Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.
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Artigo de método
Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retina compreende numerosas células que formam diversos circuitos neuronais, que constituem o primeiro estágio da via visual. Cada circuito é caracterizado por características únicas e neurotransmissores distintos, determinando seu papel e significado funcional. Dados os intrincados tipos de células dentro de sua estrutura, a complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para a exploração. Para investigar melhor os circuitos retinianos e a conversa cruzada, como a ligação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular precisa (neurotransmissores ou neuropeptídeos), como a presença de imunorreatividade semelhante à substância P na retina do camundongo, empregamos um método de microscopia imunoeletrônica pré-incorporada (imuno-EM) para explorar as conexões sinápticas e a organização. Essa abordagem nos permite identificar conexões sinápticas intercelulares específicas e localização molecular precisa e pode desempenhar um papel orientador na exploração de sua função. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo (1) preparação para fixação da retina, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.
Introdução
A complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para exploração, considerando os diversos tipos de células dentro de sua estrutura 1,2. A etapa inicial envolve a identificação de conexões sinápticas entre diferentes células e a determinação da localização celular de neurotransmissores ou neuropeptídeos específicos. À medida que os avanços da biologia molecular introduzem novas proteínas, a localização precisa na retina torna-se crucial para entender suas funções e analisar os circuitos retinianos e as conexões sinápticas 3,4,5.
Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a microscopia eletrônica (EM) é comumente usada para detectar as estruturas subcelulares das células nervosas. O EM possui várias classificações, sendo a microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) utilizada para observar as ultraestruturas celulares 6,7,8,9. A microscopia imunoeletrônica (immuno-EM), que combina a resolução espacial do EM com a capacidade de identificação química de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas10, destaca-se como o método ideal e exclusivo para investigar conexões sinápticas e localização de proteínas subcelulares na retina11,12.
As técnicas de imuno-EM podem ser divididas em métodos de pré-incorporação e pós-incorporação com base na ordem de incorporação e incubação de anticorpos. Em comparação com o método pós-incorporação, a abordagem pré-incorporação é capaz de identificação em larga escala e longa distância13 , 14 , 15 , oferecendo uma abordagem ideal para estudar processos celulares como axônios e dendritos. Além disso, essa técnica fornece um sinal forte e amplo campo de visão, tornando-a vantajosa para investigações abrangentes da expressão de proteínas e localização molecular no citoplasma. Este método é particularmente valioso para garantir estruturas quimicamente identificadas que são visíveis em todo o citoplasma, células ou retina.
No entanto, o método pós-embedding, embora tenha menor penetração ou difusão em comparação com o método pré-embedding, não é tão sensível16,17. Em termos simples, se o objetivo é explorar a localização de neurotransmissores específicos no citoplasma ou nos terminais sinápticos, o imuno-EM pré-incorporado é o método preferido. Por outro lado, para identificar a localização dos receptores de membrana, é mais recomendável utilizar o imunogold EM pós-incorporação.
Dadas essas considerações, optamos pelo método imuno-EM pré-incorporação para mergulhar nos circuitos da retina, incluindo a interação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular, como a distribuição e organização sináptica da imunorreatividade semelhante à substância P (SP-IR) na retina do camundongo.
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Protocolo
O cuidado e o manuseio dos animais foram aprovados pelo Regulamento do Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou, de acordo com as diretrizes da ARVO. Camundongos adultos (C57BL/6J, machos e fêmeas, 8 a 12 semanas de idade) foram utilizados nesta pesquisa. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação para fixação da retina
- Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, duas pinças com pontas muito finas, tesoura, uma agulha de seringa de 1 mL (tamanho da agulha: G26) e papel de filtro.
- Anestesiar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 0,25 mg / g de peso corporal. Posteriormente, decapitar os ratos e cortar suas cabeças16.
- Enuclee os olhos com uma tesoura de cotovelo e coloque-os em um prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído e 0,2% de ácido pícrico em tampão fosfato 0,1 M (PB; pH 7,4).
- Sob o microscópio de dissecação, faça um orifício no limbo da córnea usando uma agulha de seringa de 1 mL e corte o segmento anterior com uma tesoura, seguindo o orifício. Em seguida, remova a lente da superfície interna da retina com uma pinça.
- Use duas pinças para descascar cuidadosamente a esclera até que a retina esteja completamente isolada da ocular (o tecido da retina em forma de concha separado completamente da coroide). Posteriormente, corte a retina em quatro pedaços.
- Fixe essas seções em paraformaldeído a 4% e ácido pícrico a 0,2% em PB 0,1 M (pH 7,4) por 2 h à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, transfira o tecido para paraformaldeído a 4% em PB 0,1 M (pH 10,4) durante a noite a 4 ° C.
2. Imunocoloração pré-incorporada
- Após lavar em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos retinianos em borohidreto de sódio a 1% (NaBH4) em PBS 0,01 M (pH 7,4) por 30 min.
- Lave as seções da retina em 0,01 M PBS (pH 7,4) pelo menos seis vezes. Enquanto isso, remova o vítreo com papel de filtro e, em seguida, corte a retina em pequenas fatias entre 100-300 μm usando uma lâmina de barbear de dois gumes.
- Após o bloqueio com 5% de soro de cabra normal (NGS) em 0,1 M PB (pH 7,4) por 1 h em RT, incubar as fatias da retina com anticorpos primários (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) juntamente com 2% de NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um agitador. Em seguida, incubar durante 96 h (5 dias) a 4 °C num agitador.
- Depois de lavar seis vezes por 10 min cada em 0,01 M PBS (pH 7,4), incubar as fatias da retina com o anticorpo secundário a 1:200, como IgG anti-coelho de cabra, juntamente com 2% NGS em 0,01 M PBS (pH 7,4) por 2 h em RT em um shaker. Em seguida, incubar durante 48 h (2 dias) a 4 °C num shaker.
NOTA: Anticorpos secundários foram aplicados isoladamente em experimentos de controle. - Lave as listras retinianas em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada antes de incubar com o reagente A e o reagente B do kit ABC a 1:100 em PBS 0,01M (pH 7,4) por 2 dias a 4 ° C. (Tanto o reagente A quanto o reagente B foram diluídos com 0,01 M PBS. Por exemplo: Uma solução: 6 μl; Solução B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, total de 600 μl).
- Lave as listras retinianas em tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada. Em seguida, pré-incube as listras retinianas com 5% de reagente 1 e 5% de reagente 3 do kit DAB em água destilada por 1 hora em temperatura ambiente. (A proporção, por exemplo: reagente 1: 50 μl; reagente 3: 50 μl; água destilada: 900 μl, total de 1000 μl).
- Pinte as listras da retina com DAB. Adicionar o mesmo volume de solução de três tubos do kit DAB em sequência (reagente 1-reagente 2-reagente 3). Observe a condição de coloração usando o microscópio de dissecação. Pare a coloração quando as células ficarem marrons; Este processo leva de 10 a 20 minutos.
- Lave as listras retinianas com tampão Tris 0,05 M (pH 7,2) três vezes por 10 min cada e depois lave em 0,01 M PBS seis vezes por 10 min cada.
3. Pós-fixação e incorporação
- Fixe as listras retinianas em glutaraldeído a 2% por 1-2 h em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, lave em PBS 0,01 M (pH 7,4) seis vezes por 10 min cada.
- Incubar as listras retinianas com tetróxido de ósmio a 1% (OsO4) em 0,1 M PB por 1 h em RT e mantê-las em local escuro.
- Após lavar em água destilada (ddH2O) seis vezes por 10 min cada, incubar os tecidos da retina com acetato de uranila por 1 h em RT e mantê-los em local escuro para manchar esses tecidos.
- Coloque os tecidos da retina em soluções de acetona (50%, 70%, 80% e 90%) por 10 minutos cada, depois em 100% duas vezes por 10 minutos cada.
- Mergulhar os tecidos retinianos numa mistura contendo o mesmo volume de acetato de uranilo e uma resina epóxi durante 1 h a uma estufa de secagem a 37 °C, seguida de uma mistura contendo acetato de uranilo e a resina (1:4) durante a noite a 37 °C.
- Transfira os tecidos da retina suavemente usando um palito de dente para a nova resina por 1 h a 45 ° C em um forno de secagem e, em seguida, a faixa retiniana orientada é embutida na placa de incorporação com a resina.
- Colocar a amostra numa estufa de secagem a 45 °C durante 3 h e numa estufa de secagem a 65 °C durante 48 h.
- Molde os blocos de incorporação em trapézios e corte o bloco em seções de 1 μm de espessura com um ultramicrótomo, pinte essas seções com azul de toluidina e pré-selecione as regiões de interesse em um microscópio óptico.
- Colete seções ultrafinas (70-90 nm) em grades de cobre e visualize-as sob um microscópio eletrônico.
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Resultados
A Figura 1 mostra exemplos de experimentos de controle sem a incubação de anticorpos primários contra a proteína quinase C alfa (PKCα) ou SP, nos quais nenhuma imunorreatividade (IR) foi encontrada.
A Figura 2 mostra o PKCα-IR na retina do camundongo. PKCα serve como um marcador para todas as células bipolares de bastonetes (RBC) na retina18. No nível de microscopia eletrônica (EM), as hemácias podem ser identi...
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Discussão
Este artigo descreveu três etapas críticas para a observação bem-sucedida dos circuitos sinápticos e localização de proteínas: (1) fixação rápida e fraca, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.
Propomos que a fixação é o passo chave para uma abordagem imuno-EM pré-incorporação bem-sucedida. Assim, a importância do fixador fresco e da fixação rápida é enfatizada aqui, nomeando esse princípio de "princípio 4F", que é crucial na pre...
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Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103), da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 mL agulha de seringa | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldeído | Microscopia Eletrônica Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Science | 157-8 | |
| Ciência da Microscopia Eletrônica | Acetona | 10000 | |
| Anti-coelho PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Coelho SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Kit de substrato | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Tesoura de cotovelo | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Microscópio eletrônico | Resina Phillips | CM120 | |
| Epon | Microscopia Eletrônica Ciência | 14910 | |
| fórceps | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Papel de filtro Millipore | Merck Millipore | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Um componente do tampão fosfato |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Um componente do tampão fosfato |
| Ácido pícrico | Ciência da Microscopia Eletrônica | 19550 | |
| Borohidreto de sódio (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrótomo | Leica | ||
| Acetato de Uranilo | Ciência da Microscopia Eletrônica | 22400 | |
| Kit VACTASTAIN ABC, Peroxidase (IgG de Coelho) | Vector Laboratories | PK-4001 |
Referências
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
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Reimpressões e permissões
