Artigo de método

Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 de maio de 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.

Resumo

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As mudanças na concentração de cálcio nas células são rapidamente monitoradas de forma de alto rendimento com o uso de corantes intracelulares, fluorescentes e de ligação ao cálcio e instrumentos de imagem que podem medir as emissões fluorescentes de até 1.536 poços simultaneamente. No entanto, esses instrumentos são muito mais caros e podem ser difíceis de manter em relação aos leitores de placas amplamente disponíveis que escaneiam os poços individualmente. Aqui é descrito um ensaio otimizado de leitor de placas para uso com uma linhagem de células endoteliais (EA.hy926) para medir a ativação acionada pelo receptor ativado por protease (PAR) da sinalização Gαq e subsequente mobilização de cálcio usando o corante de ligação ao cálcio Fluo-4. Este ensaio foi usado para caracterizar uma variedade de ligantes PAR, incluindo os ligantes anti-inflamatórios alostéricos de "parmodulina" direcionados a PAR1 identificados no laboratório de Dockendorff. Este protocolo evita a necessidade de um manipulador de líquido automatizado e permite a triagem de médio rendimento de ligantes PAR em placas de 96 poços e deve ser aplicável ao estudo de outros receptores que iniciam a mobilização de cálcio.

Introdução

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Os receptores ativados por protease (PARs)1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais 4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas os PARs são ativados pela clivagem proteolítica do terminal N, o que resulta em um novo ligante amarrado que pode interagir com o domínio da alça extracelular 2 na superfície de uma célula 6,8,9. Essa interação ativa o receptor e pode iniciar várias vias de sinalização, promovendo efeitos como inflamação e ativação plaquetária 4,10,11,12. Diferentes proteases podem ativar PARs por meio de clivagem em locais únicos no terminal N, revelando diferentes ligantes amarrados (TL) que estabilizam as conformações do receptor, que iniciam diferentes vias de sinalização 9,13,14,15. Por exemplo, no membro mais bem estudado da subfamília, PAR1, a clivagem pela trombina é usada para apoiar vários processos biológicos, incluindo ativação plaquetária e recrutamento de leucócitos para o endotélio, mas pode levar a efeitos deletérios quando o receptor é superexpresso ou superativado 4,16,17,18,19,20,21 . Por outro lado, a clivagem pela proteína C ativada (aPC) pode promover efeitos anti-inflamatórios e manutenção das barreiras endoteliais 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Os PARs também podem ser ativados por análogos peptídicos dos TLs de forma intermolecular 13,30,31. Esses peptídeos são rotineiramente usados para medir a inibição (modulação) de PAR no lugar de proteases direcionadas a PAR, e são usados neste protocolo.

Numerosos distúrbios estão associados à sinalização patológica de PAR1, incluindo sepse22,32, doença cardiovascular 33,34,35,36,37,38, doença renal 39,40,41,42, doença falciforme43, fibrose 44, osteoporose e osteoartrite45,46, neurodegeneração 47,48,49,50,51 e câncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Os antagonistas do PAR1 têm sido estudados desde a década de 1990 como agentes antiplaquetários para doenças cardiovasculares, e a crescente lista de doenças associadas ao receptor requer a identificação de novos ligantes para uso como sondas biológicas (compostos de ferramentas) ou como potenciais terapêuticos. Atualmente, existe apenas um antagonista PAR1 aprovado pela FDA, o vorapaxar, que é usado para tratar a doença arterial coronariana em pacientes de alto risco 34,36,37,60. Um antagonista alternativo de PAR1, a pepducina PZ-128, completou um estudo de fase II bem-sucedido para prevenir trombose em pacientes com cateterismo cardíaco38. O grupo de Dockendorff concentrou-se na química medicinal e farmacologia de uma classe separada de pequenas moléculas, ligantes PAR1 conhecidos como parmodulinas 61,62. Ao contrário dos antagonistas de PAR1 relatados, como o vorapaxar, as parmodulinas são moduladores alostéricos e tendenciosos de PAR1 que bloqueiam seletivamente a via Gαq enquanto promovem efeitos citoprotetores semelhantes ao aPC. Ao contrário dos potentes antagonistas ortostéricos de PAR1, como o vorapaxar, as parmodulinas publicadas também são reversíveis 63,64,65.

Inicialmente, as parmodulinas foram identificadas por Flaumenhaft e colaboradores por sua capacidade de inibir a expressão da P-selectina ou a secreção de grânulos nas plaquetas61,66. No entanto, um método alternativo foi necessário para estudar os efeitos das parmodulinas nas células endoteliais. Um método comum para monitorar a sinalização relacionada ao GPCR é medir a mobilização intracelular de Ca2+, um importante mensageiro secundário que pode ser medido usando um corante de ligação de cálcio intracelular adequado67,68. Evidências substanciais foram fornecidas mostrando que a mobilização de cálcio induzida por PAR1 é através da ativação de Gαq69,70. Uma vez ativado por seu ligante ligado (ou um ligante exógeno adequado), o PAR1 sofre uma mudança conformacional que faz com que o difosfato de guanosina (GDP) ligado à subunidade Gαq seja substituído por trifosfato de guanosina (GTP) 68 . A subunidade Gαq então ativa a fosfolipase Cβ (PLC-β), que catalisa a hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). Finalmente, o IP3 se liga aos canais de Ca2+ sensíveis ao IP3 na membrana do retículo endoplasmático, permitindo que o Ca2+ seja liberado no citoplasma, onde pode se ligar a corantes fluorescentes dependentes de Ca2+, como o Fluo-4, que são adicionados às células71. Esse processo ocorre em segundos e pode aumentar a concentração de Ca2+ em 100 vezes, levando a uma mudança drástica na quantidade de corante ligado ao cálcio e a um sinal de fluorescência robusto.

Em 2018, o grupo de Dockendorff divulgou um ensaio de mobilização de Ca2+ de médio rendimento que poderia ser usado para identificar antagonistas da via Gαq de PAR172. O ensaio utilizou EA.hy92673, uma linhagem de células endoteliais humanas híbridas, que pode ser usada para múltiplas passagens sem uma alteração perceptível na expressão de PAR1, e é estabelecida para medições in vitro de efeitos citoprotetores.

O protocolo original utilizava células EA.hy926 em placas de 96 poços e carregadas com corante Fluo-4/AM, que foi escolhido devido à sua intensa fluorescência a 488 nm e alta permeabilidade celular. Uma vez que o corante foi carregado nas células, longas etapas de lavagem foram realizadas com um manipulador de líquido automatizado de 8 canais (métodos mais rápidos de manuseio de líquidos, como uma lavadora de 96 canais, eram inacessíveis). A reprodutibilidade deste ensaio foi superior àquela sem as mudanças cuidadosas e automatizadas de meios robóticos. Os antagonistas foram então incubados com as células, o PAR1 foi ativado através da adição sequencial de um agonista seletivo (16 poços por vez) e as alterações na fluorescência resultantes da mobilização de cálcio e ligação do corante foram medidas para determinar a atividade.

Embora este protocolo permita a medição da mobilização de cálcio mediada por PAR1, ele é limitado pelo tempo necessário para analisar cada placa de 96 poços. Longos tempos de experimento são problemáticos não apenas porque o número de compostos que podem ser rastreados a cada dia é limitado, mas também porque o efluxo de corante ocorre ao longo do tempo, estreitando a janela de ensaio aumentando a fluorescência basal. Um contribuinte para o longo tempo do experimento é o uso de um manipulador de líquidos de 8 canais para lavagem de chapas, que adiciona mais de 30 minutos a cada experimento. As dicas necessárias também se tornaram difíceis de obter devido a problemas na cadeia de suprimentos. Aqui, é relatado um protocolo atualizado para o ensaio de mobilização de cálcio mediado por PAR que não requer um manipulador de líquido e, portanto, pode ser executado em maior rendimento. Este protocolo também deve ser adequado para medir a sinalização com outros GPCRs que levam à mobilização intracelular de cálcio. Este protocolo de leitor de placas atualizado é ideal para laboratórios acadêmicos e industriais pequenos que não têm recursos para instrumentos caros de imagem celular, mas precisam rastrear rapidamente vários compostos. Para um exemplo de um ensaio de mobilização de cálcio usando um imageador de placas, ver Caers et al.74.

Protocolo

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Todas as trocas/adições de mídia feitas nas etapas 1 e 2 do protocolo a seguir são realizadas em uma coifa estéril. Salvo indicação em contrário, todos os utensílios de plástico usados no capô estéril devem ser adquiridos esterilizados e selados ou esterilizados adequadamente por autoclave.

1. Iniciação da linhagem celular EA.hy926

  1. Adquira células EA.hy926.
  2. Armazene o(s) frasco(s) para injetáveis de células na fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido.
  3. Prepare o meio completo de DMEM aquecendo primeiro DMEM, FBS e caneta/estreptococo (consulte a Tabela de Materiais para detalhes específicos) em banho-maria a 37 °C por 15-30 min. Adicione 50 mL de FBS e 1 mL de caneta/estreptococo a 500 mL de DMEM. Misture suavemente a solução por inversão.
    NOTA: Misturar com muita força causa quantidades excessivas de bolhas.
  4. Remover um frasco para injetáveis de células de azoto líquido e aquecer num banho-maria a 37 °C durante 5 min.
  5. Esterilize o frasco de células e o frasco de meio completo DMEM pulverizando com álcool e, em seguida, passe para o capuz estéril.
  6. Use uma pipeta de 1.000 μL para transferir cuidadosamente as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Adicione 1 ml de DMEM ao frasco para enxaguar e adicione ao tubo de centrifugação.
  7. Fazer um grânulo de células com uma centrifugadora (150 × g, 5 min, 22 °C). Remover o meio do tubo de centrifugação por aspiração; Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  8. Adicione 3 mL de meio completo DMEM ao tubo de centrífuga e quebre suavemente o pellet misturando a suspensão celular usando uma pipeta de 1.000 μL.
    NOTA: Deve-se evitar causar bolhas ao misturar com muita força, pois isso pode ativar ou danificar as células.
  9. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μl de azul de tripano num tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta com ponteiras de 20 μL ou 200 μL. Adicione 10 μL da mistura de suspensão celular/azul de tripano a um hemocitômetro e conte as células.
    NOTA: O uso de ponteiras de pipeta de 0,1-10 μL pode cisalhar as células. Pontas desse tamanho não devem ser usadas durante o manuseio da suspensão da célula.
  10. Adicione o meio completo DMEM à suspensão celular para fazer uma densidade de 66.000 células/mL usando uma pipeta sorológica de 10 ou 25 mL. Pipetar 15 ml da suspensão celular para o(s) balão(ões) de cultura T-75. Assegurar uma dispersão igual da suspensão celular, deslocando o balão de norte para sul e de leste para oeste.
  11. Incube as células até que atinjam a confluência (normalmente após 4-6 dias), conforme estimado pelo exame ao microscópio. Neste ponto, use as células do experimento (começando com a seção 2) ou semeie-as em novos frascos para expansão para preparar estoques congelados (a uma densidade de semeadura recomendada de 1.000.000 de células em 15 mL de meio completo por frasco T-75).
    NOTA: As células podem ser cultivadas nos frascos de cultura por até 3 semanas sem uma diferença perceptível na forma, saúde ou desempenho no ensaio. O meio completo deve ser trocado a cada 3-4 dias.

2. Adição de células EA.hy926 a placas de 96 poços

NOTA: As células de um frasco de cultura T-75 confluente podem ser usadas para preparar duas ou três placas de ensaio ou, opcionalmente, expandidas em até 15 frascos T-75 frescos. Pelo menos cinco placas de ensaio podem ser rastreadas usando o protocolo nas seções 4 e 5 em um dia normal de trabalho. As instruções a seguir descrevem a preparação e o teste de uma placa de ensaio, mas placas adicionais podem ser preparadas repetindo as etapas 2.2, 2.7, 2.12 e 3.2 para preparar o número desejado de placas de ensaio. Mais comumente, quatro placas de ensaio são preparadas por dia para medir as respostas de concentração com até 16 compostos, o que requer dois frascos T-75 com células confluentes.

  1. Aqueça o meio completo do DMEM em banho-maria a 37 °C por 15-30 min. Esterilize o frasco de meio completo DMEM borrifando-o com álcool e, em seguida, mova-o para o capuz estéril.
  2. Adicione 100 μL de uma solução esterilizada de gelatina a 0,4% a todos os poços de uma placa de parede preta, 96 poços, de fundo transparente com tampa. Incubar a placa com a solução de gelatina numa incubadora (37 °C, CO2 a 5%) durante 30 min.
  3. Confirmar se as células de um balão de cultura T-75 são 80-100% confluentes utilizando um microscópio invertido. Remover o meio completo DMEM do balão T-75 por aspiração.
  4. Lave as células do balão com 10 ml de PBS e mova suavemente o balão de norte para sul e de leste para oeste. Remover o PBS do balão por aspiração.
  5. Adicione 5 ml de solução de dissociação celular ao balão e incube o balão numa incubadora (37 °C, 5% CO2) durante ~12 min. Bata no frasco após 6 minutos para ajudar a facilitar a dissociação.
    NOTA: Incubar células por mais de 15 min com o agente de dissociação celular referenciado faz com que as células comecem a se aglomerar, o que dificulta a obtenção de uma contagem precisa de células e pode interferir no ensaio.
  6. Adicionar 5 ml do meio completo DMEM pré-aquecido ao balão e misturar suavemente na solução de dissociação celular/suspensão celular. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione a suspensão celular em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Fazer um grânulo de células utilizando uma centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Enquanto o pellet está sendo formado, remova a solução de gelatina da placa de 96 poços por aspiração usando uma pipeta Pasteur conectada a um vácuo. Remova a tampa da placa desde o momento da remoção da gelatina até que a solução esteja pronta para ser banhada.
    NOTA: Uma pipeta multicanal ou coletor estéril conectado a um vácuo pode ser usado opcionalmente.
  8. Remover o meio do tubo de centrifugação por aspiração com uma pipeta de Pasteur ligada a um vácuo ou a uma pipeta serológica; Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  9. Adicionar meio completo DMEM fresco ao tubo de centrifugação utilizando uma pipeta serológica de 5 ou 10 ml. Quebre suavemente o pellet celular misturando o meio completo DMEM com uma pipeta de 1.000 μL ou uma pipeta sorológica de 5 mL.
    NOTA: Oito mililitros de DMEM são normalmente usados, mas volumes maiores podem ser adicionados para facilitar a contagem de células.
  10. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μl de azul de tripano num tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta com ponteiras de 20 μL ou 200 μL. Adicione 10 μL da mistura de suspensão celular/azul de tripano a um hemocitômetro e conte as células.
  11. Adicione o meio completo de DMEM à suspensão celular para obter uma densidade de 600.000 células/mL usando uma pipeta sorológica de 10 ou 25 mL. Isso dará uma densidade final de 60.000 células/poço em uma placa de 96 poços (determinada como a densidade ideal por experimentação).
    NOTA: Uma cultura de células normal bem-sucedida produzirá entre 12.000.000 e 15.000.000 de células, que podem semear de duas a três placas de 96 poços.
  12. Misture a suspensão celular invertendo suavemente o tubo de centrífuga e adicione-o a um reservatório de pipeta multicanal de 50 mL. Misturando a suspensão no reservatório a cada 30 s, balançando suavemente o reservatório de um lado para o outro, adicione 100 μL da suspensão celular a cada poço usando uma pipeta multicanal. Recoloque a tampa transparente da placa e agite suavemente a placa deslizando-a na superfície do exaustor estéril de norte a sul e de leste a oeste para garantir uma distribuição uniforme das células. Incubar a placa na incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 16-24 h.
    NOTA: A suspensão celular adicional pode ser usada para preparar placas adicionais, ou as etapas 1.10-1.11 podem ser repetidas para continuar a linha celular.

3. Preparação do ensaio de mobilização de cálcio

  1. Preparar reagentes de ensaio.
    1. Prepare a solução de probenecida (250 mM, aquosa) adicionando 36 mg de probenecida a um tubo de microcentrífuga e dissolvendo-o em NaOH 0,6 M (500 μL). Vortex a solução.
      NOTA: A probenecida melhora a retenção de corante na célula, inibindo os transportadores de íons orgânicos 75,76,77.
    2. Para fazer o tampão de ensaio HBSS-HEPES, adicione HEPES (1,19 g) a um frasco de 500 mL de HBSS sem vermelho de Ca/Mg/fenol (fazendo uma solução de 10 mM de HEPES). Suplementar o tampão com MgCl2 (solução aquosa 1 M, 500 μL) e CaCl2 (solução aquosa 1 M, 500 μL). Misturar a solução e conservar no frigorífico a 5 °C quando não estiver a ser utilizado.
      1. Para cada placa de 96 poços, adicione 50 mL do tampão de ensaio HBSS-HEPES a um tubo de centrífuga de 50 mL, complemente com 500 μL da solução de probenecida e misture bem. Aqueça o tampão à temperatura ambiente antes de usar.
    3. Faça uma solução de Pluronic F-127 a 10% em DMSO adicionando Pluronic F-127 (20 mg) a um tubo de microcentrífuga ou frasco de HPLC e dissolvendo-o com 200 μL de DMSO.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada em temperatura ambiente e é suficiente para cerca de 30 placas. O Pluronic F-127 se dissolve muito lentamente à temperatura ambiente e deve ser aquecido suavemente para facilitar a dissolução.
    4. Prepare o tampão de carregamento de corante adicionando primeiro 24 μL de DMSO a um frasco de Fluo-4/AM (50 μg) para dissolver o corante. Em um tubo de centrífuga de 15 mL envolto em papel alumínio, adicione 6 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES e complemente com 6 μL de Pluronic F-127 a 10% e 6 μL de solução de Fluo-4 / AM. Vortex breve da solução e deixar descansar em temperatura ambiente, sem luz, por 10 min.
      NOTA: Para evitar o fotobranqueamento do Fluo-4, mantenha o corante fora da luz enrolando papel alumínio ao redor do tubo de centrífuga contendo a solução de corante e a tampa da placa de ensaio.
  2. Prepare placas de ensaio.
    1. Remova a placa de ensaio da incubadora e confirme a confluência usando um microscópio invertido. Remova manualmente a mídia completa do DMEM jogando-a em uma pia e enxugando a parte superior da placa com uma toalha de papel.
      NOTA: O meio é suficientemente removido segurando a placa horizontalmente e sacudindo, seguido de girar a placa 180° e repetir.
    2. Adicione o tampão de ensaio HBSS-HEPES mais a solução de probenecida a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mL.
      NOTA: Esta solução será usada para etapas de lavagem posteriores e deve ser colocada de lado e coberta com papel alumínio até que seja necessário.
    3. Adicione 100 μL do tampão de ensaio HBSS-HEPES mais solução de probenecida a cada poço com uma pipeta multicanal e deixe as células repousarem na presença de probenecida por 5 min. Remova o buffer de ensaio HBSS-HEPES movendo para dentro da pia da mesma maneira que na etapa 3.2.1.
    4. Adicione o tampão de carregamento de corante a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mL separado. Adicione 50 μL do tampão de carga de corante a cada poço da placa de ensaio usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa durante 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Enquanto a placa estiver na incubadora, prepare as soluções agonistas / antagonistas.
      1. As soluções antagonistas são armazenadas como soluções de 31,6 mM no DMSO. Em um tubo de PCR, dilua 2 μL da solução estoque com 38 μL de BSA a 0,1% / água para obter uma solução de 1,58 mM. 2 μL desta solução darão uma concentração final de 31,6 μM na placa de ensaio. Diluir 4 μL da solução antagonista de 1,58 mM com 36 μL de DMSO a 5% / água (sem adição de BSA) e preparar as concentrações restantes por meio de diluições seriadas.
      2. Prepare uma solução de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 em tampão de ensaio HBSS-HEPES, que dará uma concentração final de 6,5 μM quando 6 μL forem adicionados a cada poço da placa de ensaio. Por exemplo, dissolva uma alíquota de 2 mg de TFLLRN-NH2 com 5,244 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES para obter uma solução estoque de 0,5 mM. Misture 1,083 mL desta solução com 3,917 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES para obter uma solução de 108,3 μM.
        NOTA: As soluções TFLLRN-NH2 devem ser armazenadas em um freezer de -20 ° C quando não estiverem em uso.
    6. Remova a placa da incubadora e garanta a absorção do corante usando um microscópio de fluorescência em uma configuração adequada (normalmente para proteína fluorescente verde, consulte a Figura 1 para obter um exemplo de Fluo-4 carregado com sucesso nas células). Remova o tampão de carregamento de corante sacudindo a placa da mesma maneira que a etapa 3.2.1.
    7. Lave as células 2x com 50 μL do tampão de ensaio HBSS-HEPES mais solução de probenecida (da etapa 3.2.3) em cada poço (remova jogando o meio na pia).
    8. Adicione 92 μL de tampão de ensaio HBSS-HEPES a cada poço e visualize novamente as células com um microscópio de fluorescência para garantir que o excesso de corante tenha sido totalmente removido e que as células permaneçam aderentes.
    9. Use uma pipeta multicanal para adicionar 2 μL das soluções antagonistas e veículo aos poços apropriados (consulte a Tabela 1 para obter um mapa de placas representativo).

4. Realização do ensaio de mobilização de cálcio

  1. Ajuste o leitor de placas da seguinte forma: temperatura: 37 °C; comprimento de onda de excitação: 485 nm; comprimento de onda de emissão: 525 nm; altura de medição: 7,8 mm (otimizada); número de flashes: 100; Número de repetições: 20.
  2. Incubar a placa durante 15 min no leitor de placas a 37 °C. Meça a fluorescência de fundo nas colunas 1 e 2 (cinco varreduras por poço).
  3. Ejete a placa do leitor de placas e adicione rapidamente 6 μL de solução agonista a cada poço nas colunas 1 e 2 de uma tira de PCR de 8 tubos usando uma pipeta multicanal.
    NOTA: Para esta etapa, usamos uma pipeta eletrônica de 8 canais com pontas de pipeta de 0,1-10 μL.
  4. Meça a mudança na fluorescência à medida que ocorre a mobilização de cálcio nas células. Execute 20 varreduras de cada poço de acordo com as configurações acima.
    NOTA: A varredura de cada poço em duas colunas 20x cada leva aproximadamente 5 min (ou seja, ~ 15 s entre as varreduras de cada poço).
  5. Repita as etapas 4.2 a 4.4 para as colunas 3 a 12 em incrementos de duas colunas.

5. Análise dos dados

  1. Exporte dados do ensaio como planilhas separadas para cada grupo de duas colunas.
  2. Encontre a média das leituras de fluorescência basal usando a função AVG(primeira varredura: última varredura). Faça isso para todos os poços em ambas as colunas.
  3. Encontre a fluorescência máxima após a adição de agonista usando a função MAX(primeira varredura: última varredura).
  4. Calcule a mudança na fluorescência subtraindo a fluorescência basal da fluorescência máxima.
  5. Subtraia a mudança de fluorescência calculada para o controle negativo (adição de veículo sem agonista) de cada poço na mesma coluna.
  6. Encontre a mudança relativa (normalizada) na fluorescência dividindo a mudança na fluorescência em cada poço pela mudança na fluorescência no veículo (0,1% DMSO/água) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 poço.
  7. Copie os valores sem controle, como porcentagens, em um programa de software de estatística e gráficos. Se estiver usando o software referenciado, escolha a opção de tabela XY, com os números escolhidos como o eixo X e replique os valores em subcolunas lado a lado como o eixo Y.
  8. Use o programa para traçar curvas de concentração-resposta (CRCs) a partir dos dados. Se estiver usando o software referenciado, escolha a opção log(inibidor) vs. resposta - Inclinação variável (quatro parâmetros).

Resultados

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O objetivo deste ensaio é geralmente produzir curvas de concentração-resposta (CRCs) para três a quatro novas parmodulinas. Em cada placa de ensaio, é frequentemente gerado um CRC adicional para um composto conhecido, como NRD-21, que atua como uma verificação de qualidade para o experimento devido ao seu IC50 conhecido. Para gerar CRCs, um mapa de placas como o representado na Tabela 1 deve ser planejado. Se, em vez disso, forem desejadas respostas de concentração de ponto único, compostos em concentrações finais de 10 μM (ou outras concentrações preferidas) devem ser adicionados a pelo menos três poços.

Ao realizar o ensaio, deve haver um rápido aumento na fluorescência (o aumento deve começar nas primeiras 3-4 varreduras) exibido pelo leitor de placas (consulte a Figura 2A para obter um exemplo de saída em comparação com a saída com falha na Figura 2B). É importante observar que o agonista precisa ser adicionado rapidamente (dentro de 15 s) para que o leitor de placas seja capaz de capturar com precisão o aumento da fluorescência. Em um experimento de trabalho, o sinal de fluorescência para o poço do veículo deve permanecer plano, enquanto o sinal de fluorescência nos poços de controle positivo (veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) deve começar a aumentar após três ou quatro varreduras. Assim que o valor máximo for atingido (após ~ 10 varreduras), o sinal de fluorescência deve começar a diminuir lentamente. Em experimentos com antagonistas altamente eficazes, os poços com as maiores concentrações de antagonistas devem ter um sinal que permaneça relativamente plano, semelhante ao controle negativo. Também deve haver pouca diferença entre o sinal dos poços de controle positivo e aqueles com baixas concentrações do antagonista (Figura 2C). Se as concentrações mais baixas do antagonista ainda estiverem inibindo a mobilização de cálcio, as concentrações rastreadas devem ser ajustadas para incluir concentrações mais baixas. Os CRCs gerados devem ter pelo menos um ponto de dados ~ 100% para mostrar totalmente a natureza sigmoidal da curva.

O sinal mais comum de que um experimento não funcionou é se o poço de controle positivo (veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) não mostrar um grande aumento na fluorescência (Figura 2B). Isso pode acontecer por vários motivos: a contagem de células pode ser baixa (se a confluência não for confirmada), a solução agonista pode ser comprometida ou quantidades inadequadas de corante podem ter sido absorvidas pelas células. Também é possível erroneamente não adicionar agonista a certos poços.

Com um método programado, os dados são gerados como seis planilhas separadas, cada uma contendo dados para duas colunas. As cinco varreduras da fluorescência basal estão em sua própria linha, com as 20 varreduras feitas após a adição de agonista na linha imediatamente abaixo (consulte a Figura 3 para obter uma saída representativa). Para um exemplo de cálculo, será usada uma coluna de um experimento usando NRD-21. No arquivo exportado (Figura 3), a fluorescência basal de cada poço é enviada para as colunas C a G, e os dados após a adição do agonista (as 20 varreduras seguintes) são enviados para as colunas C a V na linha subsequente. As linhas 14 a 17 do arquivo contêm o controle positivo de duas colunas separadas. A média da linha basal para um dos poços de controle positivo foi calculada usando o comando "=MÉDIA(C16:G16)", que deu um valor de 1.039,8. Este comando foi repetido para as medições basais adicionais em cada poço. O máximo de varreduras experimentais foi calculado usando o comando "=MAX(C16:V16)", que deu um valor de 2,629. Novamente, o comando foi repetido para todos os poços. A fluorescência basal para cada poço foi então subtraída do valor máximo. Neste experimento, os dados foram normalizados subtraindo a mudança na fluorescência no controle negativo de cada poço (que foi de 142,6 na coluna de exemplo). Esses valores foram então divididos pelo valor calculado de forma semelhante do controle positivo. Nesta coluna, o valor máximo foi 2.629, a medida basal média foi 1.039,8 e o valor subtraído para o branco foi 142,6. O valor de controle positivo ajustado é, portanto, 1.446,6 (calculado a partir da equação). Essa equação é repetida para cada poço na coluna, e os valores calculados são divididos por 1.446,6 para fornecer sua mudança relativa na fluorescência. As razões foram então convertidas em porcentagens e copiadas para o software analítico. Esse processo foi repetido para as outras 11 colunas.

Para processar os dados usando o software referenciado, uma tabela XY deve ser selecionada com a opção de ter três medições repetidas em colunas lado a lado. Os valores -log de cada concentração devem ser inseridos nos valores de x e as porcentagens calculadas adicionadas aos valores de y. Uma análise de regressão não linear deve ser realizada nos dados, o que faz com que quatro curvas de concentração-resposta sejam produzidas. O programa também produz valores IC50 , estatísticas de erro quantificadas e estatísticas de qualidade de ajuste.

figure-results-1
Figura 1: Fluo-4/AM carregado em células EA.hy926. Fluo-4 carregado seletivamente em células EA.hy926, após as etapas de incubação e lavagem do corante. Toda a fluorescência está dentro das células, sem vazamento de corante. Imagem obtida usando a configuração GTP em um gerador de imagens de célula EVOS e ampliação de 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Saída potencial do ensaio. (A) Saída representativa do leitor de placas de um ensaio de trabalho. A linha A é o controle negativo e não tem alteração na fluorescência. A linha B é o controle positivo e mostra um rápido aumento da fluorescência. As linhas CH são os poços experimentais, com as concentrações mais altas de parmodulina mais baixas na placa. (B) Exemplo de saída de um experimento fracassado. Não se observa aumento da fluorescência na linha B, que é o controlo positivo. (C) Mudança na fluorescência ao longo do tempo induzida pelo agonista PAR1 TFLLRN-NH2. A varredura de duas colunas de uma placa de 96 poços usando as configurações fornecidas leva ~5 min. no leitor de placas PerkinElmer EnSpire (ou seja, ~15 s entre as varreduras de cada poço). Diferentes soluções NRD-21 são indicadas, "Agonista" é 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exemplo de saída do Excel para um ensaio de trabalho. A fluorescência basal é emitida em linhas pares a partir da linha 10, e o resultado das primeiras 10 varreduras após a adição do agonista é mostrado nas linhas ímpares subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Manuseio robótico de líquidos vs "flicking". O pré-revestimento das placas de ensaio com gelatina e a realização manual de trocas de meios, sacudindo a placa e secando-a, produz curvas de concentração-resposta com menor variabilidade. (A) Curvas de concentração-resposta das parmodulinas ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manuseio automatizado de líquidos). (B) Curvas de concentração-resposta de parmodulinas ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (placas revestidas com gelatina). Os dados são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Estudos de temperatura. A realização do ensaio a 37 °C gera dados mais reprodutíveis do que à temperatura ambiente. A) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura ambiente). B) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Os dados são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Estudos de densidade celular. A densidade celular ideal é de 60.000 células/poço ao semear 16-24 h antes do início de um ensaio. (A) Curvas de concentração-resposta de TFLLRN-NH2 em diferentes densidades celulares, n = 3. (B) Curva de concentração-resposta de TFLLRN-NH2 na densidade celular ideal de 60.000 células/poço. Os dados são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Volume do ensaio. A utilização de um volume de ensaio de 100 μL gera curvas de concentração-resposta mais reprodutíveis do que os ensaios com um volume final de 200 μL. (A) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 200 μL). (B) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 100 μL). Os dados são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-8
Figura 8: Geração de fatores Z' para determinar a capacidade do ensaio de detectar um composto hit. Respostas de mobilização de cálcio com 6,5 μM TFLLRN-NH2 (coluna B) mais antagonistas PAR1 opcionais 10 μM NRD-21 (coluna C) ou 0,316 μM vorapaxar (coluna D). (A) Ensaio concluído 16 h após a semeadura celular. (B) Ensaio concluído 24 h após a semeadura celular. (C) Tabela de fatores Z' calculados usando a seguinte equação: figure-results-9, onde σp é o desvio-padrão do controle positivo, σn é o desvio-padrão para o controle ou amostra negativo, μp é a média do controle positivo e μn é a média do controle negativo ou amostra. Cada valor é calculado designando veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2 como controle positivo e comparando com a condição indicada como controle negativo (veículo) ou amostra (NRD-21 e vorapaxar). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Mobilização de cálcio de um agonista PAR2. Mudança na fluorescência ao longo do tempo induzida por 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Os dados são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Exemplo de mapa de placas de 96 poços para triagem de compostos. Cada concentração é medida em triplicata. A linha A contém controles negativos (sem antagonista; sem agonista) e a linha B contém controles positivos (sem antagonista; agonista). As colunas 1 a 3 contêm seis concentrações de meio log da parmodulina NRD-21 que podem ser usadas opcionalmente para controle de qualidade. PM-A, PM-B, PM-C são parmodulinas sem nome. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Comparação do protocolo publicado anteriormente e do novo protocolo otimizado. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

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Enquanto o protocolo72 relatado anteriormente era geralmente confiável e nos permitia identificar uma nova parmodulina de chumbo, NRD-21,62 um protocolo mais eficiente era desejado. O ensaio foi ainda mais comprometido durante a escassez de suprimentos causada pela pandemia de COVID-19. A aquisição de ponteiras para o manipulador automatizado de líquidos tornou-se difícil, e a tentativa de lavar, esterilizar e reutilizar as ponteiras produziu CRCs com variação significativa. Isso facilitou uma série urgente de experimentos projetados para agilizar um ensaio aprimorado de mobilização de cálcio orientado por PAR.

Identificar uma alternativa válida ao uso do manipulador automatizado de líquidos para as etapas de lavagem foi a principal prioridade neste estudo. Durante o desenvolvimento de ensaios anteriores, o uso do manipulador robótico de líquidos reduziu os erros causados por trocas manuais de meios. No entanto, isso adicionou um tempo significativo ao ensaio, pois as trocas de mídia com o manipulador de líquidos de 8 canais aumentaram o tempo total de cada placa de ensaio em 30-45 min. Embora um método de troca de mídia tenha sido tentado anteriormente, esses experimentos foram feitos sem revestir as placas de ensaio com gelatina antes da semeadura celular. Ao pré-tratar as placas com gelatina, as células foram garantidas para permanecer no lugar, independentemente da força usada para remover manualmente o meio. Os CRCs gerados em um ensaio usando placas revestidas com gelatina e sacudidas tiveram melhores pontuações de qualidade de ajuste e barras de erro menores em vários pontos de dados do que as curvas em que o manipulador automatizado de líquidos foi usado (Figura 4). Os valores de erro quadrático médio (RMSE) para a placa usando o manipulador de líquidos automatizado foram 9,687 para a curva ML161 e 10,690 para a curva NRD-21, enquanto os valores RMSE para a placa usando gelatina e uma troca manual de mídia foram 7,658 para a curva ML161 e 6,408 para a curva NRD-21. Valores RMSE mais baixos indicam uma curva que se ajusta melhor aos dados fornecidos. Essa mudança também reduz muito o tempo total do ensaio. Alternativamente, uma lavadora de placas automatizada multicanal pode ser usada.

O método de adição de agonistas foi um fator adicional estudado. Isso foi feito para determinar se o agonista poderia ser adicionado a todos os poços da placa simultaneamente, seguido por uma varredura de toda a placa de uma só vez; Isso eliminaria a necessidade de os pesquisadores ficarem perto do leitor de placas durante o ensaio sensível ao tempo para várias adições separadas de agonistas, o que poderia aumentar significativamente o rendimento. Infelizmente, adicionar agonista a todos os poços e escanear toda a placa foi problemático, porque a resposta é muito rápida para medir com segurança a concentração máxima transitória de cálcio em cada poço, fornecendo CRCs altamente variáveis. A redução do número de colunas digitalizadas de 12 para 6 melhorou ligeiramente os resultados, mas os melhores resultados foram gerados a partir da varredura de apenas duas colunas (16 poços) ao mesmo tempo. Pode-se supor que a redução da temperatura do ensaio de 37 ° C para a temperatura ambiente poderia retardar a mudança na concentração de cálcio o suficiente para permitir medições confiáveis. Embora vários protocolos de mobilização de cálcio com diferentes corantes ou linhagens celulares tenham sido validados à temperatura ambiente78,79, neste ensaio específico, melhores resultados são observados a 37 °C. As curvas de concentração-resposta antagonistas medidas à temperatura ambiente (~ 23 ° C) não foram tão uniformes quanto a 37 ° C ( Figura 5A vs. Figura 5B ). Devido a esses resultados, foi determinado que a varredura de duas colunas por vez a 37 ° C é ideal.

Outra variável que foi examinada para reduzir o tempo de ensaio foi o tempo de incubação do antagonista. No protocolo anterior, os antagonistas foram incubados por 40 min antes da adição do agonista, mas foi determinado aqui que 15 min é tempo suficiente para as parmodulinas interagirem com PAR1. Isso foi testado adicionando soluções de parmodulina a várias colunas ao mesmo tempo, seguido pela adição de agonista em diferentes pontos de tempo (o agonista foi adicionado em t = 15 min, 30 min e 45 min). A atividade das parmodulinas foi mantida, mas não melhorada, incubando os antagonistas por mais tempo. Como resultado desse achado, no novo protocolo, soluções antagonistas são adicionadas a toda a placa de uma só vez, e soluções agonistas são adicionadas às primeiras colunas após uma incubação de 15 min. Essa mudança reduz ainda mais o tempo total do experimento em 30 minutos. Deve-se notar que antagonistas com cinética de ligação lenta, como vorapaxar, podem exigir tempos de incubação mais longos80,81.

Embora a redução do tempo de ensaio e a eliminação da dependência do manipulador de líquidos tenham sido os principais fatores que exigiram uma atualização do protocolo de ensaio, um método alternativo de cultura de células também foi testado. Anteriormente, as placas eram semeadas com células diretamente de estoques congelados e deixadas crescer nas placas por 40-48 h após a semeadura. No entanto, o tempo prolongado entre as placas de semeadura e a realização dos ensaios limitou o número de experimentos que poderiam ser realizados a cada semana. O uso de células cultivadas em frascos de cultura reduz drasticamente esse tempo. As células foram cultivadas em frascos T-75 tratados com cultura de tecidos e foram removidas da superfície do frasco usando um agente de dissociação celular não enzimático. Isso pode ser importante para evitar danificar certos receptores da superfície celular, em particular PAR2, com tripsina. Uma vez adicionadas à placa de ensaio, as células precisam de tempo adequado para se assentar e aderir à gelatina. Como o método de remoção de mídia também pode deslocar células, é necessário tempo suficiente para permitir que as células fiquem embutidas na gelatina. Um experimento que permitiu que as células se estabelecessem por duas horas causou uma perda significativa de células, resultando em um ensaio inutilizável (dados não mostrados). Os tempos de sedimentação entre 2 h e 12 h limitam o número de placas que podem ser analisadas em um único dia, portanto, é preferível uma incubação noturna mais longa. Verificou-se que incubar as células recém-cultivadas em qualquer lugar entre 16 h e 24 h permitiu que as células aderissem totalmente à gelatina, e dados reprodutíveis podem ser obtidos.

A mudança de células congeladas para cultivadas em frasco de cultura também alterou a densidade ideal de semeadura celular. Previsivelmente, a semeadura de poços na densidade de 25.000 células/poço que era padrão no protocolo anterior não permitiu que as células atingissem a confluência com um tempo de incubação mais curto. Os CRCs agonistas foram gerados com oito densidades celulares separadas para determinar as condições ideais (Figura 6). Anteriormente, TFLLRN-NH2 foi usado como agonista de PAR1 a 5 μM, pois isso permitia um antagonismo razoável com parmodulinas de menor solubilidade. Não há uma diferença significativa no sinal de fundo ou máximo ao semear com 45.000-65.000 células/poço, mas há uma diminuição na variabilidade com 5 μM TFLLRN-NH2 ao adicionar 60.000 células/poço. Curiosamente, não há um aumento significativo na fluorescência máxima com um número maior de células, então 60.000 células/poço foi escolhido como a densidade ideal devido à diminuição da variabilidade. Os CRCs agonistas também produziram um EC50 de 6,5 μM para TFLLRN-NH2, então isso foi escolhido como a nova concentração padrão de agonistas.

Outro fator analisado foram os volumes utilizados no ensaio. No protocolo anterior, 2 μL de agonista foram adicionados a cada poço para dar um volume de ensaio final de 200 μL. Foi levantada a hipótese de que adicionar volumes maiores de solução agonista - mas manter a concentração final constante - poderia ajudar na mistura, causando um sinal mais rápido e confiável. Para testar essa hipótese, a adição de 2 μL, 6 μL e 10 μL TFLLRN-NH2 em 100 μL ou 200 μL de HEPES-HBSS em uma placa de ensaio contendo diferentes concentrações de NRD-21 foi comparada. Os CRCs de NRD-21 de cada condição foram gerados para determinar qual combinação de volume de agonista e volume final do ensaio forneceu os dados mais consistentes. Embora as adições de 2 μL e 6 μL tenham resultado em CRCs gerados com pouca variabilidade, o mesmo não pode ser dito sobre as curvas produzidas a partir da adição de 10 μL TFLLRN-NH2 (dados não mostrados); os aumentos na fluorescência não foram consistentes nesses poços em magnitude ou tempo, o que produz CRCs que deveriam ser idênticos, mas são drasticamente diferentes. Embora as adições de 2 μL e 6 μL tenham produzido resultados semelhantes, a mudança na fluorescência ocorreu muito mais rapidamente com a adição de 6 μL de TFLLRN-NH2, o que permitiu que o número total de varreduras em cada poço fosse reduzido pela metade, de 40 varreduras para 20 varreduras. Também foi determinado que o uso de um volume final de 100 μL produz CRCs mais uniformes em comparação com aqueles gerados com um volume final de 200 μL (Figura 7).

Para determinar se o novo protocolo é adequado para ensaios de maior rendimento, foram calculados os fatores Z' para o ensaio (Figura 8). Um fator Z' é um método estatístico que mede a qualidade de um ensaio de triagem e determina se um ensaio diferenciará de forma confiável compostos ativos e inativos82. Os fatores Z' foram calculados para ensaios realizados entre 16 e 24 h após a semeadura das placas, e em diferentes passagens celulares. Em todos os casos - tanto para os modos agonista quanto para agonista mais antagonista - os fatores Z' calculados foram maiores que 0,5, indicativo de um excelente ensaio82. Os fatores Z' calculados também foram semelhantes aos calculados para o ensaio anterior, indicando que as alterações feitas no protocolo para produzir um ensaio mais rápido não impactaram negativamente a qualidade.

O protocolo para mobilização de cálcio impulsionada por PAR foi atualizado por meio de experimentos que geram valores de IC50 a partir de CRCs, mas o ensaio também pode ser usado para medir a eficácia dos antagonistas de PAR1 em concentrações únicas. O ensaio também pode ser usado para medir a atividade dos ligantes PAR2; por exemplo, o agonista PAR2 SLIGKV-NH2 pode substituir TFLLRN-NH2 no protocolo atualizado (Figura 9); o protocolo anterior também foi utilizado com agonistas e antagonistas de PAR283. Embora não tenha sido explicitamente testado aqui, este protocolo também deve ser aplicável às células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), que foram usadas com o protocolo anterior, e potencialmente outras linhagens celulares aderentes. Uma limitação ao uso de um leitor de placas de varredura com protocolos como este é que eles não são adequados para estudar respostas rápidas (subsegundos), pelo menos não em paralelo, como é possível com um gerador de imagens de placas.

Em conclusão, o relatório aqui é um protocolo mais rápido e simples para o ensaio de mobilização de cálcio endotelial acionado por PAR usando um leitor de placas. Ao eliminar a necessidade de um manipulador automatizado de líquidos, reduzindo o tempo de incubação do antagonista e diminuindo o número de varreduras para cada poço, o tempo total do ensaio foi reduzido em pelo menos 90-120 minutos e os custos do ensaio foram reduzidos (para uma comparação entre os protocolos relatados anteriormente e os atuais, consulte a Tabela 2). Isso não apenas permitirá a triagem de mais compostos a cada dia, mas também elimina o risco de uma janela de ensaio diminuída do efluxo de corante, o que pode levar a resultados não confiáveis. O ensaio recém-otimizado permite a triagem mais rápida em células endoteliais de ligantes PAR1 ou PAR2, ou potencialmente outros ligantes GPCR que ativam a mobilização intracelular de cálcio, em laboratórios limitados ao uso de leitores de placas.

Divulgações

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C.D. é inventor de patentes envolvendo parmodulinas e é o fundador e acionista da Function Therapeutics, Inc., que está desenvolvendo parmodulinas para uso clínico.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) e Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) por fornecer espaço e apoio indireto a este projeto, e ao Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pelos conselhos pertinentes. Agradecemos ao Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R15HL127636), ao Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH22101) e à National Science Foundation (2223225) pelo apoio financeiro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes de cultura celular
Células EA.hy926 ATCCCRL-2922
Reagente de dissociação celular CellStripperCorning25-056-CIA tripsina pode ser usada opcionalmente, mas definitivamente deve ser evitada com ensaios PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com vermelho de fenolCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatina de pele suínaMilliporeSigmaG2500Use para fazer uma solução aquosa a 0,4% (p/v) com água deionizada. Autoclave antes de usar para esterilizar.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0,4% p/v)Corning25-900-CI
strong>Reagentes de mobilização de cálcio
4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)Thermo172571000
Albumina de soro bovino (BSA)Avantor97061-420
Cloreto de cálcio di-hidratadoThermo42352-0250
Dimetilsulfóxido ThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Solução salina balanceada de Hank (livre de Ca/Mg/fenol-vermelho)Corning21-022-CV
Cloreto de magnésio hexahidratadoMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Hidróxido de sódioVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (sal TFA)Preparado por Trudy Holyst no Versiti Blood Instituto de Pesquisa
Materiais
96 poços tratados com cultura, parede preta, placa de ensaio de fundo transparenteCorning3603com tampas transparentes
Tubo de centrífuga, 15 mLAvantor89039-664
Tubo de centrífuga, 50 mLAvantor89039-656
Frasco de cultura, T-75Corning353136tratado para cultura de
tecidos, 50 mLCorningRES-V-50-S
Leitor de placas EnspirePerkin ElmerTubo
de microcentrífuga descontinuado, 1,5 mLAvantor20170-038
Pipeta Pasteur, 9"Fisher13-678-6Bdeve ser esterilizada
tira de tubo de PCR com plano separado tiras de tampaAvantor76318-802
Ponteiras de pipeta, 20 µ LBiotix63300042pontas estéreis e filtradas
Ponteiras de pipeta, 200 µ LBiotix63300044pontas estéreis e filtradas
Ponteiras de pipeta, 1250 µ LBiotix63300047pontas estéreis e filtradas
PrismGraphPadvolume 6 pipeta sorológica usada
, 5 mLTradewinds Direct  07-5005
Pipeta sorológica, 10 mLTradewinds Direct  07-5010
Pipeta sorológica, 25 mLTradewinds Direct  07-5025
< Reservatório de reagente descartável

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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