Modelos de Ferida em Camundongos e Preparação de Suspensões de Células Únicas

Resumo

Este estudo apresenta duas técnicas experimentais cruciais: a construção de um modelo de ferida murina para avaliar o fechamento da ferida e a preparação de suspensões unicelulares de pele murina para preservar a viabilidade celular.

Resumo

O manejo de lesões cutâneas agudas de espessura total apresenta um desafio considerável na prática clínica. A complexidade da cicatrização de feridas, envolvendo diversas populações de células e o intrincado microambiente da ferida, complica a avaliação dos efeitos do tratamento e suas interações usando abordagens experimentais tradicionais. A tecnologia de sequenciamento de transcriptoma de célula única revolucionou a compreensão das funções e mecanismos celulares durante a cicatrização de feridas. No entanto, a variabilidade nas metodologias para a criação de modelos de feridas em camundongos introduz fatores de confusão que podem impactar os resultados experimentais. Além disso, o processo de dissociação de tecidos da pele de camundongos apresenta obstáculos técnicos significativos, destacando a necessidade crítica de suspensões unicelulares de alta qualidade para sequenciamento preciso do transcriptoma. Portanto, este estudo visa otimizar a construção de modelos de feridas em camundongos para avaliar com precisão as mudanças no fechamento da ferida, eliminando variáveis que possam influenciar o resultado do sequenciamento subsequente. Além disso, a preparação de suspensões unicelulares foi realizada usando protocolos de preparação enzimática e protocolos de kit de teste para otimizar o custo e a eficácia.

Introdução

O camundongo é um modelo animal amplamente reconhecido em pesquisas por sua sequência genética altamente homóloga aos humanos, reprodução rápida, custo-benefício e tamanho gerenciável¹. No entanto, existem diferenças na estrutura da pele entre camundongos e humanos. Os camundongos têm uma camada de membrana cutânea distinta que contribui para a contração da pele, desempenhando um papel crucial na cicatrização de feridas nesta espécie. Em contraste, a cicatrização de feridas humanas envolve principalmente a reepitelização e a formação de tecido de granulação¹.

Apesar dessas diferenças interespécies na estrutura da pele, o modelo de camundongo continua sendo a escolha preferida na pesquisa de reparo de feridas e mantém importância significativa em comparação com outros modelos animais^2,3. Ao usar a pele de camundongo para imitar os processos de cicatrização de feridas humanas, é essencial considerar cuidadosamente vários fatores de influência. Esses fatores incluem a seleção de locais apropriados para procedimentos cirúrgicos, a contabilização do ciclo do folículo piloso do camundongo e a compreensão dos efeitos da contração da membrana cutânea^4,5. A implementação de medidas correspondentes é vital para otimizar as condições experimentais e melhorar a precisão dos resultados observacionais.

O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) sequencia células em um nível muito mais refinado do que o sequenciamento de RNA convencional e tem um requisito muito maior de qualidade de amostra com diferenças intragrupo mínimas. Vários experimentos foram conduzidos para refinar um modelo estável de defeito cutâneo de espessura total aguda de camundongo. Esses experimentos utilizaram uma combinação de métodos estabelecidos da literatura e abordagens inovadoras para avaliar a cicatrização de feridas de forma abrangente^2,5. Para desenvolver o modelo de cicatrização de feridas, a excisão de pele de espessura total de camundongos foi usada para replicar o processo fisiológico de reparo e regeneração de feridas. Seu objetivo foi avaliar as potenciais alterações induzidas por vários tratamentos usando scRNA-seq. A dissociação do tecido cutâneo de camundongos apresenta desafios, incluindo baixa viabilidade celular e altas taxas de agregação, durante a preparação de suspensões unicelulares⁶. Essas dificuldades podem resultar em problemas como entupimento de instrumentos e captura de células anômalas, o que pode comprometer a qualidade dos dados. Dado o custo considerável do sequenciamento de célula única, a realização de vários experimentos preliminares é crucial para garantir a estabilidade e a confiabilidade da suspensão de célula única. Este estudo avaliou a eficácia da dissociação enzimática mista e do método de dissociação do kit de tecidos para identificar a abordagem ideal para a dissociação tecidual^6,7. Este estudo estabelece uma base sólida para investigações mais aprofundadas.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do sétimo Centro Médico do Hospital Geral do PLA Chinês, China. Foram utilizados camundongos C57/BL6 machos com 6 semanas de idade.

1. Modelo de cicatrização de feridas de camundongo

1. Agrupamento animal
   1. Atribua aleatoriamente camundongos aos grupos experimental e controle (6 cada). Camundongos domésticos em uma instalação específica para animais livres de patógenos (SPF), com temperatura mantida em 23-25 °C, umidade em 50%-60% e um ciclo claro-escuro de 12 horas.
   2. Forneça aos ratos acesso irrestrito a alimentos padrão e água da torneira autoclavada.
2. Preparo pré-operatório
   1. Segure suavemente o mouse usando um limitador ou segurando-o firmemente em uma posição de bruços. Carregue a seringa com pentobarbital sódico a 1% restaurado à temperatura ambiente, administrado na dose de 0,1 mL / 20 g de peso corporal.
      NOTA: A solução de pentobarbital sódico a 1% deve ser armazenada em ambiente escuro a 4 °C.
   2. Limpe o abdômen do rato com cotonetes com álcool. Insira a seringa ligeiramente inclinada no abdómen. Aspire antes da injeção para evitar a administração inadvertida na bexiga ou nos intestinos. Aguarde 10 min.
   3. Depois que o mouse parar de se contorcer e não responder mais aos estímulos, aplique vaselina branca em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Use um barbeador para aparar o pelo dorsal mais longo.
   4. Aplique o creme depilatório nas costas, aguarde 2 minutos e limpe suavemente com gaze úmida para evitar danificar a pele do camundongo. Certifique-se de que o creme depilatório não seja deixado por um longo período.
   5. Desinfete suavemente a pele ao redor com três cotonetes alternados de betadine e álcool 70%.
   6. Punção de biópsia de pele em autoclave, tesouras, pinças e outros instrumentos para esterilização. Mantenha um espaço de trabalho estéril. Realize a cirurgia subsequente em um pano cirúrgico novo.
3. Excisão de pele de espessura total
   NOTA: O modelo de tala de ferida foi usado para avaliar a eficácia do tratamento para a cicatrização de feridas.
   1. Usando um marcador permanente, marque a área central superior da região dorsal do camundongo com um círculo de 8 mm de diâmetro.
   2. Levante a pele dorsal com uma pinça limpa e faça o primeiro corte com uma tesoura cirúrgica fina. Após o primeiro corte, segure a área da pele parcialmente removida usando uma pinça e corte cuidadosamente os círculos marcados.
   3. Use um anel de aço inoxidável projetado sob medida (diâmetro interno de 15 mm, diâmetro externo de 18 mm). Suturar o anel metálico na periferia do local da incisão com pontos inabsorvíveis 5-0, evitando a contração da pele do local da incisão (Figura 1A). Use aço inoxidável como material do anel para evitar ferrugem e deformação.
   4. Administre uma única injeção subcutânea de 0,1 mL de diluição de cloridrato de buprenorfina a 10% perto da ferida para tratar a dor pós-cirúrgica.
   5. Reintroduza o mouse para limpar gaiolas individuais. Coloque o mouse em uma posição de bruços. Não deixe o mouse sem vigilância antes que ele recupere a consciência.
   6. Observe e fotografe a ferida do camundongo a cada 2 dias para medir o tamanho da ferida após a anestesia, conforme descrito na etapa 1.2.
4. Marcação de carimbo de ferida para obtenção de tecido de biópsia
   1. Prepare-se para o experimento conforme descrito nas etapas 1.1 e 1.2.
   2. Crie carimbos personalizados de marcação de ferida de mouse com um diâmetro de círculo de 8 mm e um comprimento de lado quadrado de 10 mm (Figura 1B).
   3. Posicione o mouse em uma postura de bruços e desinfete a pele dorsal com cotonetes com álcool. Mergulhe o carimbo em tinta. Faça uma marca na parte superior central das costas do mouse com o carimbo.
   4. Extirpar cuidadosamente toda a camada de pele das costas ao longo da marca circular usando uma tesoura cirúrgica, expondo completamente a camada muscular. Deixe a ferida aberta sem curativo para evitar interferir no estado da ferida. Mantenha a esterilidade da ferida colocando o camundongo em um ambiente limpo e desinfetado e permitindo que a ferida forme naturalmente uma crosta.
   5. Administre uma única injeção subcutânea de 0,1 mL de diluição de cloridrato de buprenorfina a 10% perto da ferida para tratar a dor pós-cirúrgica.
   6. Reintroduza o mouse para limpar gaiolas individuais. Coloque o mouse em uma posição de bruços. Não deixe o mouse sem vigilância antes que ele recupere a consciência.
   7. Observe e fotografe a ferida do camundongo a cada 2 dias para medir o tamanho da ferida após a anestesia, conforme descrito na etapa 1.2.
   8. Realize a administração do tratamento conforme descrito em 1.4
5. Administração de tratamento
   1. Às 4 h após o rato recuperar a consciência, execute a anestesia conforme descrito nos passos 1.2.2-1.2.3.
   2. Injete subcutaneamente o tratamento desejado, aqui 100 μg de exossomo derivado de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hucMSC-Exo) dissolvido em 200 μL de PBS ao redor do local da incisão para o grupo de tratamento.
   3. Injete subcutaneamente 200 μL de PBS ao redor do local da incisão para o grupo controle.
   4. Repita as etapas 1.5.2 e 1.5.3 a cada dois dias por até 14 dias. Inspecione o local da injeção quanto a inchaço, vermelhidão ou sinais de infecção.

2. Preparação para sequenciamento de RNA de célula única

1. Coleta e preparação de tecidos
   1. Execute a anestesia conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.3.
   2. Levante a pele dorsal usando uma pinça limpa e remova as crostas. Corte cerca de 2 cm² de pele perto da ferida, aparando o tecido adiposo e os grandes vasos sanguíneos.
   3. Transfira a biópsia de pele com pinça estéril para um poço de uma placa de 6 poços preenchida com 4 mL de PBS pré-resfriados.
   4. Lave com PBS transferindo sequencialmente a biópsia para novos poços (placa de 6 poços) preenchidos com 4 mL de PBS até que nenhum sangue visível esteja presente.
   5. Corte a pele com um bisturi em pedaços de aproximadamente 2 mm, lavando posteriormente em DPBS contendo 0,04% de BSA e removendo quaisquer detritos.
2. Dissociação enzimática (Figura 2)
   1. Combine 1 mL de colagenase I (10 mg / mL), 1 mL de colagenase IV (5 mg / mL), 1 mL de colagenase D + Dispase II (15 mg / mL), 1 mL de DNase I (5 mg / mL) e 6 mL de DPBS em um tubo cônico estéril para preparar a solução de digestão. Misture bem os componentes para garantir a homogeneidade.
   2. Colocar o tubo cónico num banho-maria regulado para 37 °C durante 10 min para pré-aquecer a solução de digestão.
   3. Adicione 2,5 mL de solução de digestão ao tecido e digerir a 37 ° C por 70 min, virando o tubo de ensaio a cada 10 min para uma mistura completa.
   4. Pré-umedeça um filtro de 70 μm com tampão de lavagem (0,2% BSA em PBS). Transfira a mistura de reação, incluindo células dissociadas e fragmentos de tecido residual, usando uma ponta de pipeta de 1 mL de diâmetro largo no filtro.
   5. Filtrar esta mistura através do filtro de células pré-humedecido de 70 μm para um tubo de centrifugação de 15 ml.
   6. Centrifugar a mistura de reacção com o tecido digerido a 300 x g, à temperatura ambiente, durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento (células) para a fase de dissociação seguinte.
3. Lise de glóbulos vermelhos
   1. Diluir a solução de lise dos glóbulos vermelhos (10x) na proporção de 1:10 com água bidestilada Dilua as células com 1x solução de lise de glóbulos vermelhos na proporção de 1:10 em um tubo cônico.
   2. Vortex a mistura por 5 s, incubar em temperatura ambiente por 2 min e depois centrifugar a 300 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células em igual volume DPBS e armazená-las no gelo.
4. filtração
   1. Recupere a suspensão celular e filtre-a através de um filtro de 40 μm para um novo tubo cônico.
   2. Enxágue o tubo 2x com 4.5 mL de RPMI (10% FCS) para garantir a coleta de quaisquer células restantes.
   3. Prossiga para centrifugar a suspensão da célula a 300 x g à temperatura ambiente por 5 min.
   4. Descarte o sobrenadante, sacuda suavemente o pellet e ressuspenda as células com pontas de diâmetro largo em 50 μL de 0,04% BSA PBS. Mantenha as células no gelo durante todo esse processo.
5. Remoção de células mortas
   1. Misture o tampão de estoque 20x do kit de remoção de células mortas com água livre de nuclease na proporção de 1:20 para obter um tampão de ligação de 1x.
   2. Centrifugue a amostra a 300 x g, remova o sobrenadante e adicione 10 μL de microesferas de remoção de células mortas para 60 mg de amostra de pele.
   3. Incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicione o tampão de estoque até atingir 500 μL. Carregue a amostra na coluna preparada no kit e conecte-a ao dissociador.
   4. Execute o programa dissociador para separar células vivas. Após o término do programa, filtrar a suspensão através de um filtro de 30 μm e diluí-la com igual volume D-PBS.
      NOTA: Se a velocidade de gotejamento diminuir visivelmente, substitua imediatamente a coluna para evitar que as impurezas bloqueiem os poros e afetem a recuperação celular.
   5. Realize a coloração de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) e a contagem de células usando um contador de células automatizado. Use os seguintes critérios de aceitação: viabilidade celular ≥ 85%, taxa de agregação celular < 20% e ausência de glóbulos vermelhos ou fragmentos de células visíveis.
6. Procedimento de dissociação para o kit de dissociação multitecido (alternativa)
   1. Misture 2,5 mL de RPMI 1640, 100 μL de Enzima D, 50 μL de Enzima R e 12,5 μL de Enzima A1 em um tubo MACS C suave (componentes do Kit de Dissociação de Múltiplos Tecidos).
   2. Transfira o tecido para o tubo MACS C suave que contém a mistura enzimática e feche-o firmemente.
   3. Coloque o tubo a 37 °C em banho-maria por 90 min com inversão suave a cada 10 min para garantir a exposição adequada do tecido à solução de dissociação.
   4. Descarte a solução de dissociação e lave os tecidos com DPBS.
   5. Passar as suspensões unicelulares por filtros de células de 70 μm e 40 μm sequencialmente e centrifugar a 4 °C durante 10 min a 300 x g.
   6. Lise os glóbulos vermelhos usando o reagente de lise dos glóbulos vermelhos seguindo o mesmo procedimento da etapa 2.3.
   7. Remova as células mortas usando o kit de remoção de células mortas seguindo o mesmo procedimento da etapa 2.5⁸.
   8. Realize a coloração AO/PI e a contagem de células usando um contador de células automatizado. Use os seguintes critérios de aceitação: viabilidade celular ≥ 85%, taxa de agregação celular < 20% e ausência de glóbulos vermelhos ou fragmentos de células visíveis.

Resultados

Foram exploradas múltiplas variações do procedimento. Os protocolos de carimbo foram preferidos, pois apresentam interferência mínima no processo de cicatrização e mantêm a integridade da ferida frente a influências como arranhões e suturas. Isso evita introduzir ruído em nível de célula única para o sequenciamento subsequente. A colocação de feridas em ambos os lados de um camundongo resultou em diferenças notáveis na área da ferida devido à elasticidade inerente da pele do camundongo (Figura 3A

Discussão

Várias etapas cruciais foram essenciais para o sucesso do protocolo. Essas etapas incluíram a preparação precisa da área da ferida por meio de barbear e limpeza completos, criar feridas padronizadas de tamanho e profundidade específicos e cuidados diligentes pós-ferida para monitorar infecções e administrar tratamentos apropriados. A padronização desses procedimentos garantiu consistência entre as condições experimentais, aumentando assim a confiabilidade e a reprodutibilidade dos resultados¹⁰.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
75% Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
camundongos C57/BL6J	Charles River Laboratories
Collagenase D + Dispase II	Roche	11088858001
Collagenase I	Roche	5349907103
Collagenase IV	Roche	5267439001
Cotonetes	Haishi	MIANQIAN
Kit de Remoção de Células Mortas	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
gentleMAC Dissociador	Miltenyi Biotec	130-093-235
Fio de nylon médico	Jinlong	HM507
Kit de dissociação de múltiplos tecidos 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
punch agulha de biópsia	Integra Miltex
solução de lise de glóbulos vermelhos	Miltenyi Biotec	130-094-183
Tesoura cirúrgica	Jinglu	JIANDAO
Petrolato branco	Shangyuan	BAIFANSHILIN