Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

As quebras de fita dupla de DNA representam as lesões de DNA mais perigosas. Em resposta, as células empregam dois mecanismos primários para o reparo de quebra de fita dupla de DNA, NHEJ e HR. Quantificar a eficiência do NHEJ e da FC separadamente é crucial para explorar os mecanismos e fatores relevantes associados a eles. O ensaio NHEJ e o ensaio HR são métodos estabelecidos usados para medir a eficiência do NHEJ e HR. Esses métodos dependem de plasmídeos meticulosamente projetados que contêm um gene de proteína fluorescente verde interrompido com locais de reconhecimento para endonuclease I-SceI para indução de DSBs.

O ensaio NHEJ e o ensaio HR podem ser conduzidos usando uma abordagem cromossomicamente integrada ou extracromossômica. A abordagem cromossomicamente integrada permite a análise do reparo de DSB dentro de uma competição cromossomal. No entanto, a abordagem cromossomicamente integrada requer células prolongadas e não é adequada para estudos comparativos envolvendo múltiplas linhagens celulares.

Neste protocolo, descrevemos os ensaios extracromossômicos de NHEJ e HR envolvendo a transfecção transitória dos plasmídeos GFP e I-SceI interrompidos em células HEK-293T e subsequente análise de citometria de fluxo. Esses ensaios repórteres não integrados foram empregados para avaliar a eficiência do NHEJ e a eficiência do RH por vários laboratórios, incluindo o nosso. Em contraste com a abordagem cromossomicamente integrada, essa abordagem extracromossômica permite uma análise rápida da eficiência do NHEJ ou HR por meio da utilização de linhagens celulares estabelecidas e estáveis.