A matriz descelularizada do baço (DSM) tem aplicações promissoras no campo da engenharia de tecidos hepáticos. Este protocolo descreve o procedimento para preparar o DSM de ratos, que inclui a coleta de baços de ratos, descelularizando-os por meio de perfusão e avaliando o DSM resultante para confirmar suas características.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Fabricação de matriz de baço descelularizada derivada de ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O transplante de fígado é o tratamento primário para a doença hepática em estágio terminal. No entanto, a escassez e a qualidade inadequada dos órgãos dos dadores exigem o desenvolvimento de terapias alternativas. Fígados bioartificiais (BALs) utilizando matriz hepática descelularizada (DLM) surgiram como soluções promissoras. No entanto, o fornecimento de DLMs adequados continua sendo um desafio. O uso de uma matriz esplênica descelularizada (DSM) tem sido explorado como base para LBAs, oferecendo uma alternativa prontamente disponível. Neste estudo, os baços de ratos foram colhidos e descelularizados usando uma combinação de ciclos de congelamento e descongelamento e perfusão com reagentes de descelularização. O protocolo preservou as microestruturas e componentes da matriz extracelular (MEC) dentro do DSM. O processo completo de descelularização levou aproximadamente 11 h, resultando em uma ECM intacta dentro do DSM. A análise histológica confirmou a remoção de componentes celulares, mantendo a estrutura e composição da MEC. O protocolo apresentado fornece um método abrangente para a obtenção do DSM, oferecendo aplicações potenciais em engenharia de tecidos hepáticos e terapia celular. Esses achados contribuem para o desenvolvimento de abordagens alternativas para o tratamento da doença hepática terminal.
Introdução
O transplante de fígado continua sendo o único tratamento definitivo para a doença hepática terminal 1,2,3. No entanto, a escassez crítica e o declínio da qualidade dos órgãos dos doadores aumentaram a necessidade de tratamentos alternativos4. No campo da medicina regenerativa, fígados bioartificiais (BALs) utilizando matriz hepática descelularizada (DLM) surgiram como soluções promissoras 5,6,7. O DLM preserva a estrutura original do fígado, incluindo sua intrincada rede microvascular e componentes da MEC, oferecendo um andaime para a criação de BALs transplantáveis que poderiam potencialmente aliviar doenças hepáticas.
Apesar da promessa, a adoção dessa tecnologia enfrenta desafios, principalmente no fornecimento de DLMs adequados. Os DLMs derivados de humanos são escassos, enquanto os de origem animal apresentam riscos de transmissão de doenças e rejeição imunológica. Em uma abordagem inovadora, nossa pesquisa explorou o uso de uma matriz de baço descelularizada (DSM) como base para LBAs 8,9,10,11. Os baços estão mais prontamente disponíveis em várias situações médicas, como hipertensão portal, ruptura traumática, púrpura trombocitopênica idiopática e doação após morte cardíaca. Portanto, os baços estão mais amplamente disponíveis do que os fígados para fins de pesquisa. Os pacientes submetidos a esplenectomias não sofrem de condições graves, confirmando ainda mais a dispensabilidade do baço. O microambiente do baço, particularmente a matriz extracelular e os sinusóides, é semelhante ao do fígado. Isso torna o baço um órgão adequado para adesão e proliferação celular na pesquisa de transplante de hepatócitos. Com base nessas descobertas, nossas investigações anteriores demonstraram que os DSMs compartilham microestruturas e componentes comparáveis com os DLMs e podem apoiar a sobrevivência e a função dos hepatócitos, incluindo a produção de albumina e ureia. Além disso, os DSMs demonstraram aumentar a diferenciação hepática das células-tronco mesenquimais da medula óssea, levando a uma funcionalidade aprimorada e consistente.
Ao empregar DSMs tratados com heparina, projetamos LBAs funcionais capazes de demonstrar anticoagulação eficaz em curto prazo e compensação parcial da função hepática11. Consequentemente, este DSM tridimensional é uma promessa significativa para o avanço da engenharia de tecidos hepáticos e terapia celular. Neste trabalho, apresentamos os métodos detalhados de coleta de baços de ratos e preparação de DSM que preservam as microestruturas e componentes da MEC.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade Xi'an Jiaotong e realizado de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Colheita do baço
- Use ratos Sprague Dawley machos pesando 250-280 g. Aloje os ratos em salas com temperatura e umidade controladas e forneça-lhes comida e água ad libitum, exceto em jejum antes da cirurgia.
- Injete buprenorfina (0,05 mL/kg) por via subcutânea como analgésico 1 h antes da operação. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano. Use uma taxa de fluxo de 1,5 L/min de isoflurano a 5% para anestesia de indução em uma caixa de plexiglass e mantenha a anestesia com uma taxa de fluxo de 0,6-0,8 L/min de isoflurano a 2% através de uma máscara. Confirme a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos pés.
- Use um barbeador elétrico para raspar a pele em todo o abdômen. Prenda o rato em decúbito dorsal na mesa cirúrgica. Injete 2 mL de solução salina heparinizada (1.000 U de heparina) através da veia dorsal peniana para obter anticoagulação sistêmica. Desinfete a pele raspada com uma solução de iodopovidona e cubra com um pano esterilizado.
- Faça uma incisão cruciforme usando uma tesoura cirúrgica no abdômen, exponha a cavidade abdominal alongando com a pinça hemostática e vire o fígado em direção ao diafragma. Exteriorize o trato gastrointestinal para o lado direito do abdômen e cubra-o com gaze úmida.
- Separe e corte cuidadosamente o ligamento esplenogástrico para expor o hilo esplênico.
NOTA: O baço, que aparece como uma estrutura alongada avermelhada, com aproximadamente 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm de tamanho, pode ser identificado no abdome esquerdo. - Separe e exponha gradualmente a artéria hepática comum, a artéria gastroduodenal e a artéria esplênica dissecando ao longo do hilo esplênico. Ligue e corte a artéria gastroduodenal e a artéria hepática comum enquanto dissocia progressivamente o tecido circundante.
- Vire o baço para o lado direito para expor a aorta abdominal. Realize suavemente a dissecção romba e exponha a aorta abdominal e o tronco celíaco usando cotonetes. Coloque uma sutura de seda 3-0, com aproximadamente 3 cm de comprimento, acima e abaixo dos ramos do tronco celíaco, e coloque uma sutura de seda 6-0, com aproximadamente 10 cm de comprimento, no ramo do tronco celíaco.
- Ligadura a aorta abdominal abaixo e acima dos ramos do tronco celíaco. Faça uma pequena incisão no ramo arterial. Levante suavemente a sutura de seda 6-0, insira um cateter venoso 24 G na artéria esplênica ao longo do tronco celíaco e ligue e prenda-o.
- Usando uma bomba de seringa a uma taxa de 4 mL / min, infundir solução salina normal heparinizada (25 U / mL) a um volume de 50 mL. Ao mesmo tempo, corte a veia porta como um canal de saída para permitir que o fluido infundido flua para fora do baço. O animal é sacrificado por exsanguinação.
- Disseque cuidadosamente o tecido circundante do baço, evitando danos ao pâncreas, preservando os principais vasos acessórios.
- Verifique se há vazamento ao redor do baço, remova o baço e o pâncreas e enxágue-os com solução salina normal.
NOTA: O baço e o pâncreas dos ratos estão intimamente ligados, com o pâncreas envolvendo a artéria esplênica. Se o baço for removido separadamente, pode ser um desafio ligar vários pequenos vasos sanguíneos. Neste procedimento, o baço é removido junto com o pâncreas. Após a descelularização, o baço e o pâncreas tornam-se transparentes e a microvasculatura é visível, o que facilita a preservação do baço com vasos sanguíneos íntegros. - Transfira o baço para um tubo de centrífuga de 50 mL cheio de solução salina normal e armazene-o em um freezer a -80 ° C.
NOTA: O baço e o cateter venoso inseridos na artéria esplênica serão criopreservados juntos para uma conexão conveniente durante os experimentos de perfusão.
2. Descelularização do baço
- Repita o ciclo de congelamento e descongelamento 3x em um recipiente estéril para lisar as células do baço.
NOTA: O ciclo de congelamento e descongelamento é um método físico usado para descelularização do andaime. O tecido do baço é colocado em um freezer a -80 °C durante a noite para congelamento, depois removido do ambiente de baixa temperatura e colocado em banho-maria em temperatura ambiente ou 37 °C para descongelamento. Este processo de congelamento e descongelamento é repetido 3-6 vezes, o que rompe as membranas celulares e leva à lise celular. - Montar um sistema de perfusão dentro de uma bancada limpa composta por uma bomba peristáltica, um reservatório de 2 L, um tubo de silicone com diâmetro interno de 2,4 mm e um coletor de bolhas (Figura 1).
- Encha o sistema de perfusão com água deionizada (ddH2O) e mantenha-o funcionando por 10 min.
- Transfira cuidadosamente o baço colhido para o recipiente cheio de ddH2O.
- Conecte o tubo de silicone ao cateter venoso que foi inserido na artéria esplênica.
- Inicie a perfusão com ddH2O a uma taxa de 2 mL/min por 30 min.
- Continue a perfusão com ddH2O a uma taxa de 4 mL / min por 30 min.
- Perfundir com solução SDS a 0,1% (p/v) por 4 h.
- Perfundir com solução Triton X-100 a 1% (v/v) por 2 h.
- Perfunda com PBS a uma taxa de 4 mL/min por 4 h para lavar o DSM.
NOTA: Usando a bomba peristáltica para perfusão unidirecional de todos os líquidos. - Após a conclusão da perfusão, ligue e corte os ramos vasculares entre o pâncreas e o baço e, em seguida, remova o pâncreas. Armazene o DSM em um tubo de centrífuga limpo e selado de 50 mL embebido em PBS contendo 10% de penicilina-estreptomicina a -20 ° C até que esteja pronto para uso em experimentos futuros.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo utilizou uma combinação de ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e perfusão com reagentes de descelularização para a descelularização do baço de rato. A descelularização completa do baço foi alcançada em aproximadamente 11 h (Figura 2A). Ao longo do processo de descelularização, a cor do baço mudou gradualmente de vermelho escuro para um vermelho claro manchado e, eventualmente, uma aparência branca translúcida (Figura 2B). A morfolog...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os LBAs representam uma abordagem eficaz para o tratamento da doença hepática terminal, particularmente nos casos em que o transplante de fígado é dificultado pela atual escassez de órgãos de doadores6. Uma opção promissora para a criação de LBAs é a utilização de DLM, que preserva a ECM natural e a estrutura vascular do fígado nativo. No entanto, a escassez de DLM humano e os riscos potenciais de infecção e imunogenicidade associados ao DLM animal apresentam limitações significativas. Para enfren...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declararam não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82000624), Programa de Pesquisa Básica em Ciências Naturais de Shaanxi (2022JQ-899 e 2021JM-268), Programa de Apoio à Capacidade de Inovação da Província de Shaanxi (2023KJXX-030), Plano de P&D da Província de Shaanxi Projeto Conjunto da Universidade - Projeto Chave (2021GXLH-Z-047), Fundação Institucional do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong (2021HL-42 e 2021HL-21).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Máquina de anestesia | Harvard Apparatus | armadilha | bolhas de anestesia animal |
| de mesa Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | diâmetro do poro: 5 μ m | prevenir bolhas de ar | |
| Buprenorfina | TIPR Farmacêutica Responsável Co., Ltd | um fórceps hemostático analgésico | |
| Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | ferramenta cirúrgica | |
| Solução salina heparinizada | SPH No.1 Bioquímica & Farmacêutica Co., LTD | prevenir a formação de trombose | |
| Isoflurano | RWD life Science Co. | anestésico: para a indução e manutenção da anestesia | |
| Penicilina-Estreptomicina | Biotecnologia Co. de Beyotime, Ltd. | C0222 | antibióticos in vitro para prevenir a contaminação microbiana |
| Bomba peristáltica | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| solução salina tamponada com fosfato | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | Solução | salina tampão de ácido fosfórico |
| Tubo de silicone | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4&vezes; 0,8 mm | |
| de sutura de seda | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 e 3-0 | ligam vasos sanguíneos |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | detergente iônico, dissolve as membranas celulares e nucleares |
| Bomba de seringa | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Infusão intravenosa | BeneFusion SP5 |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | detergente não iônico, interrompe as interações lipídio-lipídio, lipídio-proteína e DNA-proteína |
| Cateter venoso | B. Braun Company | 24G | inserindo a artéria do baço |
Referências
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
- Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
