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Research Article
Yuri Kriel1, Andrzej Kwintowski1, Krist Feka1, Mark Windsor1, Grace Young2, Meegan Walker1, Christopher D. Askew1,3
1VasoActive Research Group, School of Health,University of the Sunshine Coast, 2Centre for Trials Research, College of Biomedical and Life Sciences,Cardiff University, 3Sunshine Coast Health Institute, Sunshine Coast Hospital and Health Service
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Aqui, descrevemos uma abordagem não invasiva usando espectroscopia de infravermelho próximo para avaliar a hiperemia reativa no membro inferior. Este protocolo fornece uma avaliação padronizada da capacidade de resposta vascular e microvascular que pode ser usada para determinar a presença de disfunção vascular, bem como a eficácia das intervenções terapêuticas.
As doenças vasculares do membro inferior contribuem substancialmente para a carga global de doenças cardiovasculares e comorbidades como diabetes. É importante ressaltar que a disfunção microvascular pode ocorrer antes ou ao lado da patologia macrovascular, e ambas contribuem potencialmente para os sintomas do paciente e a carga da doença. Aqui, descrevemos uma abordagem não invasiva usando espectroscopia de infravermelho próximo (NIRS) durante a hiperemia reativa, que fornece uma avaliação padronizada da (dis)função vascular dos membros inferiores e um método potencial para avaliar a eficácia de intervenções terapêuticas. Ao contrário de métodos alternativos, como ultrassom com contraste, essa abordagem não requer acesso venoso ou análise sofisticada de imagens, além de ser barata e menos dependente do operador. Esta descrição do método NIRS inclui resultados representativos e terminologia padrão, juntamente com a discussão de considerações de medição, limitações e métodos alternativos. A aplicação futura deste trabalho melhorará a padronização do projeto de pesquisa vascular, procedimentos de coleta de dados e relatórios harmonizados, melhorando assim os resultados da pesquisa translacional nas áreas de (dis)função, doença e tratamento vascular dos membros inferiores.
A doença cardiovascular (DCV) é o principal contribuinte para a mortalidade global1. Embora o infarto do miocárdio e o acidente vascular cerebral sejam as manifestações mais comuns das DCV, as doenças vasculares dos membros inferiores, como a doença arterial periférica (DAP) e a doença do pé diabético, contribuem substancialmente para a sobrecarga pessoal, social e de saúde das DCV2,3,4. É importante ressaltar que esses estados de doença são caracterizados por disfunção microvascular e macrovascular5 que contribuem para sintomas (por exemplo, claudicação intermitente), comprometimento funcional, baixa mobilidade, bem como isolamento social e redução da qualidade de vida6. Historicamente, as técnicas de avaliação vascular dos membros superiores têm sido usadas como uma medida da função vascular sistêmica e do risco cardiovascular associado; no entanto, esses métodos são potencialmente não sensíveis a comprometimentos locais na função vascular dos membros inferiores 7,8. Embora atualmente exista uma variedade de técnicas usadas para avaliar a função vascular no membro inferior, como dilatação mediada por fluxo (FMD) e ultrassom com contraste, cada método tem desvantagens e limitações, como custo do equipamento, habilidade do operador ou necessidade de acesso venoso invasivo. Por essas razões, há necessidade de técnicas padronizadas e eficazes para avaliar a (dis)função vascular dos membros inferiores que possam ser mais prontamente implementadas em ambientes clínicos e de pesquisa.
A espectroscopia de infravermelho próximo de onda contínua (CW-NIRS) é um método não invasivo, de baixo custo e portátil que quantifica as mudanças relativas na oxigenação da hemoglobina in vivo. Como os sinais da hemoglobina oxigenada e desoxigenada NIRS são derivados dos pequenos vasos (<1 mm de diâmetro), o metabolismo do músculo esquelético local e a função microvascular podem ser avaliados9. Especificamente, o índice de saturação tecidual (TSI) [TSI = hemoglobina oxigenada/ (hemoglobina oxigenada + hemoglobina desoxigenada) x 100], fornece uma medida quantitativa da oxigenação tecidual9. Quando medidas antes, durante e após a oclusão e hiperemia reativa, as alterações no TSI indicam responsividade vascular de 'órgão-alvo', em relação à linha de base pré-oclusão. É importante ressaltar que esse método é sensível a alterações na capacidade de resposta e perfusão microvascular muscular associadas aoenvelhecimento10, progressão dadoença11 e intervenções clínicas (por exemplo, cirurgia de revascularização12,13 ou reabilitação por exercícios14,15,16,17) em indivíduos com ou em risco de disfunção microvascular.
A disponibilidade de sistemas NIRS levou a um rápido aumento no número de estudos de pesquisa relatando a função microvascular18. No entanto, as diferenças nos protocolos de teste de hiperemia reativa, a omissão de métodos NIRS detalhados e repetíveis, bem como a falta de uniformidade na descrição, apresentação e análise dos parâmetros de resposta NIRS, tornam as comparações entre ensaios individuais desafiadoras. Isso limita a coleta de dados para metanálise e a formulação de recomendações de avaliação clínica 9,15.
Portanto, neste artigo, descrevemos os protocolos padronizados de teste NIRS e oclusão vascular de nosso laboratório para a avaliação da hiperemia reativa de membros inferiores. Ao disseminar esses métodos, pretendemos contribuir para a melhor padronização e repetibilidade dos procedimentos de coleta de dados e relatórios harmonizados.
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa humana da University of the Sunshine Coast. Além disso, todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar das medidas descritas neste protocolo. Observe que o teste de oclusão vascular no membro inferior é contra-indicado em indivíduos que já tiveram um procedimento de revascularização envolvendo enxerto vascular ou implante de stent nas artérias femoral ou poplítea. Após o preparo do equipamento, o participante é orientado a repousar em decúbito dorsal por 10 min. Neste ponto, a coleta de dados NIRS começa, com um período inicial de 2 minutos, permitindo que a estabilidade dos sinais NIRS seja alcançada. Os dados basais são então coletados por 1 min, momento em que um manguito localizado na coxa é prontamente inflado para atingir a oclusão arterial. A oclusão é mantida por 5 minutos antes que o manguito seja rapidamente esvaziado. A coleta de dados continua durante todo o período de hiperemia reativa até que os sinais se recuperem para a linha de base. A Figura 1 mostra uma visão geral do protocolo de hiperemia reativa e as etapas detalhadas são fornecidas abaixo. Os equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Figura 1: Esquema descrevendo o protocolo de medição de hiperemia reativa NIRS e os tempos. NIRS: espectroscopia de infravermelho próximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Preparação do equipamento
NOTA: Vários NIRS, insuflação/oclusão do manguito e sistemas de coleta de dados podem ser usados para obter os resultados representativos descritos abaixo. É importante que os investigadores consultem seus próprios manuais de usuário específicos e estejam cientes do software exclusivo, calibração, luz ambiente e considerações específicas do participante/coorte.
2. Preparação dos participantes

Figura 2: Exemplo da colocação do manguito oclusivo na coxa. (A) De cima. (B) De lado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplo de posição da sonda de espectroscopia de infravermelho próximo. (A) Sonda conectada à pele raspada no gastrocnêmio medial. (B) Colocação da sonda enquanto o tornozelo estiver em suporte de espuma para permitir o acesso e garantir a estabilidade. (C) Blindagem contra luz ambiente no lugar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Coleta de dados de linha de base
4. Oclusão vascular
5. Hiperemia reativa
6. Procedimentos de acompanhamento
Espectroscopia de infravermelho próximo
Dispositivos de espectroscopia de infravermelho próximo de onda contínua medem mudanças relativas na hemoglobina oxigenada (O2Hb) e desoxigenada (HHb), que refletem a entrega e utilização local de O2 por meio de fontes emissoras de luz e fotodetectores, separando distâncias específicas. Comprimentos de onda de luz entre ~ 700 nm e 850 nm são emitidos, correspondendo ao pico de absorção de O2Hb e HHb. Uma vez que a luz infravermelha próxima penetrou no músculo esquelético, a dispersão e a absorção da luz dependem do comprimento de onda. O músculo esquelético é um tecido heterogêneo e, portanto, os coeficientes de dispersão e absorção, bem como o comprimento do caminho fornecido pelo qual a luz viaja, não podem ser quantificados. Portanto, a tecnologia CW-NIRS usa a Lei de Lambert-Beer modificada, que inclui um fator diferencial de comprimento de caminho (DPF) e permite que as concentrações relativas de O2Hb e HHb sejam calculadas. Além de O2Hb e HHb, as medidas derivadas do CW-NIRS incluem hemoglobina total (THb = O2Hb + HHb), um marcador de volume sanguíneo / força total do sinal e índice de saturação tecidual (TSI = O2Hb / THb * 100). O TSI é gerado pela tecnologia de espectroscopia espacialmente resolvida (SRS), onde os fótons são medidos em vários espaçamentos da fonte, melhorando a precisão9 e fornecendo uma medida quantitativa da oxigenação do tecido. Além disso, devido às múltiplas distâncias fonte-detector, o SRS aumenta a contribuição de tecidos mais profundos, enquanto reduz a contribuição de tecidos mais superficiais, como pele / tecido adiposo, para os sinais NIRS. Também é importante notar que o TSI é alternadamente referido como saturação regional de oxigênio (rSO2), índice de oxigenação tecidual (TOI) ou saturação de oxigênio do tecido muscular (StO2) na literatura. Sugere-se, portanto, que, no futuro, um único termo seja adotado para padronizar a nomenclatura e reduzir a confusão.
Recomenda-se ainda que todos os traços NIRS coletados durante a pesquisa sejam analisados e relatados9. Também é importante observar que os espectrômetros CW não fornecem concentrações absolutas de cromóforos nos tecidos interrogados porque o comprimento real do caminho da luz é desconhecido. Em vez disso, esses dispositivos fornecem alterações em relação a uma linha de base predeterminada. Portanto, como observado por Cornelis et al.15, recomenda-se que os sinais NIRS sejam analisados como mudanças a partir de um ponto de interesse no tempo. Recomenda-se, adicionalmente, que as amplitudes e inclinações das respostas sejam o foco do relato e da interpretação, pois essas variáveis são menos sensíveis a questões de confusão, como espessura do tecido adiposo ou relação sinal-ruído.
Sinais NIRS durante a oclusão e hiperemia reativa
Este artigo se concentrará predominantemente na descrição das respostas do sinal TSI durante a oclusão e hiperemia reativa, pois essa medida de SRS é menos propensa a alterações nas contribuições do sinal cutâneo e erro de medição quando comparada aos sinais brutos deO2Hb e HHb.
Uma seleção das variáveis do NIRS TSI avaliadas durante a oclusão e hiperemia reativa está representada na Figura 4. O TSI basal representa o TSI médio antes do início da oclusão vascular (insuflação do manguito), rotineiramente por 1 min. A taxa de dessaturação durante a oclusão é representada por Slope 1. Devido à oclusão arterial, as reduções no TSI indicadas pela Inclinação 1 podem ser atribuídas à utilização de oxigênio/taxa metabólica do músculo de repouso. O TSIMIN é o valor mais baixo do TSI obtido durante a oclusão. O TSIIMAG (diferença entre o TSI basal e o TSIMIN) representa a magnitude da isquemia induzida pela oclusão (e o estímulo para vasodilatação e hiperemia pós-oclusão). A inclinação 2 indica a taxa de reperfusão após a liberação do balonete e representa a resposta de hiperemia reativa/reatividade microvascular. Alternativamente, a inclinação de reperfusão pode ser descrita como um meio tempo. O TSIMAX é o valor mais alto de TSI obtido após a liberação do manguito. A magnitude da reperfusão é calculada como a diferença entre o TSIMAX e o TSIMIN, e o tempo para o TSIMAX é calculado como a diferença no tempo (s) do TSIMIN para o TSIMAX. A área de hiperemia reativa do TSI sob a curva (AUC) é calculada a partir do retorno à linha de base após a liberação do manguito por 1 min, 2 min, ou 3 min. Por fim, a reserva hiperêmica, representando a mudança no TSI acima da linha de base, pode ser calculada como a diferença entre o TSIMAX e o TSI basal, expressa em porcentagem 9,10,12,20.

Figura 4: Sinal do índice de saturação tecidual (TSI) durante um teste de oclusão vascular NIRS com variáveis TSI de interesse durante a hiperemia reativa. O TSI basal representa o TSI médio antes do início da insuflação do manguito. A inclinação 1 representa a taxa de dessaturação durante a oclusão. O TSIMIN é o valor mais baixo do TSI obtido durante a oclusão. O TSIIMAG (diferença entre o TSI basal e o TSIMIN) representa a magnitude da isquemia induzida pela oclusão. A inclinação 2 indica a taxa de reperfusão após a liberação do balonete. O TSIMAX é o valor mais alto de TSI obtido após a liberação do manguito. A magnitude da reperfusão é calculada como a diferença entre TSIMAX e TSIMIN, e o tempo para TSIMAX é calculado como a diferença de tempo (s) de TSIMIN para TSIMAX. A área de hiperemia reativa sob a curva (AUC) do TSI é calculada a partir do retorno à linha de base após a liberação do manguito por 1 min, 2 min ou 3 min. A reserva hiperêmica, que representa a mudança no TSI acima da linha de base, pode ser calculada como a diferença entre o TSIMAX e o TSI basal, expressa em porcentagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além das variáveis do TSI, também é possível estimar o consumo de oxigênio tecidual (mVO2) durante a oclusão do manguito arterial, dada a ausência de alterações no volume sanguíneo, calculando as inclinações de mudança em HHb eO2Hb durante a porção linear inicial das respostas desses parâmetros à oclusão (S lope 1), com base na suposição de que a taxa de desaparecimento de O2Hb (e/ou a taxa de aparecimento de HHb) equivale à taxa de utilização de oxigênio pelo músculo sob interrogatório.
Utilizando NIRS para avaliar a capacidade de resposta microvascular em populações clínicas
É importante ressaltar que as medições do NIRS durante o teste de hiperemia reativa podem diferenciar as respostas microvasculares de participantes aparentemente saudáveis daqueles com vários graus de disfunção. As diferenças na capacidade de resposta entre um indivíduo aparentemente saudável e um indivíduo com DAP são vistas na Figura 5. Especificamente, taxas mais lentas de reperfusão, tempos de recuperação mais longos, respostas hiperêmicas máximas menores e diferenças em variáveis como tempo para TSIMAX eTSI AUC são observadas em um participante representativo com DAP, em comparação com o controle saudável20. É importante observar que variáveis NIRS, como as descritas neste artigo, também são usadas durante o exercício clínico padronizado e testes de oclusão para avaliar respostas (micro)vasculares a um tratamento específico ou estímulo de atividade física ou para determinar o resultado do treinamento físico de rotina em populações saudáveis17 e DCV21. Para um resumo recente dos parâmetros de medição do NIRS e resultados de estudos utilizando NIRS na doença vascular periférica de membros inferiores durante hiperemia reativa e exercício, consulte a revisão sistemática de Joseph et al.18.
Por fim, ao projetar pesquisas que incorporem medidas NIRS, como as exibidas na Figura 4 e na Figura 5, esteja ciente de que uma grande variabilidade interindividual em valores absolutos foi demonstrada em populações aparentemente saudáveis e clínicas, tornando difícil, por exemplo, definir valores absolutos para o diagnóstico de DAP com base nos dados NIRS22.

Figura 5: Sinal do índice de saturação tecidual (TSI) durante o teste de hiperemia reativa. Sinal de índice de saturação tecidual (TSI) evidenciando a capacidade do NIRS de distinguir entre a capacidade de resposta vascular de um participante do sexo masculino aparentemente saudável e um participante do sexo masculino com doença arterial periférica (Índice Tornozelo-Braquial = 0,5) durante o teste de hiperemia reativa. *Início da linha de base NIRS; #Início da oclusão arterial; ^ Fim da oclusão arterial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Medições abaixo do ideal
Conforme descrito na seção de protocolo acima, uma vez que os sinais NIRS estão sendo registrados, é importante inspecionar visualmente os traços de dados em busca de artefatos de movimento antes de definir a linha de base NIRS para todos os rastreamentos. A Figura 6 mostra artefatos de movimento nostraços deO2, Hb e THb.

Figura 6: Exemplo de artefato de movimento no sinal NIRS durante o período de coleta de dados pré-linha de base. #Início do período pré-linha de base NIRS. THb: Hemoglobina total. O2Hb: Hemoglobina oxigenada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo descrito acima utiliza uma pressão de 200 mmHg para ocluir o fluxo arterial no membro inferior. Muito ocasionalmente, essa pressão não é suficiente para ocluir o fluxo sanguíneo, o que compromete a resposta hiperêmica. Isso pode ocorrer, por exemplo, em um participante com hipertensão grau 3. Além de usar outras tecnologias, como pletismografia por strain gauge, para confirmar a cessação do fluxo sanguíneo, é importante estar atento a qualquer variação das respostas NIRS previstas após a oclusão do manguito (por exemplo, Figura 7, Painel B: O 2Hb sinal aumentando (não diminuindo devido à hipóxia e utilização de oxigênio tecidual conforme esperado) e THb também aumentando (não permanecendo relativamente linear devido ao volume sanguíneo estável). Observar esses desvios das respostas esperadas permite que a intervenção precoce interrompa a medição atual/permite que a pressão de oclusão seja aumentada até que seja evidente que a artéria foi ocluída nas medições subsequentes.

Figura 7: Exemplo de traços de hemoglobina total (THb) e hemoglobina oxigenada (O2Hb). (A) Oclusão arterial bem-sucedida e (B) oclusão arterial malsucedida. #Início da oclusão arterial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os autores não têm divulgações ou interesses conflitantes.
Aqui, descrevemos uma abordagem não invasiva usando espectroscopia de infravermelho próximo para avaliar a hiperemia reativa no membro inferior. Este protocolo fornece uma avaliação padronizada da capacidade de resposta vascular e microvascular que pode ser usada para determinar a presença de disfunção vascular, bem como a eficácia das intervenções terapêuticas.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. A. Meneses, cujo trabalho anterior contribuiu para o refinamento do protocolo aqui descrito. Além disso, os autores gostariam de agradecer a todos os participantes da pesquisa que doaram seu tempo para permitir que protocolos como esse fossem desenvolvidos, a fim de aprofundar a compreensão clínica e científica.
| Fonte de Ar Infladora de Punho | Hokanson | AG101 AIR SOURCE | |
| Bandagem Coesiva Elástica | MaxoWrap | 18228-BL | Para bloquear a luz ambiente |
| OxySoft | Artinis | 3.3.341 x64 | |
| PortaLite (NIRS) | Artinis | 0302-00019-00 | |
| PortaSync MKII (Remoto) | Artinis | 0702-00860-00 | Para marcar marcos durante a medição |
| Inflador rápido de manguito | Hokanson | E20 INFLADOR | RÁPIDO DE PUNHO |
| punho de coxa | Fita cirúrgica CC17 | ||
| Transpore | 3M | 1527-1 | para fixar a sonda na pele |