Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Anjali Tripathi; Anindita Dasgupta; Debashis Mitra

doi:10.3791/66522

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Artigo de método

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

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DOI:

10.3791/66522

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14 de junho de 2024

Anjali Tripathi¹ , Anindita Dasgupta¹ , Debashis Mitra¹

¹National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Resumo

As infecções virais podem causar estresse no retículo endoplasmático (RE) devido ao acúmulo anormal de proteínas, levando à resposta proteica desdobrada (UPR). Os vírus desenvolveram estratégias para manipular a RPU do hospedeiro, mas há uma falta de compreensão detalhada da modulação da RPU e seu significado funcional durante a infecção pelo HIV-1 na literatura. Nesse contexto, o presente artigo descreve os protocolos utilizados em nosso laboratório para medir os níveis de estresse do RE e UPR durante a infecção pelo HIV-1 em células T e o efeito da UPR na replicação viral e infectividade.

A coloração com tioflavina T (ThT) é um método relativamente novo usado para detectar o estresse do ER nas células, detectando agregados de proteínas. Aqui, ilustramos o protocolo de coloração ThT em células infectadas pelo HIV-1 para detectar e quantificar o estresse do RE. Além disso, o estresse do RE também foi detectado indiretamente medindo os níveis de marcadores UPR como BiP, IRE1 fosforilado, PERK e eIF2α, splicing de XBP1, clivagem de ATF6, ATF4, CHOP e GADD34 em células infectadas pelo HIV-1, usando immunoblotting convencional e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-PCR). Descobrimos que a fluorescência ThT se correlaciona com os indicadores de ativação da UPR. Este artigo também demonstra os protocolos para analisar o impacto do estresse do RE e da modulação da UPR na replicação do HIV-1 por meio de experimentos de knockdown, bem como o uso de moléculas farmacológicas. O efeito da UPR na expressão/replicação do gene HIV-1 e na produção do vírus foi analisado por ensaios repórter de luciferase e ELISA de captura do antígeno p24, respectivamente, enquanto o efeito na infectividade do vírion foi analisado pela coloração de células repórter infectadas. Coletivamente, este conjunto de métodos fornece uma compreensão abrangente das vias de resposta proteica desdobrada durante a infecção pelo HIV-1, revelando sua intrincada dinâmica.

Introdução

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) é caracterizada por uma redução gradual no número de linfócitos T CD4⁺, o que leva à falha progressiva da resposta imune. O vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) é o agente causador da AIDS. É um vírus de RNA de fita simples, envelopado, de sentido positivo, com duas cópias de RNA por vírion e pertence à família retroviridae. A produção de altas concentrações de proteínas virais dentro da célula hospedeira coloca estresse excessivo na maquinaria de dobramento de proteínas da célula¹. O RE é o primeiro compartimento na via secretora das células euca....