Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

Uma quebra de fita dupla de DNA (DSB) é a forma mais deletéria de dano ao DNA, potencialmente levando à instabilidade do genoma, rearranjos cromossômicos, senescência celular e morte celular se não for reparada prontamente¹. Duas vias bem estabelecidas, junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR), são reconhecidas por sua eficácia no tratamento de DSBs de DNA ^2,3. A HR é considerada um mecanismo livre de erros para o reparo de DSB, utilizando sequências homólogas na cromátide irmã como modelo para restaurar a configuração original da molécula de DNA lesionada³. O NHEJ, por outro lado, é uma via de reparo de DSB propensa a erros que une as extremidades quebradas do DNA sem depender de nenhum modelo².

O ensaio NHEJ e o ensaio HR são métodos clássicos originalmente desenvolvidos no laboratório de Jasin no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center e utilizados para quantificar a eficiência de NHEJ e HR, respectivamente 4,5,6,7. Esses ensaios desempenham um papel crucial na investigação dos mecanismos e fatores relevantes associados ao NHEJ e HR 8,9,10,11,12,13,14. Ambos os ensaios dependem da implementação de dois repórteres de GFP interrompidos, EJ5-GFP e DR-GFP, para monitorar o reparo de DSBs induzidos pela endonuclease I-SceI. O repórter EJ5-GFP é empregado no ensaio NHEJ, enquanto o repórter DR-GFP é utilizado no ensaio HR. Cada repórter é sutilmente projetado para que os DSBs induzidos por I-SceI só possam ser reparados por uma via de reparo específica para restaurar um de expressão GFP ^4,5.

O ensaio NHEJ e o ensaio HR podem ser conduzidos usando uma abordagem cromossomicamente integrada ou extracromossômica^15,16. A abordagem cromossomicamente integrada requer a integração dos repórteres de GFP interrompidos no genoma, permitindo a análise do reparo de DSB dentro de um contexto cromossômico ^6,15. No entanto, essa abordagem requer passagem celular prolongada e é inadequada para estudos comparativos envolvendo várias linhagens celulares devido à integração cromossômica arbitrária, introduzindo um fator de confusão adicional além das diferenças inerentes. Neste protocolo, descrevemos o ensaio NHEJ extracromossômico e os ensaios HR, envolvendo a transfecção transitória dos plasmídeos GFP e I-SceI interrompidos em células HEK-293T, seguida de análise de citometria de fluxo (o fluxo de trabalho do experimento é mostrado na Figura 1). Esses ensaios repórteres não integrados foram originalmente relatados pelo laboratório de Jasin para estudar o reparo de ligações cruzadas de DNA¹⁶ e foram empregados para avaliar a eficiência do NHEJ e a eficiência da FC por vários laboratórios 9,10,11,12,13,14,17,18,19, incluindo o nosso ¹¹. Essas abordagens extracromossômicas facilitam a análise do reparo de DSB em estudos comparativos envolvendo várias linhagens celulares estáveis estabelecidas.

1. Isolamento de plasmídeo

1. Transformar E. coli competente com os plasmídeos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmídeo que expressa I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmídeo que expressa mCherry) (ver Tabela de Materiais) seguindo o protocolo de transformação padrão²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry pode ser substituído por outros plasmídeos que expressam mCherry ou DsRed.
2. Cultive a E. coli transformada em 500 mL de meio LB líquido suplementado com 100 μg / mL de ampicilina durante a noite a 37 ° C com agitação.
3. Isole os plasmídeos usando um kit de isolamento maxi de plasmídeo livre de endotoxinas disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
4. Quantificar as concentrações de plasmídeo usando espectrofotômetros de microvolume nanodrop. Ajustar a concentração plasmídica para 1 μg/μL.

2. Preparação e transfecção celular

1. Cultura de células HEK-293T em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Certifique-se de que as células HEK-293T ou células estáveis HEK-293T estabelecidas estejam em bom estado de crescimento.
   NOTA: As células congeladas devem passar por pelo menos duas rodadas de divisão antes da transfecção.
2. No dia anterior à transfecção, semeie as células HEK-293T em uma placa de 6 poços a 2 × 10⁵ células/poço para atingir cerca de 60% de confluência no dia seguinte.
3. No dia da transfecção, confirmar a confluência celular, visando aproximadamente 60%. Para o ensaio NHEJ, transfecte as células de amostra experimentais em uma placa de 6 poços com 1 μg de EJ5-GFP, 1 μg de pCBASceI e 1 μg de plasmídeos PCI2-HA-mCherry, usando um reagente de transfecção comercial seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para o ensaio HR, substitua o plasmídeo EJ5-GFP pelo plasmídeo DR-GFP.
4. Para controles de calibração FACS, deixe um poço de células não transfectado como controle negativo. Transfecte as células em uma placa de 6 poços com (1) 1 μg de EJ5-GFP (para ensaio NHEJ) ou 1 μg de DR-GFP (para ensaio HR), juntamente com 1 μg de pCBASceI como um controle de cor única GFP, ou (2) 1 μg de PCI2-HA-mCherry como um controle de cor única mCherry.

3. Análise das células GFP-positivas e mCherry-positivas por citometria de fluxo

1. Dois dias após a transfecção, confirmar a expressão das proteínas GFP e mCherry usando um microscópio fluorescente.
2. Três dias após a transfecção, remova o meio dos poços, lave uma vez com PBS e adicione 500 μL de tripsina a cada poço. Incubar durante 5 min a 37 °C para separar todas as células da placa. Ao longo desta e das etapas subsequentes, proteja as células da luz direta.
3. Adicione 500 μL de meio DMEM completo a cada poço, ressuspenda as células, garantindo que nenhum aglomerado seja visível.
4. Transfira todas as células de cada poço para tubos de centrífuga de 1,5 mL e, em seguida, centrifugue as células por 2 min a 1000 × g à temperatura ambiente.
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando e lave uma vez com 1,0 mL de PBS.
6. Novamente, remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando, ressuspenda as células em 500 μL de PBS e transfira as células para tubos FACS (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Para obter os melhores resultados, inicie a análise de citometria de fluxo imediatamente após a colheita da célula. Alternativamente, as células podem ser armazenadas no gelo por várias horas.
7. Calibre o FACS com células não transfectadas (controle negativo), células transfectadas EJ5-GFP/DR-GFP e pCBASceI (controle de cor única GFP) e células transfectadas mCherry (controle de cor única mCherry). Ajuste a tensão e a compensação para minimizar o transbordamento de fluorescência entre GFP e mCherry.
8. Adquira e registre pelo menos 10.000 células intactas de cada tubo.

4. Análise dos dados

NOTA: As etapas a seguir são executadas usando o software FlowJo (consulte a Tabela de Materiais) para analisar os dados FACS. Procedimentos comparáveis podem ser executados em software de análise alternativo.

1. Arraste todos os arquivos FACS para o painel. Clique duas vezes em um dos arquivos para exibir o gráfico FSC/SSC.
2. Crie uma porta de polígono para selecionar células intactas, excluindo detritos no canto inferior esquerdo. Nomeie essa subpopulação como "Células Intactas" e arraste essa porta para a barra "Todas as Amostras". Percorra cada exemplo usando o botão Próximo Exemplo para garantir o controle apropriado para cada exemplo (Figura 2A).
3. Clique duas vezes na subpopulação Células Intactas da amostra de controle negativo (células não transfectadas) para abrir um novo gráfico. Altere os eixos para FL1-H (eixo x, GFP) e FL2-H (eixo y, mCherry).
4. Selecione a ferramenta Quad Gating e clique no extremo superior direito da população de células negativas (Figura 2B). Arraste os quatro portões retangulares para a barra "Células intactas". Percorra as amostras de controle de cor única GFP ou controle de cor única mCherry usando o botão Next Sample para garantir o gating apropriado para discriminar células de controle GFP-positivo ou mCherry positivo de negativo (Figura 2C, D). Ajuste o gating do quadrante, se necessário, e aplique esse gating a todas as populações de "Células Intactas".
5. Clique no Editor de Layout. Clique com o botão direito do mouse nas plotagens representativas e escolha Copiar para o Editor de layout. Selecione todos os gráficos representativos e clique duas vezes para abrir a Definição de gráfico. Ajuste o rótulo do eixo, anote e legenda conforme desejado.
6. A porcentagem de células positivas para mCherry em amostras experimentais serve como controle da eficiência da transfecção. Calcule a eficiência relativa de reparo do DNA comparando o número de células positivas para GFP com o número de células positivas para mCherry no mesmo gráfico.

Para garantir a precisão da análise de NHEJ e RH, é necessária a implementação de uma estratégia adequada de ajuste e controle de remuneração. Normalmente, a fluorescência mCherry não se manifesta no detector GFP ao usar um filtro de 530 nm. No entanto, em casos de células exibindo expressão de GFP extremamente alta, a fluorescência de GFP pode contaminar o detector mCherry ao usar um filtro de 575 nm. Para resolver essas preocupações, o controle negativo, o controle de cor única GFP e as amostras de controle de cor única mCherry foram usados para compensação e para regular a estratégia de gating. Os resultados típicos do FACS das células de controle são mostrados na Figura 2. O ajuste de compensação e a estratégia de gating devem posicionar a maioria das células positivas para GFP no quadrante inferior direito (Figura 2C) e a maioria das células positivas para mCherry no quadrante superior esquerdo (Figura 2D).

As parcelas representativas finais são mostradas na Figura 3A,B. Após a indução de DSBs pelo I-SceI, os eventos de reparo bem-sucedidos reconstituirão o gene GFP. Portanto, a porcentagem de células positivas para GFP corresponde à eficiência do reparo do DNA DSB e à eficiência da transfecção. A porcentagem de células positivas para mCherry corresponde apenas à eficiência da transfecção. A eficiência relativa do reparo do DNA DSB pode ser calculada como a proporção de células positivas para GFP e células positivas para mCherry ( Figura 3C ).

Um exemplo concreto do ensaio NHEJ para caracterizar o papel da proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich e do homólogo SCAR (WASH) no reparo do DNA é mostrado na Figura 4. Neste exemplo, realizamos o ensaio NHEJ para avaliar a eficiência NHEJ das células shControl e shWASH (Figura 4). Obviamente, a perda de WASH resultou em uma redução na eficiência do NHEJ, confirmando o papel do WASH na promoção da eficiência do NHEJ, conforme determinado pelo ensaio NHEJ.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho para o ensaio NHEJ/HR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estratégia de gating para análise de citometria de fluxo. (A) Gating FSC-H / SSC-H em células intactas. (B) Células HEK-293T não transfectadas foram usadas como controle negativo para excluir células autofluorescentes. (C) Células HEK-293T transfectadas com plasmídeos EJ5-GFP e pCBASceI foram usadas para definir o gating para células GFP-positivas. (D) Células HEK-293T transfectadas com plasmídeos mCherry foram usadas para definir o gating para células mCherry positivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados típicos. (A) Gráficos representativos que ilustram a análise do NHEJ. (B) Gráficos representativos ilustrando a análise da FC. (C) Diagrama modelo do método de cálculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: WASH promove a eficiência do NHEJ. (A) Gráficos representativos que ilustram a análise da eficiência do NHEJ em células shControl e células shWASH. (B) Resultados estatísticos representativos comparando a eficiência do NHEJ entre as células shControl e shWASH. Os dados são apresentados como ± média DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não há conflitos de interesse a serem divulgados.