Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes com melanoma por meio da cultura de suspensões de células dissociadas de tecidos frescos de melanoma. Esses organoides recapitulam fielmente tumores específicos do paciente in vitro, oferecendo uma abordagem inovadora para explorar mecanismos imunossupressores tumorais, triagem de drogas, mecanismos de resistência a drogas e abordagens de vigilância do câncer.

Resumo

Com o desenvolvimento da imunoterapia, há uma necessidade contínua de desenvolver modelos que possam recapitular o microambiente tumoral de tumores nativos. Embora os modelos bidimensionais e tridimensionais tradicionais possam oferecer insights sobre o desenvolvimento e a progressão do câncer, eles carecem de aspectos cruciais que impeçam uma imitação fiel dos tumores nativos. Um modelo alternativo que ganhou muita atenção é o organoide derivado do paciente. O desenvolvimento desses organoides recapitula a complexa comunicação intercelular, o microambiente tumoral e a histoarquitetura dos tumores. Este artigo descreve o protocolo para estabelecer modelos de organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDO). Para validar esses modelos, avaliamos a composição das células imunes, incluindo os níveis de expressão de marcadores de ativação de células T, para confirmar a heterogeneidade celular dos organoides. Além disso, para descrever a utilidade potencial dos MPDOs em terapias celulares, avaliamos as capacidades citotóxicas do tratamento dos organoides com células T γδ. Em conclusão, os modelos MPDO oferecem caminhos promissores para entender a complexidade do tumor, validar estratégias terapêuticas e potencialmente avançar no tratamento personalizado.

Introdução

Modelos convencionais de cultura de células 2-D são ferramentas essenciais na pesquisa do câncer para estudar a progressão e a terapia do câncer¹. Esses modelos não apenas permitem condições experimentais controladas para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer, mas também fornecem resultados experimentais econômicos e relativamente rápidos. Seu uso, no entanto, é restrito devido à limitada diversidade celular no microambiente tumoral (TME), que não pode ser recapitulada em uma natureza coplanar de modelos de monocultura². Al....

Protocolo

Os tecidos de melanoma humano foram obtidos de pacientes em tratamento na Universidade da Pensilvânia usando o protocolo de coleta de tecidos (UPCC08607) aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Após a ressecção dos tecidos do melanoma humano, o tecido tumoral é colocado no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e mantido a 4 °C até o processamento (dentro de 6 h). Os organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDOs) foram derivados de um tumor recente, conforme ilustrado na Figura 1....

Resultados

A forma e o tamanho dos MPDOs foram monitorados ao longo do tempo para estudar sua dinâmica de crescimento. Como visto na Figura 2, durante o período inicial de crescimento, o tamanho do organoide aumentou substancialmente ao longo dos 7 dias representados. Após a observação da dinâmica de crescimento do MPDO, a atenção voltou-se para a avaliação da composição das células imunes para verificar a recapitulação fiel dos organoides aos tumores originais. Essa avaliação, com foco principalmente .......

Discussão

O surgimento de PDOs abordou várias limitações impostas por outros métodos de pesquisa de câncer previamente estabelecidos, ao mesmo tempo em que introduziu aplicações potenciais transformadoras no campo. Essa tecnologia organoide foi inicialmente proposta em 2009 por Hans Clevers e colegas, que conseguiram estabelecer com sucesso um sistema de cultura organoide intestinal cultivando células-tronco Lgr5⁺ derivadas do intestino de camundongos em um gel de matriz 3D contendo R-s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frasco Cênico de Polipropileno com Rosca Interna de 2 mL com Tampa Vermelha	Corning	431420
50 mL Tubo Cônico de Polipropileno	Corning	352070
100 mm TC-tratado com Placa de Cultura de Células	Corning	353003
105 mm Poliestireno Fórceps Estéril	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Frasco de Cultura de Células	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Meio de Soro Reduzido (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Suplemento (50x)	Gibco	17504-044
Anticorpo Anti-Perforina Anti-humana	Violeta Brilhante 510BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-humano Ki-67 Anticorpo	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-humano CD366 (Tim-3) Anticorpo	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-humano CD45	BioLegend	304050
Inserções de Cultura de Células 0.4 µ m, 30 mm de diâmetro	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µ m Nylon	Corning	352340
Filtro de Células 70 µ m Nylon	Corning	352350
Colagenase, Tipo IV, pó	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Placa de Cultura, PS, 48 poços, TC tratado com tampa, estéril	Max Scientific	07-6048
Dimetil Sulfóxido (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - glicose alta 4,5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grau II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Soro Fetal Bovino, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Anexina V Kit de Detecção de Apoptose I	BD Biosciences
Forskolin	Tocris	1099
Antibiótico Seletivo Geneticina (Sulfato G418) (50 mg/mL)	Suplemento ThermoFisher	10131035
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061
Mistura de Nutrientes F12 do Presunto	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Higromicina B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN célula	ATCC	CRL-3276
Matrigel Fenol Livre & Fato de crescimento. Filtro	Corning	356231
Millex PVDF reduzido, 0,22 μ M	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamida	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Frasco de Cultura de Células Tratadas	ThermoFisher	132867
PE / Cyanine5 anticorpo CD8a anti-humano	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-humano CD279 (PD-1)	BD Biosciences
Caneta Strep	Gibco	15140-122
Humano Recombinante EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Humano Recombinante FGF-ácido	Peprotech	100-17A
Solução de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Lâminas Cirúrgicas de Aço Inoxidável nº 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021

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