Artigo de método

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

DOI:

10.3791/66543

⸱

12 de julho de 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A retina compreende numerosas células que formam diversos circuitos neuronais, que constituem o primeiro estágio da via visual. Cada circuito é caracterizado por características únicas e neurotransmissores distintos, determinando seu papel e significado funcional. Dados os intrincados tipos de células dentro de sua estrutura, a complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para a exploração. Para investigar melhor os circuitos retinianos e a conversa cruzada, como a ligação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular precisa (neurotransmissores ou neuropeptídeos), como a presença de imunorreatividade semelhante à substância P na retina do camundongo, empregamos um método de microscopia imunoeletrônica pré-incorporada (imuno-EM) para explorar as conexões sinápticas e a organização. Essa abordagem nos permite identificar conexões sinápticas intercelulares específicas e localização molecular precisa e pode desempenhar um papel orientador na exploração de sua função. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo (1) preparação para fixação da retina, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para exploração, considerando os diversos tipos de células dentro de sua estrutura 1,2. A etapa inicial envolve a identificação de conexões sinápticas entre diferentes células e a determinação da localização celular de neurotransmissores ou neuropeptídeos específicos. À medida que os avanços da biologia molecular introduzem novas proteínas, a localização precisa na retina torna-se crucial para entender suas funções e analisar os circuitos retinianos e as conexões sinápticas 3,4,5.

Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a microscopia eletrônica (EM) é comumente usada para detectar as estruturas subcelulares das células nervosas. O EM possui várias classificações, sendo a microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) utilizada para observar as ultraestruturas celulares 6,7,8,9. A microscopia imunoeletrônica (immuno-EM), que combina a resolução espacial do EM com a capacidade de identificação química de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas10, destaca-se como o método ideal e exclusivo para investigar conexões sinápticas e localização de proteínas subcelulares na retina11,12.

As técnicas de imuno-EM podem ser divididas em métodos de pré-incorporação e pós-incorporação com base na ordem de incorporação e incubação de anticorpos. Em comparação com o método pós-incorporação, a abordagem pré-incorporação é capaz de identificação em larga escala e longa distância13 , 14 , 15 , oferecendo uma abordagem ideal para estudar processos celulares como axônios e dendritos. Além disso, essa técnica fornece um sinal forte e amplo campo de visão, tornando-a vantajosa para investigações abrangentes da expressão de proteínas e localização molecular no citoplasma. Este método é particularmente valioso para garantir estruturas quimicamente identificadas que são visíveis em todo o citoplasma, células ou retina.

No entanto, o método pós-embedding, embora tenha menor penetração ou difusão em comparação com o método pré-embedding, não é tão sensível16,17. Em termos simples, se o objetivo é explorar a localização de neurotransmissores específicos no citoplasma ou nos terminais sinápticos, o imuno-EM pré-incorporado é o método preferido. Por outro lado, para identificar a localização dos receptores de membrana, é mais recomendável utilizar o imunogold EM pós-incorporação.

Dadas essas considerações, optamos pelo método imuno-EM pré-incorporação para mergulhar nos circuitos da retina, incluindo a interação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular, como a distribuição e organização sináptica da imunorreatividade semelhante à substância P (SP-IR) na retina do camundongo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cuidado e o manuseio dos animais foram aprovados pelo Regulamento do Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou, de acordo com as diretrizes da ARVO. Camundongos adultos (C57BL/6J, machos e fêmeas, 8 a 12 semanas de idade) foram utilizados nesta pesquisa. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para fixação da retina

  1. Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, duas pinças com pontas muito finas, tesoura, uma agulha de seringa de 1 mL (tamanho da agulha: G26) e papel de filtro.
  2. Anestesiar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 0,25 mg / g de peso corporal. Posteriormente, decapitar os ratos e cortar suas cabeças16.
  3. Enuclee os olhos com uma tesoura de cotovelo e coloque-os em um prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído e 0,2% de ácido pícrico em tampão fosfato 0,1 M (PB; pH 7,4).
  4. Sob o microscópio de dissecação, faça um orifício no limbo da córnea usando uma agulha de seringa de 1 mL e corte o segmento anterior com uma tesoura, seguindo o orifício. Em seguida, remova a lente da superfície interna da retina com uma pinça.
  5. Use duas pinças para descascar cuidadosamente a esclera até que a retina esteja completamente isolada da ocular (o tecido da retina em forma de concha separado completamente da coroide). Posteriormente, corte a retina em quatro pedaços.
  6. Fixe essas seções em paraformaldeído a 4% e ácido pícrico a 0,2% em PB 0,1 M (pH 7,4) por 2 h à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, transfira o tecido para paraformaldeído a 4% em PB 0,1 M (pH 10,4) durante a noite a 4 ° C.

2. Imunocoloração pré-incorporada

  1. Após lavar em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos retinianos em borohidreto de sódio a 1% (NaBH4) em PBS 0,01 M (pH 7,4) por 30 min.
  2. Lave as seções da retina em 0,01 M PBS (pH 7,4) pelo menos seis vezes. Enquanto isso, remova o vítreo com papel de filtro e, em seguida, corte a retina em pequenas fatias entre 100-300 μm usando uma lâmina de barbear de dois gumes.
  3. Após o bloqueio com 5% de soro de cabra normal (NGS) em 0,1 M PB (pH 7,4) por 1 h em RT, incubar as fatias da retina com anticorpos primários (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) juntamente com 2% de NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um agitador. Em seguida, incubar durante 96 h (5 dias) a 4 °C num agitador.
  4. Depois de lavar seis vezes por 10 min cada em 0,01 M PBS (pH 7,4), incubar as fatias da retina com o anticorpo secundário a 1:200, como IgG anti-coelho de cabra, juntamente com 2% NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um shaker. Em seguida, incubar durante 48 h (2 dias) a 4 °C num shaker.
    NOTA: Anticorpos secundários foram aplicados isoladamente em experimentos de controle.
  5. Lave as listras retinianas em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada antes de incubar com o reagente A e o reagente B do kit ABC a 1:100 em PBS 0,01M (pH 7,4) por 2 dias a 4 ° C. (Tanto o reagente A quanto o reagente B foram diluídos com 0,01 M PBS. Por exemplo: Uma solução: 6 μl; Solução B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, total de 600 μl).
  6. Lave as listras retinianas em tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada. Em seguida, pré-incube as listras retinianas com 5% de reagente 1 e 5% de reagente 3 do kit DAB em água destilada por 1 hora em temperatura ambiente. (A proporção, por exemplo: reagente 1: 50 μl; reagente 3: 50 μl; água destilada: 900 μl, total de 1000 μl).
  7. Pinte as listras da retina com DAB. Adicionar o mesmo volume de solução de três tubos do kit DAB em sequência (reagente 1-reagente 2-reagente 3). Observe a condição de coloração usando o microscópio de dissecação. Pare a coloração quando as células ficarem marrons; Este processo leva de 10 a 20 minutos.
  8. Lave as listras retinianas com tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada e depois lave em 0,01 M PBS seis vezes por 10 min cada.

3. Pós-fixação e incorporação

  1. Fixe as listras retinianas em glutaraldeído a 2% por 1-2 h em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, lave em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada.
  2. Incubar as listras retinianas com tetróxido de ósmio a 1% (OsO4) em 0,1 M PB por 1 h em RT e mantê-las em local escuro.
  3. Após lavar em água destilada (ddH2O) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos da retina com acetato de uranila por 1 h em RT e mantê-los em local escuro para manchar esses tecidos.
  4. Coloque os tecidos da retina em soluções de acetona (50%, 70%, 80% e 90%) por 10 minutos cada, depois em 100% duas vezes por 10 minutos cada.
  5. Mergulhar os tecidos retinianos numa mistura contendo o mesmo volume de acetato de uranilo e uma resina epóxi durante 1 h a uma estufa de secagem a 37 °C, seguida de uma mistura contendo acetato de uranilo e a resina (1:4) durante a noite a 37 °C.
  6. Transfira os tecidos da retina suavemente usando um palito de dente para a nova resina por 1 h a 45 ° C em um forno de secagem e, em seguida, a faixa retiniana orientada é embutida na placa de incorporação com a resina.
  7. Colocar a amostra numa estufa de secagem a 45 °C durante 3 h e numa estufa de secagem a 65 °C durante 48 h.
  8. Molde os blocos de incorporação em trapézios e corte o bloco em seções de 1 μm de espessura com um ultramicrótomo, pinte essas seções com azul de toluidina e pré-selecione as regiões de interesse em um microscópio óptico.
  9. Colete seções ultrafinas (70-90 nm) em grades de cobre e visualize-as sob um microscópio eletrônico.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 1 mostra exemplos de experimentos de controle sem a incubação de anticorpos primários contra a proteína quinase C alfa (PKCα) ou SP, nos quais nenhuma imunorreatividade (IR) foi encontrada.

A Figura 2 mostra o PKCα-IR na retina do camundongo. PKCα serve como um marcador para todas as células bipolares de bastonetes (RBC) na retina18. No nível de microscopia eletrônica (EM), as hemácias podem ser identificadas por meio de PKCα-IR, visualizado pelo produto da reação de diaminobenzidina (DAB) com alta densidade eletrônica. A Figura 2A ilustra um dendrito eritrocitário PKCα-positivo formando uma sinapse com um terminal de bastonete na camada plexiforme externa (OPL), enquanto a Figura 2B mostra uma sinapse cone-RBC onde um dendrito eritrocitário PKCα-positivo é pós-sináptico a um terminal de cone. Além disso, o produto da reação DAB auxilia na identificação de terminais RBC ( Figura 2C ) e processos axonais ( Figura 2D ) na camada plexiforme interna (IPL).

A Figura 3 mostra a expressão da substância P (SP) nas conexões pré e pós-sinápticas no IPL da retina do camundongo. As células amácrinas SP-IR são pré-sinápticas às células amácrinas SP-negativas (Figura 3A), bem como aos processos amácrinos SP-IR (dados não mostrados). Além disso, as células amácrinas SP-IR são terminais pós-sinápticos a bipolares nos níveis da subcamada 3 (S3) e subcamada 5 (S5) de IPL, respectivamente ( Figura 3B , C ). Nossa pesquisa anterior detalha a análise de sinapses onde os processos de células amácrinas SP-IR formam saídas sinápticas em outros processos no IPL19. Notavelmente, a localização subcelular de SP é encontrada principalmente em vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos (Figura 3).

figure-results-1
Figura 1: Micrografias imunoeletrônicas de experimentos de controle. Tanto o pedículo do cone (CP) com duas fitas (ponta de seta) (A) quanto a esférula da haste (RS) com uma fita no OPL (B) não apresentaram coloração. Barras de escala: 500 nm (A), 200 nm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Micrografias imunoeletrônicas marcadas com anticorpo PKCα na retina do camundongo. (A) RS se conecta com um eritrócitos PKCα-positivo (setas indicam imunorreatividade) e duas células horizontais (H) no OPL. (B) CP se conecta com eritrócitos PKCα-positivos no OPL. (C) e (D) mostram o terminal de hemácias PKCα-positivo e o processo axonal no IPL, respectivamente. Barras de escala: 200 nm (A), 500 nm (B), 500 nm (C), 500 nm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Micrografias imunoeletrônicas marcadas com anticorpo SP no IPL da retina de camundongos. (A) A célula amácrina SP-IR (A+) é pré-sináptica a uma célula amácrina SP-negativa (A-). As células amácrinas SP-IR receberam entradas de terminais bipolares nos níveis S3 (B) e S5 (C) de IPL, respectivamente. Barras de escala: 200 nm (A), 200 nm (B), 200 nm (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreveu três etapas críticas para a observação bem-sucedida dos circuitos sinápticos e localização de proteínas: (1) fixação rápida e fraca, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Propomos que a fixação é o passo chave para uma abordagem imuno-EM pré-incorporação bem-sucedida. Assim, a importância do fixador fresco e da fixação rápida é enfatizada aqui, nomeando esse princípio de "princípio 4F", que é crucial na preparação do tecido. No entanto, alcançar maior penetração de anticorpos e fixação eficaz representa um desafio20. Para resolver isso, o glutaraldeído foi substituído por ácido pícrico durante a fixação inicial para melhorar a penetração de anticorpos, pois o glutaraldeído pode interromper os determinantes antigênicos e afetar a imunomarcação21. O ácido pícrico, por outro lado, preserva melhor a estrutura da membrana e a integridade do tecido22, embora com comprometimento da eficácia da fixação. Na terceira etapa, foi utilizado glutaraldeído a 2% para pós-fixação para otimizar a fixação tecidual.

Os pontos-chave do protocolo apresentado aqui incluem cinco etapas: (1) Fixação precoce: Utilizar ácido pícrico no estágio inicial para melhor penetração de anticorpos, minimizando a interrupção dos determinantes antigênicos. (2) Pós-fixação: Usando glutaraldeído a 2% para melhorar a fixação do tecido após a imunocoloração. (3) Tratamento de redução: Incubação de tecido em NaBH4 a 1% em PB 0,1 M (pH 7,4) por 30 min para restaurar grande parte da imunorreatividade e melhorar a reatividade imunológica de antígenos e anticorpos, intensificando os sinais positivos23. (4) Preparação do tecido: Remoção do tecido vítreo e corte do tecido retiniano em pequenas tiras para facilitar a incubação eficaz de anticorpos e garantir sinais uniformes. (5) Além disso, é imperativo manusear o tecido retiniano com o máximo cuidado, evitando qualquer dano que possa comprometer observações posteriores ao longo de todo o procedimento. Essas medidas contribuem coletivamente para o sucesso do método imuno-EM pré-incorporação, permitindo estudar diversos aspectos, como sinapses cone-RBC24, localização molecular SP-IR19 e a expressão precisa de α-Syn na retina de camundongos25.

Antes de incubar o primeiro anticorpo, é essencial bloquear as tiras retinianas com 2% de NGS para eliminar a interferência de sinal não específica. A concentração do primeiro anticorpo deve ser determinada com base no próprio anticorpo, normalmente maior do que o usado para coloração por congelação, e deve ser otimizada de antemão. Durante o período de incubação do anticorpo primário, a rotação contínua do tubo de microcentrífuga é necessária para garantir o contato total das tiras retinianas empilhadas com o anticorpo, evitando a penetração incompleta das peças empilhadas. Para amplificar o sinal, o DAB foi pré-incubado antes da coloração padrão do DAB, com o tempo de coloração específico variando tipicamente de 10 a 20 minutos. Se o tempo for muito curto, o sinal pode ser muito fraco para observação e, se for muito longo, pode levar a sinais falsos positivos, afetando o julgamento preciso. Geralmente, o tempo de incubação dos corantes depende diretamente da cor da superfície do tecido (marrom a marrom escuro).

Embora tenham sido realizados experimentos com congelamento de tecido em nitrogênio líquido para aumentar o sinal, como mencionado anteriormente 18,26,27, esse método amplificou os sinais positivos, mas resultou em uma estrutura de membrana deficiente das células da retina (dados não mostrados). Essa degradação estrutural tornou difícil identificar com precisão os tipos de células. Considerando isso, o tecido da retina não foi congelado repetidamente. Para aumentar o sinal positivo, o tempo de incubação dos anticorpos foi estendido adequadamente. O protocolo proposto combina vantagens anteriores, simplificando as etapas em comparação com a incorporação de ágar. Isso não apenas protege os determinantes antigênicos das proteínas, mas também preserva a integridade das membranas celulares. O objetivo geral é explorar as conexões sinápticas e a localização celular de neurotransmissores em todo o caminho. Portanto, os produtos da reação DAB no protocolo não foram submetidos a tratamento de intensificação de prata, tornando-o mais adequado para investigar conexões e vias sinápticas específicas de neurotransmissores28.

Atualmente, existem métodos limitados para a identificação química de vias ou neurotransmissores no nível ultraestrutural. Um desses métodos é a microscopia de luz e eletrônica correlacionada (CLEM) 29 , 30 , que, no entanto, está confinada a uma área muito pequena e não tem a capacidade de identificar conexões em todo o caminho. Os pontos fortes do imuno-EM pré-incorporado residem em seu sinal robusto, amplo alcance e capacidade de posicionamento e rastreamento analítico de longa distância 13,14,15. No entanto, esse método também tem suas limitações, como sinais difusos, tornando-os menos específicos. Para a localização precisa dos receptores de membrana, especialmente aqueles na membrana, pode ser mais adequado usar imunogold EM pós-incorporação. Essa técnica permite a contagem direta de partículas de ouro, facilitando a análise do número e da variabilidade desses receptores de membrana16.

No futuro, a integração do imuno-EM pré-incorporado com o EM de volume é promissor como um método eficaz para a exploração de longo prazo de circuitos neurais identificados, representando as perspectivas futuras para o desenvolvimento desse método. O volume EM enfoca a reconstrução da estrutura, contando com a morfologia para a identificação de estruturas específicas, carecendo de identificação química precisa31,32. Ao combinar o imuno-EM pré-incorporado com o volume EM, estruturas ou substâncias específicas podem ser identificadas durante a reconstrução tridimensional, fornecendo uma abordagem mais abrangente e visualmente intuitiva para a identificação de circuitos neurais.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm divulgações.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103), da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL agulha de seringakangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldeídoMicroscopia Eletrônica Science16020
8% ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Science157-8
Ciência da Microscopia EletrônicaAcetona10000
Anti-coelho PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Coelho SPAbcamab67006
DAB Kit de substratoMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
Tesoura de cotoveloSuzhou66 vision company54010
Microscópio eletrônicoResina PhillipsCM120
EponMicroscopia Eletrônica Ciência14910
fórcepsSuzhou66 vision companyS101A
Papel de filtro MilliporeMerck Millipore 
Na2HPO4· 12H2OSigma71650Um componente do tampão fosfato
NaH2PO4· H2OSigma71507Um componente do tampão fosfato
Ácido pícricoCiência da Microscopia Eletrônica19550
Borohidreto de sódio (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrótomoLeica
Acetato de UraniloCiência da Microscopia Eletrônica22400
Kit VACTASTAIN ABC, Peroxidase (IgG de Coelho)Vector LaboratoriesPK-4001
de PR05538

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Retinal CircuitsImmunoelectron MicroscopyMolecular LocalizationSynaptic ConnectionsPre Embedding ImmunostainingRetinal Neuronal CircuitsSubstance P ImmunoreactivityRod Bipolar CellsOuter Plexiform LayerDAB Staining

Artigos relacionados