Artigo de método

Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate

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DOI:

10.3791/66530

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17 de maio de 2024

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.

Resumo

As interações dos glicanos com as proteínas modulam muitos eventos relacionados à saúde e à doença. De fato, o estabelecimento desses eventos de reconhecimento e suas consequências biológicas estão intimamente relacionados às estruturas tridimensionais de ambos os parceiros, bem como às suas características dinâmicas e sua apresentação nos compartimentos celulares correspondentes. As técnicas de RMN são únicas para desvendar essas características e, de fato, diversas metodologias baseadas em RMN foram desenvolvidas e aplicadas para monitorar os eventos de ligação dos glicanos com seus receptores associados. Este protocolo descreve os procedimentos para adquirir, processar e analisar duas das mais poderosas metodologias de RMN empregadas no campo da RMN-glicobiologia, experimentos de titulação de 1 diferença de transferência de saturação (STD) de 1H-saturação e 1 H,15N-Heteronuclear de coerência quântica única (HSQC), que oferecem complementarmente informações do ponto de vista do glicano e da proteína, respectivamente. De fato, quando combinados, eles oferecem um poderoso kit de ferramentas para elucidar os aspectos estruturais e dinâmicos dos processos de reconhecimento molecular. Essa abordagem abrangente aprimora nossa compreensão das interações glicano-proteína e contribui para o avanço da pesquisa no campo da glicobiologia química.

Introdução

O reconhecimento molecular de glicanos é essencial para muitos processos relacionados à saúde e à doença. A especificidade e a seletividade dos receptores biológicos (lectinas, anticorpos, enzimas) para glicanos dependem fortemente do ajuste do equilíbrio precário entre os diversos componentes da entalpia (CH-π e van der Waals, ligações de hidrogênio, eletrostática) e entropia (hidrofobicidade, dinâmica, solvatação-dessolvatação)1.

Dada a grande diversidade química e natureza dinâmica dos glicanos, os métodos de RMN têm sido amplamente empregados para dissecar as interações dos glicanos há mais de 25 anos2, uma vez que essas metodologias fornecem informações excelentes sobre eventos de reconhecimento molecular com detalhes precisos, em resolução atômica 3,4, mesmo quando as evidências de interação necessárias não podem ser recuperadas empregando outras metodologias. Como ponto chave, a RMN é versátil e permite estudar eventos dinâmicos, em nível atômico, em diferentes escalas de tempo, constituindo de longe a melhor técnica para estudar a estrutura, conformação e dinâmica de glicanos em solução. No entanto, desembaraçar essas informações pode ser um processo bastante complexo que requer o emprego de estratégias bem definidas e uma análise cuidadosa dos dados5.

As técnicas de RMN são diversas e, de fato, existem muitas metodologias que podem ser empregadas para desvendar as interações glicano-proteína6. Descrevemos aqui duas abordagens básicas de RMN que são atualmente empregadas para decifrar as interações glicano-receptor 7,8, enfatizando como desvendar a apresentação do epítopo chave do glicano, bem como o local de ligação à proteína9.

Em qualquer evento de reconhecimento molecular, quando um receptor se liga a um determinado ligante, há um processo de troca química que afeta muitos parâmetros de RMN dos participantes na ligação10. Portanto, do ponto de vista da RMN, a interação pode ser monitorada tanto do ponto de vista do ligante glicano quanto do receptor proteico11. De modo geral, o receptor proteico é uma grande biomolécula (movimento rotacional lento, com taxas na escala de tempo ns e, portanto, relaxamento transversal rápido), enquanto o glicano em interação pode ser considerado como uma molécula de tamanho pequeno-médio (movimento rotacional rápido, com taxas na escala de tempo ps e relaxamento transversal lento)12. De uma perspectiva padrão, os sinais de RMN do glicano são estreitos, enquanto os do receptor são amplos13.

Os métodos de RMN baseados em ligantes dependem da mudança dramática que muitos parâmetros de RMN de glicanos experimentam ao passar do estado livre para o estado ligado14. A RNM-STD é a técnica experimental de RMN mais empregada para avaliar diversas características de ligação ao glicano15, desde a dedução da existência de ligação no estado de solução até a determinação do epítopo de ligação do glicano; ou seja, os átomos do ligante que estão em contato com o receptor de proteína16.

Alternativamente, os métodos de RMN baseados em receptores monitoram as mudanças que ocorrem nos sinais do receptor de proteína na presença do glicano em relação aos registrados para o estado apo17. Estes são focados principalmente na triagem das perturbações de deslocamento químico dos sinais de proteína entre os dois estados. O experimento mais comumente empregado é o 1 H-15N HSQC, ou suas alternativas TROSY18.

A combinação de ambas as abordagens permite aplicar a RMN a diversos sistemas que exibem uma ampla gama de afinidades. No entanto, para os métodos de RMN baseados em receptores, em contraste com aqueles baseados no ligante, uma quantidade relativamente grande de proteína solúvel, não agregada e marcada com isótopos estáveis (15N) deve estar disponível.

Descrevemos aqui os dois métodos, destacando seus pontos fortes e fracos. Observe que as etapas básicas descritas no protocolo servem como exemplos para o uso de espectrômetros Bruker. Consequentemente, os nomes dos comandos e parâmetros se alinham com os utilizados no TopSpin (software de controle de espectrômetros da Bruker).

Protocolo

1. Diferença de transferência de saturação NMR (STD-NMR)

NOTA: As linhas subsequentes descrevem os procedimentos fundamentais para adquirir, processar e analisar experimentos de RMN-DST. Essas etapas servem para exemplificar a utilidade da técnica para detectar a ligação do ligante e para elucidar o epítopo de ligação do ligante. Para uma compreensão mais profunda do projeto e aquisição de experimentos de RMN, consulte o manual do fabricante correspondente fornecido com o instrumento de RMN.

  1. Aquisição
    1. Preparar a amostra com o complexo proteína-ligante. Empregam proporções molares de glicano:lectina entre 10:1 e 100:1 com concentrações de proteína variando entre 0,01 e 0,2 mM. Para a interação de hGalectina-7 com LacNAc, use a proporção proteína: ligante de 50: 1 em solução salina tamponada com fosfato deuterado em pH 7,4.
      NOTA: O receptor de proteína deve ser puro e solúvel no tampão de escolha (no caso de experimentos de RMN-DST, versões deuteradas do tampão correspondente são preferíveis para reduzir a possível interferência do sinal de RMN de 1H). A concentração da proteína é previamente verificada por meio de um espectrofotómetro para medir a absorvância a 280 nm.
    2. Da solução preparada, transferir um volume total de 0,6 mL para um tubo de RMN de 5 mm usando uma pipeta.
    3. Prepare o instrumento de RMN na temperatura necessária (as temperaturas comuns do experimento caem entre 10 °C e 45 °C). Abra o monitor de controle de temperatura usando o comando edte e defina a temperatura desejada. Para o estudo hGalectin-7 / LacNAc, a temperatura foi ajustada para 25 ° C.
    4. Gere um novo conjunto de dados contendo a sequência de pulsos zg.
      1. Para uma operação simples, abra um experimento existente e digite o comando edc . Uma caixa de diálogo é exibida, defina o título, as características (especificações da amostra, solvente) e alguns parâmetros do experimento.
      2. Se for necessária uma alteração da sequência de pulso original, navegue pelas janelas ased (parâmetros) e AcquPars (parâmetros de aquisição). Neste ponto, escolha o programa de pulso desejado na biblioteca do espectrômetro.
      3. Para um espectro de RMN padrão de 1H, selecione a sequência de pulso zg na lista disponível.
        NOTA: No caso de amostras com maior teor de água, pode ser necessário o uso de esquemas de supressão de água para aumentar a relação sinal-ruído. O uso de sequências de pulso como zgesgp, que excitam módulos de escultura que tornam excelente supressão, mas controlam a fase dos sinais restantes, são desejáveis. Consulte o tutorial de RMN dos fabricantes para obter informações adicionais sobre os tipos de esquemas de supressão de água e suas principais características.
    5. Insira a amostra de RMN na sonda ativando o ar de elevação da amostra. Use o comando ej, posicione a amostra na parte superior do ímã e desative o levantamento da amostra usando o comando ij.
      NOTA: Para injetar o sample no ímã usando um amostrador automático, use o comando sx seguido do número da posição, n, correspondente à posição do tubo de RMN na bandeja do amostrador automático.
    6. Bloqueie o sinal de solvente digitando o bloqueio de comando e selecionando o solvente apropriado no menu.
    7. Uma vez que a amostra é inserida na sonda, conclua o processo de ajuste e correspondência usando o módulo automático atma ou o módulo manual atmm.
    8. Inicie o calço automático através do comando topshim gui. Isso abrirá uma interface gráfica onde a dimensão do calço 1D será selecionada e iniciada.
      NOTA: Para minimizar as instabilidades de calço devido a variações sutis de campo ou temperatura, o calço automático pode ser ativado para a aquisição do experimento. Isso pode ser feito acessando a janela de controle do BSMS e clicando em autoshim. A transformação em um destaque verde indica que o autoshim foi ativado. Esteja ciente de que, ao usar o autoshim, possíveis problemas de instabilidade da amostra devem passar despercebidos. Portanto, recomenda-se cautela quando o autoshim é empregado.
    9. Determine o pulso de 1H 90°. Isso pode ser realizado automaticamente através do comando pulsecal .
    10. Modifique vários parâmetros na janela AcquPars. Para um espectro regular de RMN de 1H, defina o número de varreduras (NS) em 32 e a janela espectral desejada (SW) em ca. 12 ppm.
      NOTA: A sequência de pulso zgesgp inclui um módulo para supressão de solvente para eliminar o sinal HDO residual, que deve ser centralizado no meio do espectro. Para isso, O1 deve ser definido com precisão em AcquPars.
    11. Defina o ganho do receptor para evitar transbordamento com o comando automático rga.
    12. Agora, adquira o espectro padrão de RMN de 1H usando o comando zg.
    13. Quando a aquisição for concluída, processe o espectro por meio do comando efp. Aplique as correções de linha de base e fase usando a barra de menus TopSpin.
      NOTA: Sinais de RMN de 1H derivados do glicano e da proteína são observados (Figura 1). A análise detalhada do espectro de RMN adquirido é recomendada para a implementação do experimento de RMN de DST, conforme descrito na seção 1.1.14.
    14. Crie um novo conjunto de dados e carregue a sequência de pulso de RMN STD a ser empregada da mesma maneira descrita para o experimento de RMN de 1H na seção 1.1.4. Nos instrumentos Bruker, diferentes sequências de pulso estão disponíveis no catálogo de programas de pulso, todas denominadas stddiffXXX. O mais simples (stddiff) não inclui nenhum esquema de supressão de água ou filtro de supressão de proteínas.
      1. Para amostras com conteúdo significativo de H2O, selecione as sequências stddiffgp19 ou stddiffesgp, que incluem um módulo de escultura de watergate ou excitação. No caso de um espectro com sinais intensos de RMN de proteínas como fundo, selecione as sequências stddiffXXX.3. Em cada caso, otimize os parâmetros específicos correspondentes para cada módulo de supressão de água (ou seja, d19 em esquemas de watergate).
    15. Defina as frequências de ressonância desligada e ligada para o experimento de RMN de DST. Encontre a lista de frequência nos parâmetros AcquPars da janela ased na entrada FQ2LIST. As frequências de ressonância e de ressonância definidas em Hertz devem ser escritas manualmente na lista e salvas com um novo nome. Esta nova lista será usada no experimento STD-NMR.
      1. Escolha a frequência de ressonância em uma região espectral desprovida de sinais de glicanos, geralmente em torno de δ (1H) 0 ou 6,6 ppm, para glicanos típicos (Figura 1). Defina a frequência de ressonância em uma região que não mostre nenhum ligante ou próton de proteína. Pode ser ajustado com segurança em +18000 ou -18000 Hz.
    16. Defina o pulso moldado a ser usado durante o tempo de saturação nos parâmetros AcquPars da janela ased .
      NOTA: Existem muitas possibilidades. As formas gaussianas ou Eburp podem ser empregadas com segurança, com uma largura de 90° do pulso seletivo de 50 ms.
    17. Defina os parâmetros correspondentes na seção AcquPars.
      1. Defina o comprimento do pulso de 1H 90°.
      2. Defina o valor de potência para o pulso moldado (estimado através da ferramenta de forma).
      3. Defina o tempo total de saturação. Valores entre 1 s e 4 s podem ser empregados regularmente.
      4. Defina o atraso de relaxamento para 3 s.
      5. Defina o número de varreduras (NS) como um múltiplo de 8. Normalmente, é definido em 256, 512 ou 1024 para obter a relação sinal-ruído adequada em conjuntos de 2 em cada frequência.
      6. Defina o número de varreduras fictícias (DS) como 8.
      7. Defina o número de pontos em F2 para 16k, 32k ou 64k.
        NOTA: Um número maior de pontos em F2 resultará em melhor resolução e relação sinal-ruído. Por esse motivo, é altamente recomendável usar um mínimo de 16 mil pontos de dados.
      8. Defina o número de pontos em F1. Este é o número de frequências a serem utilizadas, neste caso, 2 (a on-ressonância e a off-ressonância).
        NOTA: Por convenção, F2 refere-se à dimensão direta, a dimensão ao longo da qual o decaimento de indução livre (FID) é amostrado diretamente, enquanto F1 denota a dimensão indireta.
      9. Defina o ganho do receptor (RG) para evitar transbordamento com o comando automático rga.
    18. Calcule o tempo do experimento total usando o comando expt.
    19. Envie o experimento para aquisição por meio do comando zg.
    20. Sempre verifique se o experimento está sendo executado corretamente após alguns minutos.
  2. Processamento
    NOTA: Um espectro pseudo-2D é obtido após a aplicação do protocolo descrito acima. O número de linhas corresponde ao número de frequências empregadas, normalmente duas: a on-ressonância e a off-ressonância.
    1. Processe o fid para o primeiro experimento.
      1. Faça a transformada de Fourier do fid número 1 (através do comando efp) e selecione o destino dos espectros processados (selecione o número procno). Como alternativa, use o comando rser 1 para ler o primeiro fid.
      2. Em seguida, ajuste o fator de alargamento da linha através do comando lb (geralmente 3-5 Hz) e a fase. Para fasear manualmente, clique na guia Processo e ajuste o submenu de fase . Execute correções zero e de primeira ordem clicando e arrastando o botão correspondente. Salve os resultados do faseamento. Além disso, execute a correção da linha de base por meio do comando abs.
    2. Leia o fid para o segundo experimento e faça a transformada de Fourier (através do comando efp) com o mesmo fator de alargamento de linha. Ajuste a fase com os mesmos parâmetros de fase e correção de linha de base e salve o espectro processado com um código diferente.
    3. Leia os dois espectros processados com a função múltipla (comando: .md) e subtraia-os (off-resonance - on-resonance) usando o botão disponível na visualização múltipla (Δ). O novo espectro é o espectro de RMN STD, que é salvo com um código diferente.
    4. Faça uma sobreposição do espectro de RMN de DST com o espectro de ressonância off-ressonância.
      1. Abra o espectro de ressonância (fid 1) e digite o comando .md para abrir a janela de exibição múltipla. Em seguida, carregue o espectro de DST.
      2. Compare as frequências e intensidades (exibidas automaticamente no canto superior direito) dos sinais no espectro de RMN STD. Isso fornece as informações desejadas sobre os prótons que estão próximos da proteína e sua relativa proximidade. Quanto maior a intensidade relativa, mais próximos da proteína eles estão (Figura 2).
    5. Meça as intensidades (integrais) no experimento de ressonância usando o software correspondente. No TopSpin, vá para Analisar > Integrar. Defina as regiões e escreva as integrais em um arquivo (I0).
    6. Meça as intensidades (integrais) no experimento de RMN STD usando os mesmos parâmetros e escreva-os em um arquivo (ISTD).
    7. Calcule o valor STD para cada sinal de próton usando a seguinte equação:
      STD = (ISTD)/I0.
      NOTA: NOTA: O uso da integração de sinais para calcular valores STD requer que os sinais de prótons sejam suficientemente separados. Quando ocorre sobreposição de sinal, como com oligossacarídeos, os valores de STD podem ser determinados avaliando a razão de intensidade do sinal entre os espectros de STD e off-ressonância.
    8. Calcule o STD relativo como uma porcentagem. Para fazer isso, dê um valor de 100% ao próton que exibe a diferença máxima entre as intensidades no espectro de ressonância fora e no espectro de RMN de DST. Calcule as intensidades relativas de STD para os outros prótons de acordo.
      NOTA: A análise adequada dos dados de DST, especialmente para determinar o epítopo de ligaçãodo ligante, requer a atribuição completa de sinais 1 H do ligante. Portanto, é altamente recomendável que esta tarefa seja concluída antes da aquisição dos espectros de DST.

2. 1Experimentos H-15N HSQC

NOTA: As linhas a seguirdetalham o emprego de experimentos 1 H-15N HSQC para monitorar as mudanças químicas das ressonâncias de RMN1 H e 15N do receptor (lectina) em resposta à presença de quantidades crescentes do ligante (oligossacarídeo) 19 . A análise de Perturbação de Deslocamento Químico (CSP) com base nos dados extraídos é altamente valiosa para a identificação de parceiros de ligação, mas também para mapear a interface de ligação de proteínas e determinar afinidades de ligação. Para uma compreensão mais profunda do projeto e aquisição de experimentos de RMN, consulte o manual do fabricante correspondente fornecido com o instrumento de RMN.

  1. Aquisição e processamento
    1. Prepare a amostra com a lectina de interesse. Certifique-se de que o receptor esteja totalmente marcado com 15N em todos os resíduos de aminoácidos, tanto na espinha dorsal quanto nas cadeias laterais. Normalmente, para detectar os picos cruzados de HN trocáveis em água no espectro, empregue uma mistura 90:10 de H2O: D2O para preparar a solução tamponada. As concentrações de lectina necessárias variam entre 0,05 e 0,2 mM, dependendo da disponibilidade do receptor marcado com 15N e da relação sinal-ruído necessária.
      NOTA: A proteína deve ser estável durante todo o tempo experimental sem geração visível de precipitado no tubo de RMN. Além disso, deve ser puro e solúvel no tampão selecionado. A atribuição completa de 1H e 15N dos picos cruzados HSQC deve ter sido realizada previamente para que cada pico cruzado no espectro HSQC seja identificado com um rótulo correspondente ao resíduo de aminoácido específico.
    2. A partir desta preparação, transferir um volume total de 0,6 mL para um tubo de RMN de 5 mm.
    3. Defina o instrumento de RMN na temperatura necessária. Consulte a etapa 1.1.3 e siga as mesmas operações.
    4. Crie um novo conjunto de dados. Consulte a etapa 1.1.4 e repita as operações.
    5. Insira a amostra de RMN na sonda conforme descrito na etapa 1.1.5.
    6. Bloqueie o sinal do solvente. Para iniciar o procedimento de travamento, use o comando lock e selecione o solvente apropriado no menu. O sinal de bloqueio pode ser rastreado na janela de bloqueio. Defina o ganho de bloqueio para que o sinal de bloqueio fique visível na janela de bloqueio.
    7. Conclua o processo de ajuste e correspondência automaticamente (através do comando atma) ou manualmente (o comando atmm abrirá a janela de controle ATM para ajustar a curva de oscilação).
    8. Defina os calços ideais usando a ferramenta TopShim. Use o comando topshim gui. Consulte as instruções na etapa 1.1.8.
    9. Determine o comprimento do pulso de 1H 90° (conforme descrito na etapa 1.1.9) e a frequência de deslocamento (o comando o1calib executará uma rotina de calibração O1 interativa, recuperando a frequência de deslocamento). Este último parâmetro é extremamente importante quando experimentos com esquemas de supressão de solventes são empregados.
    10. Crie um novo conjunto de dados conforme descrito na seção 1.1.4. Para reduzir ou eliminar a interferência do sinal H2O, use a sequência de pulso zgesgp.
    11. Configure o experimento modificando vários parâmetros na janela AcquPars.
      1. Introduza o comprimento do pulso de 1H 90° e o deslocamento (o1) conforme determinado anteriormente e defina o número de varreduras (NS) em 32 e a janela espectral (SW) em cerca de 12 ppm.
      2. Determine o nível de potência do pulso moldado usando a ferramenta Forma disponível na barra de menus Topspin.
      3. Defina o ganho do receptor com o comando automático rga.
    12. Adquira o experimento usando o comando zg e processe o FID resultante para obter o espectro de RMN de 1H.
    13. Crie um novo conjunto de dados a ser usado para adquirir o experimento de RMN 1 H-15N HSQC. Na guia AcquPars, selecione o programa de pulso hsqcetfpf3gp disponível no catálogo de programas de pulso.
    14. Configure o experimento. Carregue as formas, potências e tempos padrão usando o comando getprosol. Em seguida, atualize os valores do comprimento e deslocamento do pulso de 1H 90°.
    15. Defina os parâmetros a seguir.
      1. Defina o atraso de relaxamento em 1-5 s.
      2. Defina o número de varreduras como um múltiplo de 4. Normalmente, é definido como 8, 16, 32 ou 64 para obter a relação sinal-ruído adequada.
      3. Defina o número de varreduras fictícias como 128.
      4. Defina o número de pontos em F2 para 1k, 2k ou 4k.
      5. Defina o número de pontos em F1: o número de incrementos t1 a serem usados. Dependendo da janela espectral, isso está entre 128 e 256.
      6. Ajuste o centro da janela espectral na dimensão de 15N para δ 117 ppm e configure a largura espectral correspondente para 36 ppm. Esses valores precisam ser otimizados para cada sistema específico.
      7. Defina o ganho do receptor para evitar estouro (usando o comando rga )
    16. Calcule o tempo do experimento total. Um tempo experimental típico é de cerca de 1 h.
    17. Digite zg para enviar o experimento para aquisição.
      NOTA: Sempre verifique se o experimento está sendo executado corretamente após alguns minutos.
    18. Processe o FID usando o comando xfb. Execute a correção de linha de base usando o comando abs2 e correções de fase na guia Processo. Para fasear manualmente, clique no submenu ajustar fase e selecione vários picos cruzados dos espectros 2D. Em seguida, aplique sequencialmente correções de zero e de primeira ordem às linhas e colunas clicando e arrastando o botão correspondente. Salve os resultados do faseamento.
    19. Salve o espectro 2D resultante.
    20. Prepare uma solução de estoque altamente concentrada do ligante. Os valores típicos são 50-100 mM.
    21. Da solução estoque altamente concentrada do glicano, transfira o volume correspondente (alguns microlitros) para o tubo de RMN contendo o receptor para obter a relação molar proteína: ligante desejada e registre os espectros.
      NOTA: Esta etapa inicia a série de titulação, onde o ligante é titulado na amostra de proteína. As proporções proteínas/ligantes apropriadas devem ser determinadas para cada caso particular. Se a afinidade de ligação for completamente desconhecida, recomenda-se o uso de quantidades subestequiométricas do ligante nos pontos iniciais.
    22. Execute as etapas 2.1.1 a 2.1.19 para a amostra recém-preparada.
    23. Repita as etapas 2.1.21 e 2.1.22 para amostras com proporções crescentes de proteína/ligante.
      NOTA: O ajuste preciso dos dados da série de titulação requer a aquisição de vários experimentos1 H-15 N-HSQC, cobrindo uma ampla gama de proporções proteína-ligante, incluindo aquelas necessárias para atingir a saturação de proteínas.
  2. Análise
    1. Visualize o espectro HSQC 2D processado para a espécie apo usando o software apropriado: TopSpin, MestReNova e CCPNMR são todos programas adequados para lidar com dados de RMN.
      NOTA: Este é o espectro de impressão digital da proteína. Os deslocamentos químicos observados de 1H e 15N dependem do ambiente químico correspondente de cada aminoácido, que depende fortemente da estrutura 3D da proteína. Esse espectro é chamado de espectro de impressão digital de proteína. Um espectro HSQC 2D 1 H-15N bem disperso, no qual todos os picos cruzados exibem intensidades uniformes, sugere fortemente a presença de uma proteína bem dobrada19.
    2. Gere a lista de frequências de 1H e 15N para todos os picos cruzados. O uso de softwares complementares, como o programa CCPNMR20, pode auxiliar no processo.
    3. Sobreponha o espectro do primeiro ou segundo pontos de titulação ao da proteína apo.
      1. Para fazer isso, abra o espectro 2D correspondente ao estado apo, clique na guia Exibição múltipla e adicione o segundo espectro 2D. A inspeção visual de ambos os espectros fornece informações sobre a existência de interação entre o ligante e a proteína.
        NOTA: Do ponto de vista da proteína, a existência de ligação proporciona alterações no ambiente químico dos aminoácidos diretamente envolvidos no evento de reconhecimento, com as perturbações de deslocamento químico (CSP) concomitantes.
    4. Repita as etapas 2.2.2 e 2.2.3 para cada ponto de titulação, gerando listas das frequências de 1H e 15N para todos os picos cruzados nos diferentes espectros, correspondendo a diferentes razões molares proteína-ligante.
      NOTA: Os deslocamentos químicos em cada ponto de titulação podem ser medidos sem a necessidade de realizar qualquer nova atribuição de pico cruzado. No caso do regime de troca rápida, comumente observado nas interações lectina:glicano, pode-se simplesmente seguir o movimento progressivo dos picos ao longo da titulação.
    5. Verifique se, para o último ponto de titulação, basicamente não há perturbações de deslocamento químico em relação à adição anterior. Este fato é indicativo de que o sítio de ligação à proteína foi saturado com o ligante, que está em alto excesso.
    6. Calcule as perturbações máximas de deslocamento químico (maxCSP) usando a equação abaixo:
      figure-protocol-1
      ΔH e ΔδN são as diferenças de deslocamento químico nas frequências de 1H e 15N entre o estado apo e o último ponto de titulação, respectivamente.
    7. Plote as perturbações máximas de deslocamento químico (maxCSP) no eixo y vertical de um gráfico 2D versus o resíduo de aminoácido correspondente (no eixo x horizontal).
    8. Faça uma inspeção visual dos resíduos de aminoácidos que exibem o CSP máximo entre os estados ligado e apo da proteína. É altamente provável que eles pertençam ao local de ligação ou sejam vizinhos dele.
    9. Se a estrutura 3D da proteína estiver disponível, abra o PDB correspondente com o software apropriado, como PyMOL ou BIOVIA Discovery studio. Esses programas de visualização molecular são amplamente utilizados em aplicações de biologia estrutural. Selecione os resíduos que exibem o maxCSP mais alto (acima de duas vezes o desvio padrão) com uma cor específica para localizar o local de ligação putativo.
    10. No caso de um regime de troca rápida, estimar a constante de dissociação (KD) a partir de um ajuste não linear de mínimos quadrados do CSP observado para os picos cruzados 1 H-15N HSQC em cada ponto (Δδobs) versus a concentração específica de proteína [P] e ligante [L] naquele ponto:
      figure-protocol-2
      NOTA: Esta equação pode ser aplicada aos picos cruzados que exibem sinais isolados claros. Os valores obtidos são calculados para fornecer a estimativa de KD.

Resultados

Aqui, apresentamos um protocolo para a exploração de experimentos de RMN1 H-STD e 1 H-15N HSQC para desvendar os detalhes da interação de ligação entre lectinas e pequenos oligossacarídeos. Os resultados obtidos na análise do reconhecimento molecular de LacNAc por hGalectina-7 (hGal-7) são incluídos, servindo como um exemplo ilustrativo da implementação bem-sucedida do protocolo e da eficácia dessas metodologias de RMN para estudar os detalhes do processo de reconhecimento molecular. A Figura 3 mostra o espectro de RMN 1H-STD para a interação de LacNAc com hGal-7. A existência de sinais de RMN de DST indica ligação (Figura 3A). Além disso, apenas os sinais pertencentes aos prótons em contato próximo com a proteína aparecem, permitindo o delineamento do epítopo de ligação (Figura 3B). A Figura 4 destaca como o espectro HSQC1 H-15N de uma proteína pode ser usado como sua impressão digital, e a Figura 5 ilustra a aplicação de experimentos de titulação de coerênciaquântica única heteronuclear 1 H-15N (HSQC) para definir a perturbação de deslocamento químico de grupos amida de backbone hGalectina-7 após a ligação de LacNAc. Esses dados não apenas revelam a existência de interação, mas também delineiam a interface de ligação da lectina. A Figura 6 demonstra como a análise dos dados de titulação permite estimar a afinidade de ligação de LacNAc por hGalectina-7, que se enquadra na faixa micromolar alta. Esse achado é consistente com os resultados obtidos com técnicas alternativas.

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Figura 1: A seleção da frequência de ressonância. 1Espectro H-NMR de LacNAc:hGal-7 proporção 50:1 em solução salina tamponada com fosfato deuterado em pH 7,4 é mostrado. Os sinais do ligante (LacNAc) estão confinados na região entre 2,0-5,2 ppm. A frequência de saturação é cuidadosamente selecionada para garantir a ausência de prótons ligantes dentro de uma faixa de 1-2 ppm, permitindo a irradiação seletiva dos prótons da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O experimento de RMN de DST. Representação esquemática do experimento STD: o primeiro espectro (off-ressonância) serve como referência, enquanto no segundo (on-ressonância), a saturação da proteína é realizada. A saturação é propagada de forma eficiente por toda a proteína e transferida para os prótons ligantes em contato próximo com a proteína. O espectro de diferença resultante (espectro STD) produz apenas as ressonâncias que sofreram saturação. A análise do experimento STD permite o mapeamento de epítopos do açúcar de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Análise de ligação da perspectiva do ligante. (A) Sobreposição dos espectros off-ressonância e 1H STD-NMR para a interação de LacNAc com hGal-7. No espectro de DST, apenas os sinais pertencentes aos prótons em contato próximo com a proteína aparecem. A anotação das ressonâncias 1H do ligante é relatada no espectro de ressonância off. (B) As intensidades relativas de STD foram mapeadas por cores na estrutura química de LacNAc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: O espectro 1 H-15N HSQC de uma proteína representa sua impressão digital. (A) 1espectro H-15N HSQC de 100 μM de hGal-7 na forma apo. O espectro foi registrado a 25 °C. Alguns picos cruzados NH foram anotados com o rótulo de seu aminoácido correspondente. (B) Cada par de NH exibe uma mudança química única que depende do ambiente químico e, consequentemente, da estrutura 3D da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Análise de ligação da perspectiva da proteína. (A) A sobreposição dos espectros 1 H-15N HSQC registrados para a titulação de LacNAc em solução hGal-7 é mostrada. A inspeção dos espectros, onde vários picos cruzados experimentam mudanças de deslocamento químico, indica claramente a interação. (B) O gráfico das perturbações máximas de deslocamento químico (maxCSP) dos sinais de amida da espinha dorsal deduzidos da titulação de LacNAc (15 equivalentes) com hGal-7. (C) Os aminoácidos mais perturbados de hGal-7, de acordo com a análise CSP, são mapeados na estrutura PDB de 5gal. No modelo 3D, a coloração vermelha refere-se ao valor CSP acima de 2σ, enquanto as rosa a valores entre 1σ e 2σ. A região colorida provavelmente representa o local de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Determinação de KD com base em experimentos de titulação de 1 H-15N HSQC. (A) Representação do padrão de titulação baseada em 1 H-15N HSQC dependendo da taxa de troca química na escala de tempo de RMN do sistema no estudo (rápido, intermediário ou lento). Um regime de troca rápida foi observado no caso da interação LacNAc/hGal-7. (B) Curva de ajuste e estimativa de KD obtida a partir da análise CSP em concentrações variáveis de ligantes para o sistema modelo de hGal-7 e dissacarídeo LacNAc. O KD estimado é relatado com o erro correspondente como uma média dos dados para 20 aminoácidos diferentes; (C) Trechos dos espectros 1 H,15N-HSQC exibindo o deslocamento dos picos cruzados selecionados durante a titulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A RMN por diferença de transferência de saturação (STD-RMN) tornou-se o método de RMN mais utilizado e versátil para estudar as interações ligante-proteína. Como mostrado acima, ele se baseia no fenômeno de transferência de saturação, e a configuração experimental envolve a aquisição de dois espectros unidimensionais (1D) de 1H: os espectros de ressonância e de ressonância. Durante o experimento de ressonância, a saturação de prótons específicos da proteína é alcançada pela aplicação de um trem de pulsos de radiofrequência de baixa potência durante um determinado período (o tempo de saturação normalmente varia de 1 a 3 s). Para evitar a saturação direta do ligante, a frequência e o comprimento dos pulsos de saturação são otimizados para irradiar seletivamente prótons específicos da proteína; ou seja, devem ser aplicados em uma frequência vaga de qualquer sinal de ligante e com um comprimento adequado (Figura 1). Como regra geral para pulsos de saturação de 50 ms, a diferença de 1 ppm deve ser mantida da região de saturação para os sinais de ligante mais próximos. Geralmente, pulsos de saturação seletiva aplicados na região alifática da proteína proporcionam efeitos de saturação aumentados. Alternativamente, prótons aromáticos (6-7 ppm) também podem ser irradiados se a molécula ligante não contiver nenhum sinal aromático. Isso é muito útil para glicanos naturais, pois eles não possuem grupos aromáticos. Uma vez que uma certa região da proteína é irradiada seletivamente, a saturação se propaga ao longo da proteína por meio de relaxamento cruzado dipolar 1 H-1H (difusão de spin). Eventualmente, a saturação atinge os prótons da proteína no local de ligação, que é então transferido para os prótons de açúcar que estão em contato próximo (r < 5 Å) com o receptor por meio de NOEs intermoleculares 1 H-1H. Obviamente, a intensidade dos sinais dos prótons ligantes saturados diminui. Depois de receber a saturação, devido à cinética de ligação, os ligantes transitoriamente ligados (é necessária uma troca rápida) se dissociam e as informações de saturação são acumuladas no estado livre. Devido a esse processo, os espectros de ressonância de RMN apresentam sinais diminuídos (Figura 2).

Para exibir claramente essa perturbação de intensidade dos núcleos 1H de um glicano de ligação, um espectro de RMN de prótons de controle (off-ressonância) é adquirido no qual a saturação é aplicada longe de qualquer sinal de receptor ou carboidrato (geralmente entre 40-100 ppm), sob as mesmas condições. O espectro 1D subtraído entre a off-ressonância e a on-ressonância mostra exclusivamente os sinais dos núcleos 1 H doligante que têm intensidades modificadas: aqueles que estavam próximos o suficiente do local de ligação do receptor para receber a magnetização (Figura 2).

No entanto, nem todos os núcleos 1H do carboidrato ligado recebem a mesma quantidade de saturação. Teoricamente, a transferência de magnetização do receptor para o ligante ligado depende da distância (1 / r6). Isso significa que as intensidades de saturação transferida entre os núcleos de glicano 1H contêm informações sobre as proximidades espaciais entre os prótons do ligante e os do receptor, e as intensidades de RMN de DST são maiores para os prótons que estão mais próximos do receptor. Assim, o experimento de RMN de DST também permite determinar o epítopo de ligação do carboidrato (Figura 2 e Figura 3), uma vez que os prótons do ligante mais próximos da superfície da proteína apresentam intensidades mais altas do que aqueles que não participam diretamente da ligação.

O experimento pode ser aplicado a sistemas com afinidade fraca-média, raramente a sistemas com fortes afinidades na faixa de μM ou nM baixo. Na verdade, requer que a taxa de dissociação seja rápida na escala de tempo de relaxamento. Caso contrário, a informação de transferência de saturação é perdida por relaxamento antes que o ligante se dissocie.

Por outro lado, os experimentos de RMN baseados em proteínas são exclusivos para desvendar a interação ligante-proteína com precisão do nível de aminoácidos sem resolver as estruturas de resolução atômica. Ele examina diretamente os fenômenos de reconhecimento molecular em solução sem a necessidade de co-cristalização. O mapeamento da análise CSP é excepcionalmente poderoso para descobrir ligantes e mapear o local de ligação à proteína (Figura 4 e Figura 5). Este método é aplicável a qualquer faixa de afinidades entre a faixa mM e nM, mesmo para sistemas onde a taxa de câmbio é lenta na escala de tempo de deslocamento químico21.

No entanto, essa abordagem provavelmente não funcionará para proteínas com pesos moleculares acima de 30-40 kDa devido a problemas de relaxamento. A alternativa TROSY18 pode então ser usada, sendo particularmente potente quando acoplada à deuteração de proteínas. Além disso, a proteína deve ser marcada uniformemente com 15N (e outra amostra duplamente marcada com 13C e 15N para poder completar a atribuição de backbone necessária). Portanto, as condições de expressão de proteínas, incluindo o sistema de expressão correspondente, devem ser otimizadas para poder obter quantidades de miligramas de proteína. As proteínas que apresentam tendência a oligomerizar ou agregar também não são adequadas para esta análise. O instrumento usado aqui para registrar os dados de RMN é um espectrômetro Bruker de 800 MHz equipado com uma criossonda TCI. Seria altamente desafiador usar essa metodologia usando instrumentos abaixo de 600 MHz ou sem uma sonda criogênica.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos à Agência Estatal de Investigación da Espanha pela Acreditação do Centro de Excelência Severo Ochoa CEX2021-001136-S, financiada pelo MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, e CIBERES, uma iniciativa do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madri, Espanha). Agradecemos também à Comissão Europeia pelo projeto GLYCOTWINNING.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conjunto de microtubos Shigemi de 5 mm CortecNetSASS30BMS-005B
Alpha-Lactose-AgaroseSigma-Aldrich Quí mica S.L.7634-5ML
Cloreto de amônio (15 N, 99%)LC-0179-N-50GTracer Tecnologí como Analí ticas S.L
Ampicilina (Sal de Sódio) Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery studio BIOVIA, Dassault Systè mes
BL21(DE3) Células Quimicamente Competentes Merck Ciências da Vida, S.L.U.Centrífuga CMC0014-40X40UL
Beckman CoulterAllegra X-22R
D2O Laboratórios de Isótopos de Cambridge, Inc.DLM-4-1000
IncubadoraEppendorfInnova 42
IPTG (Isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosídeo)VWR International Eurolab S.L.
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) CaldoMerck Life Science, S.L.U.3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10xBio-Rad1610780
PyMOLPyMOL Sistema de Gráficos MolecularesVersão 2.0 Schrö dinger
SonicatorSonics & Materiais, Inc.VC 505
Ímã de RMN supercondutorBruker600 MHz AVANCE III
Ímã de RMN supercondutorBruker800 MHz AVANCE III
VW437144N

Referências

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