cirúrgica. Faça um corte sagital médio com uma pequena tesoura cirúrgica ao longo da fissura central do crânio. Faça cortes laterais rostral ao bulbo olfatório e sobre o cerebelo.
  7. Abra o crânio com uma pinça fina para expor o cérebro. Usando uma espátula, retire o cérebro suavemente dos bulbos olfatórios e coloque 4% de PFA em PBS durante a noite.
    NOTA: Para um protocolo mais abrangente de perfusão de roedores, consulte Gage et al.33.
  8. Crioproteja o cérebro fixo substituindo o PFA a 4% por 15% de sacarose em PBS por 1 dia. Em seguida, substitua a sacarose a 15% por sacarose a 30% em solução de PBS por 1 dia até que o cérebro afunde na solução.
  9. Remova o cérebro da solução de sacarose e coloque-o em uma placa de Petri com PBS. Corte o cerebelo e o bulbo olfatório usando uma lâmina de bisturi.
  10. Coloque uma pequena quantidade, de 1-2 cm de diâmetro, de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na superfície do suporte da amostra. Monte o cérebro coronalmente ao suporte da amostra com a superfície de corte caudal na OCT. Congele rapidamente o cérebro colocando o suporte da amostra em gelo seco pulverizado até ficar visivelmente congelado, aproximadamente 5-7 min.
  11. Certifique-se de que o ângulo da lâmina do criostato esteja ajustado entre 0° e 5° para produzir seções uniformes. Ajuste o ângulo da placa do rolo para um achatamento ideal da fatia. Consulte o manual do equipamento para obter instruções específicas.
  12. Coloque o suporte da amostra no criostato com a superfície ventral do cérebro mais próxima da lâmina. Corte o cérebro em seções dorsais do hipocampo de 30 μm, descartando todas as fatias rostral ao hipocampo.
    NOTA: Esta parte do protocolo pode ser adaptada a qualquer região cerebral desejada de sua escolha. As etapas 1.9 a 1.12 mudariam dependendo da região de interesse.
  13. Transfira as fatias dorsais do hipocampo para PBS. Usando um pincel, monte suavemente as seções do hipocampo em uma lâmina de microscópio. Remova qualquer excesso de solução com cotonetes ou lenços umedecidos.
  14. Aplique 100 μL de meio de montagem rígido na lâmina do microscópio cobrindo todas as fatias de cérebro. Para evitar bolhas, abaixe a lamínula lentamente usando uma pinça no meio de montagem. Se formarem bolhas, bata suavemente na lamínula com uma pinça para permitir que escapem. Deixe os slides endurecerem durante a noite antes de fazer a imagem.

2. Imagem confocal de alta resolução

  1. Use oculares de baixa ampliação para identificar células fluorescentes. Mude para uma objetiva de 63x (NA = 1,4) ou superior, aplicando meio de imersão adequado à objetiva.
    NOTA: Para obter os melhores resultados, utilize um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de 63x ou superior.
  2. Identifique segmentos dendríticos bem marcados com sobreposição limitada para aquisição de imagens. Defina a potência e o ganho do laser para garantir que os dendritos fluorescentes não estejam saturados. Além disso, reduzir a velocidade de digitalização pode fornecer melhor resolução de imagem.
  3. Adquira pilhas z abrangendo os segmentos dendríticos completos para análise futura. Pilhas Z maiores que 10 μm são indesejáveis devido ao potencial adicional de sobreposição dendrítica no plano z.
    NOTA: Utilize o menor tamanho de passo z disponível (0,2-0,7 μm) e 1 tamanho de orifício de unidade arejada. O tamanho menor do passo resulta em mais imagens na pilha z, compensando a resolução Z limitada de muitos microscópios.
  4. Opcional: Se disponível, utilize a respectiva funcionalidade do software de deconvolução do microscópio para desconvolução de imagens. Isso permitirá imagens de alta resolução.

3. Quantificação da coluna dendrítica

  1. Abra o Neurolucida 360 (v2022.1.1 ou posterior). Abra o arquivo de imagem no software de análise da lombada (Arquivo > Abrir > Imagem). Certifique-se de que o arquivo de imagem esteja visível na janela principal e no ambiente 3D. Se a janela do ambiente 3D não aparecer, clique com o botão esquerdo do mouse em Ambiente 3D na barra de ferramentas superior da janela principal na guia Trace (Figura Suplementar 1)
    NOTA: Esta seção do protocolo pode ser adaptada para qualquer imagem dendrítica, não exclusivamente dendritos de tecido de camundongo.
  2. Enquanto estiver na guia Alterar exibição de imagem da janela Ambiente 3D, certifique-se de que a imagem seja exibida como Volume 3D na caixa Exibir imagem como. Na caixa Configurações de pilha de imagens da guia Imagem, selecione Projeção máxima no menu suspenso Mostrar superfície como. (Figura 2 suplementar)
  3. Identifique um segmento dendrítico adequado para rastreamento.
    1. Clique com o botão esquerdo do mouse na ferramenta Mover ponto de pivô na barra de ferramentas superior da janela Ambiente 3D . Clique com o botão esquerdo do mouse no dendrito desejado para definir um novo ponto de pivô. Isso mudará a orientação para permitir um zoom eficaz.
    2. Restabeleça a orientação original clicando com o botão esquerdo do mouse no ícone Redefinir orientação. Depois de definir o ponto de pivô, clique com o botão esquerdo do mouse na ferramenta Mover ponto de pivô para começar a traçar o dendrito. (Figura 2 suplementar).
      NOTA: O dendrito ideal é aquele com sobreposição limitada com outros dendritos em qualquer um dos planos de coordenadas e não se cruzando com outro dendrito ou superficial para outro abaixo. Dendritos em baixa proximidade com outros no plano XY também são preferíveis para evitar a atribuição inadequada de espinhos vizinhos ao dendrito traçado. Também deve ser notado que dendritos de diferentes espessuras, ordens e distâncias do soma têm diferentes densidades de espinha dendrítica34,35. Isso precisa ser levado em conta no projeto experimental. Dendritos de ordem secundária <1,5 μm de espessura são candidatos ideais para rastreamento (Figura 1).
  4. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Árvore da janela Ambiente 3D . Clique com o botão esquerdo do mouse em Guiado pelo usuário para o modo de rastreamento e Kernels direcionais como o método em Opções de rastreamento guiadas pelo usuário.
  5. Clique com o botão esquerdo no dendrito quando um kernel circular aparecer para iniciar o traçado. Mova o cursor ao longo do segmento dendrítico. Isso preencherá os kernels automaticamente. Se os kernels não estiverem sendo preenchidos automaticamente, consulte o passo 3.51.
    1. Mova suavemente o cursor para frente e para trás no dendrito até que os grãos sejam preenchidos. Clique com o botão esquerdo para preservar os kernels detectados existentes. Se os kernels pararem de preencher, clique com o botão esquerdo quando um kernel for preenchido mais abaixo no dendrito para colocar um manualmente. Clique com o botão direito do mouse para finalizar o traçado. Certifique-se de que o dendrito traçado tenha no mínimo 7 μm de comprimento (Figura Suplementar 3).
  6. Verifique a precisão do traçado dendrítico usando todas as três direções do ambiente 3D, inclinação, guinada e rotação, clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando a janela Ambiente 3D . Identifique os pontos onde o traçado dendrítico está fora do local apropriado no dendrito. Pode haver casos em que parece traçado com precisão de cima para baixo, mas na dimensão z, os pontos não estão no dendrito (Figura 2).
  7. Para corrigir segmentos dendríticos traçados incorretamente, clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar no menu Árvore . Clique com o botão esquerdo do mouse no dendrito de interesse e, em seguida, clique com o botão esquerdo em Pontos.
  8. Mova os pontos colocados incorretamente de volta para o segmento dendrítico clicando e arrastando. Exclua pontos irrelevantes clicando com o botão esquerdo do mouse no ponto e clicando no botão Excluir . Altere o tamanho dos pontos se o dendrito não estiver adequadamente preenchido. Para alterar o tamanho do ponto, clique com o botão esquerdo do mouse em um ponto e ajuste o controle deslizante de espessura para alterar o tamanho (Figura Suplementar 4).
    NOTA: Dendritos inadequadamente preenchidos podem resultar na identificação de espinhos falsos que são componentes do segmento dendrítico. Por outro lado, o preenchimento excessivo dos dendritos pode obscurecer os espinhos verdadeiros.
  9. Repita as etapas 3.3-3.8 para vários dendritos na imagem antes de prosseguir com a identificação da coluna vertebral na etapa 3.10.
  10. Clique com o botão esquerdo na guia Lombada na janela Ambiente 3D. Defina as configurações de detecção para Faixa externa, Altura mínima e Contagem mínima de voxels. Dependendo da preparação, os valores predefinidos podem precisar ser alterados no caso de uma justificativa clara e específica para as alterações. As condições predefinidas são Faixa Externa: 2,5 μm, Altura Mínima: 0,3 μm, Contagem Mínima de Voxels: 10 Voxels.
    NOTA: Diferentes preparações, como culturas de células versus tecidos agudos, bem como diferentes pontos de tempo de desenvolvimento, exigirão critérios diferentes que devem ser derivados da literatura existente. Também é vital observar que alterar as configurações de detecção pode alterar significativamente os resultados. Por exemplo, uma altura mínima mais alta pode excluir espinhos curtos. As configurações de detecção devem permanecer consistentes durante todo o curso do experimento.
  11. Defina a Sensibilidade do detector para 70% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar tudo. Isso preencherá os espinhos identificados por essa sensibilidade do detector em todos os dendritos. Se desejar selecionar espinhos de uma maneira específica do dendrito, clique com o botão esquerdo na caixa Clique na imagem para detectar tudo no galho mais próximo e clique com o botão esquerdo em cada dendrito manualmente com diferentes sensibilidades de detector.
    NOTA: Nesta fase, é normal que nem todas as espinhas dendríticas sejam preenchidas. Da mesma forma, os não espinhos podem ser preenchidos incorretamente. A sensibilidade inicial de 70% também é flexível; Isso pode mudar dependendo da preparação.
  12. Examine os espinhos selecionados por esta sensibilidade do detector clicando e arrastando o dendrito em todas as três direções. Se a maioria dos espinhos detectados não estiver totalmente preenchida, prossiga para a etapa 3.12.1. Se os espinhos detectados estiverem cheios demais, vá para a etapa 3.12.2. Se os espinhos detectados parecerem estar adequadamente preenchidos, prossiga para a etapa 3.13.
    1. Aumente a sensibilidade do detector em 5% a 10% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar tudo novamente. Isso substituirá todos os espinhos detectados anteriormente por novos com maior sensibilidade. Repita conforme necessário até que os espinhos detectados estejam adequadamente preenchidos.
    2. Diminua a Sensibilidade do Detector em 5%-10% e clique com o botão esquerdo do mouse em Detectar Tudo novamente. Isso substituirá todos os espinhos detectados anteriormente por novos com menor sensibilidade . Repita conforme necessário até que os espinhos detectados estejam adequadamente preenchidos.
  13. Clique com o botão esquerdo do mouse em Manter lombadas existentes na guia Lombada do ambiente 3D. Se a opção Clique na imagem para detectar tudo na filial mais próxima tiver sido selecionada, desmarque-a.
    NOTA: Ao marcar Manter Espinhos Existentes , garante que os espinhos dendríticos recém-identificados manualmente não substituirão os espinhos identificados anteriormente. Certifique-se de que esta caixa esteja selecionada antes de continuar para não substituir o trabalho anterior.
  14. Clique com o botão esquerdo em Mover ponto de pivô e clique com o botão esquerdo no dendrito, exigindo mais detecção de coluna para definir o ponto de pivô.
    1. Desmarque Mover ponto de pivô. Identifique uma coluna dendrítica não preenchida. Aumente a sensibilidade do detector de 10% a 20% além da detecção anterior e clique com o botão esquerdo na lombada. Se a lombada detectada estiver sub ou sobrecarregada, prossiga para a etapa 3.14.3 ou 3.14.4. Se a lombada não for preenchida, a mensagem Não é possível detectar uma lombada no local selecionado será exibida. Nesse caso, prossiga para a etapa 3.14.2.
    2. Aumente a sensibilidade do detector de forma incremental, possivelmente acima de 100%, até que a coluna seja detectada e preenchida adequadamente. Se a lombada for detectada, mas preenchida inadequadamente, prossiga para a etapa 3.14.3. Se a lombada estiver cheia demais, prossiga para a etapa 3.14.4 (Figura 3).
    3. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar e clique com o botão esquerdo na lombada subpreenchida. Clique com o botão esquerdo em Remover. Desmarque a guia Editar . Aumente a sensibilidade em 5% a 10% e clique com o botão esquerdo na lombada. Repita esta etapa se a lombada ainda estiver subcheia.
    4. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar e clique com o botão esquerdo na lombada cheia demais. Clique com o botão esquerdo em Remover. Desmarque a guia Editar . Diminua a sensibilidade em 5% a 10% e clique na lombada. Repita esta etapa se a lombada ainda estiver cheia demais.
  15. Repita as etapas 3.14-3.14.4 até que todos os espinhos identificados pela identificação visual tenham sido detectados. Verifique novamente o dendrito em busca de espinhos pertencentes a dendritos vizinhos, espinhos falsos correspondentes a nenhum sinal verdadeiro ou segmentos potenciais de dendrito rotulados erroneamente como espinha. Exclua essas lombadas falsas com a função Remover .
  16. Examine os espinhos identificados no dendrito. Em alguns casos, vários espinhos podem aparecer como uma espinha conglomerada. Se uma lombada parecer abranger duas, clique com o botão esquerdo do mouse na guia Editar . Clique com o botão esquerdo na lombada e clique com o botão esquerdo em Ocultar seleção. Depois de confirmar uma lombada de conglomerado, na guia Editar , clique com o botão esquerdo do mouse em Mostrar Seleção e selecione Dividir. Se mais de dois espinhos estiverem em um conglomerado, essa etapa pode precisar ser repetida (Figura 4).
    NOTA: Se a coluna do conglomerado não se dividir após a etapa 3.16, remova a coluna . Em seguida, selecione a coluna mais intensa do conglomerado com uma sensibilidade mais baixa. Uma vez que a coluna mais intensa esteja preenchida, aumente a sensibilidade para selecionar a outra coluna não preenchida. Alternativamente, excluir a coluna do conglomerado e aumentar a sensibilidade pode permitir a divisão adequada.
  17. Com todos os espinhos visualmente identificáveis detectados e preenchidos adequadamente, na guia Lombada , clique com o botão esquerdo do mouse em Classificar tudo para classificar os espinhos em quatro subtipos: fino, cogumelo, atarracado e filopódios (Figura 5).
    NOTA: Os parâmetros de classificação da lombada podem ser alterados na janela Configurações da caixa Classificação na guia Lombada . Tal como acontece com as configurações do detector, uma justificativa clara para alterar os parâmetros existentes é fortemente encorajada. Os valores predefinidos são relação cabeça-pescoço: 1,1, relação comprimento-cabeça: 2,5, tamanho da cabeça do cogumelo: 0,35 μm, comprimento do filopódio - 3 μm.
  18. Na barra de ferramentas superior da janela Ambiente 3D, selecione Salvar e visualizar no Neurolucida Explorer. O Neurolucida Explorer é onde os dados são coletados dos rastreamentos. O trabalho será salvo como um arquivo .dat contendo todos os traçados e lombadas.
  19. Na janela Explorer, na guia Exibir , clique com o botão esquerdo em Selecionar tudo para destacar todos os dendritos e espinhos.
  20. Clique com o botão esquerdo do mouse na guia Analisar na barra de ferramentas superior. Clique com o botão esquerdo do mouse no menu suspenso Estrutura . Clique com o botão esquerdo em Análise de estrutura ramificada.
  21. Dependendo das variáveis de interesse, qualquer uma das análises pode ser selecionada. Os dois mais úteis para questões centradas na densidade da coluna vertebral e no volume médio da coluna vertebral são Cada árvore > cada dendrito e Espinhos > detalhes da coluna. Selecione OK e os dados aparecerão em duas janelas separadas.
  22. Copie os dados para uma planilha para posterior compilação e análise.
    NOTA: A árvore individual será separada por dendrito, mas o volume da coluna não será. Usando a função de classificação na planilha, os detalhes da lombada podem ser filtrados por feições.

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Resultados

A utilização eficaz deste método de análise começa com a seleção de segmentos dendríticos para traçado. Conforme descrito na Figura 1, os dendritos ideais para rastreamento não estão próximos a outros dendritos. Dendritos executados em paralelo podem resultar na identificação inadequada de espinhos de um dendrito vizinho. Os dendritos que se cruzam diretamente ou correm perpendicularmente em um plano z diferente também adicionam dificuldade significativa ao traçado dendrítico preciso. Também...

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Discussão

Este protocolo detalha as etapas específicas de preparação da amostra, imagem e o processo de quantificação e classificação da coluna dendrítica usando software de reconstrução tridimensional. Este software é uma ferramenta poderosa capaz de produzir dados estruturais robustos que contribuem para uma gama diversificada de investigações. Ao longo do processo, existem algumas etapas críticas que tornam esse protocolo menos oneroso metodológico e melhoram a produção geral dos dados. O métod...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin e ao NIMH SNIR pela assistência técnica. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Grupo de Estudos de Pesquisa Biomédica Bethesda da Colgate University. Este trabalho é apoiado pelo Programa Intramural do NIMH (1ZIAMH002881 a Z.L.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
518F Óleo de ImersãoZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050SPara preparação de fatias
Pinça FinaFST11150-10
Pinça HemostatFST13020-12
Grande Tesoura CirúrgicaFST14002-16
LSM 880 Microscópio ConfocalZeissLSM 880
Vidro de Cobertura de MicroscópioFisherbrand12-541-035
Mini-Bomba Peristáltica IIAparelho Harvard70-2027Para perfusões
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Software de Análise de Coluna
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Software de Análise
de Coluna OCT CompoundSakura Finetek4583Para seccionamento de criostato
Paraformaldeído (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Óleo DICZeiss440762-9904-000
Lâmina de BisturiFST10022-00
Pequena Tesoura CirúrgicaFST14060-09
Espátula FST10091-12
SucroseFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus MicroslidesDiaggerES4951+
Vectashield HardSet Montagem MédiaVector LaboratoriesH-1400-10

Referências

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