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Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

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DOI:

10.3791/66562

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23 de fevereiro de 2024

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1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo usando hibridização in situ de fluorescência infravermelha óptica (OPTIR-FISH), também conhecida como FISH fototérmica de infravermelho médio (MIP-FISH), para identificar células individuais e entender seu metabolismo. Essa metodologia pode ser amplamente aplicada para diversas aplicações, incluindo o mapeamento do metabolismo celular com resolução de célula única.

Resumo

Compreender as atividades metabólicas de células individuais dentro de comunidades complexas é fundamental para desvendar seu papel na doença humana. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para identificação celular simultânea e análise metabólica com a plataforma OPTIR-FISH, combinando sondas FISH marcadas com rRNA e substratos marcados com isótopos. A imagem de fluorescência fornece a identificação celular pela ligação específica de sondas FISH marcadas com rRNA, enquanto a imagem OPTIR fornece atividades metabólicas dentro de células individuais por desvio para o vermelho induzido por isótopos nos espectros OPTIR. Usando bactérias cultivadas com 13C-glicose como banco de testes, o protocolo descreve a cultura microbiana com marcação isotópica, hibridização in situ fluorescente (FISH), preparação de amostras, otimização da configuração de imagem OPTIR-FISH e aquisição de dados. Também demonstramos como realizar análises de imagens e interpretar dados espectrais no nível de célula única com alto rendimento. A natureza padronizada e detalhada deste protocolo facilitará muito sua adoção por pesquisadores de diversas origens e disciplinas dentro da ampla comunidade de pesquisa de metabolismo de célula única.

Introdução

O metabolismo celular é um pilar fundamental na biologia celular, orientando muitos processos que determinam a saúde, a função e a interação das células com o meio ambiente. A análise do metabolismo no nível celular individual, particularmente nos ambientes nativos, fornece informações valiosas para revelar as atividades heterogêneas e complexas nos sistemas biológicos1. Isso é especialmente crucial no estudo de microrganismos, pois muitos micróbios exibem requisitos de crescimento exclusivos ou dependências ambientais que desafiam os métodos tradicionais de cultivo2. Por exemplo, algumas espécies podem exigir composições específicas de nutrientes ou relações simbióticas que não são facilmente replicadas em um ambiente de laboratório, tornando-as não cultiváveis por técnicas padrão3. Além disso, os longos períodos necessários para o cultivo de certas espécies representam desafios significativos para a pesquisa microbiológica, muitas vezes estendendo-se além dos prazos práticos para estudo e análise. Para contornar essas limitações, métodos alternativos, como a reação em cadeia da polimerase e a hibridização in situ fluorescente (FISH), permitem a identificação de espécies microbianas sem a necessidade de cultivo4, o que pode alcançar uma visão mais precisa e holística dos ecossistemas microbianos. No entanto, essas tecnologias analíticas carecem da capacidade de elucidar o metabolismo celular. Essa lacuna destaca os desafios contínuos no campo da microbiologia: a tarefa simultânea de diferenciar a identidade celular e elucidar o metabolismo no nível de uma única célula. Avanços em técnicas como espectrometria de massa de imagem (IMS) acoplada a isótopos estáveis surgiram como ferramentas poderosas para análise metabólica de célula única5. Nesses experimentos, as células foram incubadas com substratos contendo isótopos como 13C ou 15N. As biomoléculas recém-anabolizadas carregam esses isótopos, tornando-os distinguíveis nos espectros m / z. No entanto, o IMS sofre de instrumentação cara, preparação complicada de amostras, rendimento relativamente baixo e experiência necessária para analisar os espectros m / z. Quando combinado com imagens de fluorescência específicas de marcadores moleculares, avanços foram feitos na elucidação do metabolismo celular com maior especificidade6. No entanto, persistem desafios para unir essas duas modalidades. A diferença de resolução entre IMS e imagens de fluorescência, combinada com diferentes configurações operacionais, dificulta o alinhamento e a correlação dos achados7.

A integração da imagem espectroscópica vibracional com a marcação de isótopos estáveis oferece uma nova solução para o estudo do metabolismo de uma única célula. A incorporação de isótopos mais pesados retarda a vibração das ligações químicas, levando a picos de desvio para o vermelho nos espectros vibracionais8. Notavelmente, a imagem vibracional fornece uma resolução espacial comparável à imagem de fluorescência, e tanto a quantificação metabólica quanto a identificação celular podem ser realizadas em uma única configuração, simplificando o registro e a correlação da imagem. Nosso trabalho recente demonstrou a combinação de uma plataforma avançada de imagem vibracional: infravermelho fototérmico óptico (OPTIR) com hibridização in situ fluorescente (FISH) para sondar o metabolismo da glicose em comunidades bacterianas9 (Figura 1). O OPTIR é um sistema de microscopia espectroscópica vibracional que aproveita o efeito fototérmico da absorção do infravermelho médio, detectando a mudança da luz visível, que fornece resolução submicrométrica como na microscopia óptica, mas com as informações espectroscópicas vibracionais adicionais originadas da absorção do infravermelho médio. FISH é uma técnica comumente usada para determinar a identidade do microrganismo no nível de uma única célula. A sequência de oligonucleotídeos pode ser projetada para atingir sequências 16S específicas de diferentes táxons, e diferentes fluoróforos podem ser anexados. A hibridização específica das sondas de oligonucleotídeos projetadas com o rRNA alvo leva a fortes sinais de fluorescência de espécies-alvo dentro de células individuais, e imagens de fluorescência multicanal podem ser realizadas para identificar várias espécies dentro da população. Como as imagens OPTIR e de fluorescência são baseadas na detecção óptica, a combinação de fluorescência OPTIR e FISH é simples de implementar. As duas modalidades compartilham a mesma resolução óptica para análise de célula única e podem ser alternadas convenientemente sem a necessidade de alinhamento adicional ou co-registro.

Este protocolo apresenta um guia detalhado para aproveitar a plataforma OPTIR-FISH para análise avançada de função de estrutura de célula única. Usamos as amostras bacterianas cultivadas em 13meios contendo C-glicose como banco de testes e quantificamos a síntese proteica de novo a partir de 13C-glicose. Para demonstrar a capacidade da plataforma de identificar células, usamos misturas bacterianas nas quais cada espécie foi marcada usando sondas FISH direcionadas a rRNA. Essa abordagem facilitou a identificação precisa de uma única célula de cepas bacterianas específicas, como Escherichia coli (E. coli) e Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), e seu metabolismo. Este protocolo oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para perfis metabólicos simultâneos e identificação de espécies no nível de uma única célula, prometendo avançar nossa compreensão das interações celulares, fisiologia e seus papéis em ambientes complexos.

Protocolo

O uso de amostras bacterianas neste estudo está de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston e do Instituto Nacional de Saúde.

NOTA: O fluxo de trabalho geral seguido neste protocolo está resumido na Figura 2.

1. Cultura bacteriana e marcação de isótopos (Figura 2A)

NOTA: O exemplo dado aqui é para rotular uma cultura bacteriana pura. Se aplicar este protocolo a comunidades polimicrobianas, o meio e o tempo de marcação devem ser ajustados de acordo com a comunidade e a fisiologia dos organismos de interesse.

  1. Inocule a cepa bacteriana de interesse de uma única colônia e pré-cultura em um meio rico em nutrientes, como caldo de soja tríptico (TSB) ou caldo Luria-Bertani (LB) por 3 h para atingir a fase de crescimento exponencial (log). E. coli BW25113 é usado como uma cepa de exemplo neste protocolo.
    NOTA: O tempo para atingir a fase logarítmica varia de acordo com a tensão em uso. Este tempo precisa ser adaptado para cada cepa.
  2. Meça a densidade óptica a 600 nm para estimar a concentração bacteriana.
  3. Prepare um meio de crescimento mínimo suplementado com substratos marcados isotopicamente. Para E. coli BW25113, suplementar o meio mínimo M9 com 13C-glicose a uma concentração final de 0,2% (p/v).
    NOTA: A 13C-glicose usada (D-glicose U-13C6, 99%) foi universalmente marcada, onde todos os átomos de carbono foram substituídos por 13átomos de C. A escolha do meio de crescimento mínimo dependerá da cepa bacteriana. A escolha do substrato isotópico dependerá do processo metabólico específico de interesse. O objetivo geral é que o substrato isotópico sirva como a principal fonte de nutrição em comparação com suas contrapartes não rotuladas.
  4. Diluir as bactérias no meio de crescimento mínimo que contém o substrato marcado isotopicamente até uma concentração final de 5 ×10 5 UFC/ml.
    NOTA: Normalmente, uma alta taxa de diluição como 1:100 é usada, e a nutrição não rotulada do meio rico torna-se insignificante. Alternativamente, para garantir a remoção completa do meio rico em nutrientes, uma lavagem com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pode ser realizada por centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspensão em PBS seguida por uma segunda centrifugação e ressuspensão final no meio de crescimento mínimo.
  5. Cultive amostras bacterianas em uma incubadora de agitação orbital sob condições ideais de crescimento. Em geral, ajuste a incubadora de agitação orbital para uma velocidade de 220 rpm e uma temperatura de 37 ° C e coloque os tubos de cultura inclinados com uma tampa solta para incubação aeróbica. Para E. coli, 24 h de incubação aeróbica a 37 °C geralmente são suficientes para atingir a rotulagem máxima de 13C.
    NOTA: O tempo de incubação depende do processo metabólico de interesse. Um tempo de incubação mais longo geralmente leva a uma maior marcação isotópica. Uma medição da curva de crescimento sob a mesma condição com um substrato não rotulado pode fornecer informações sobre como determinar os pontos de tempo de coleta apropriados.
  6. Colete células bacterianas nos pontos de tempo desejados por centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C.
  7. Remova o sobrenadante e ressuspenda em um volume igual de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS. Fixar as células em solução de PFA durante 10 min à temperatura ambiente (RT) ou 2 h a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, lave as células duas vezes com PBS, ressuspenda as células em 1 mL de 50% (v / v) de PBS e etanol a 96% e armazene a -20 ° C até uso posterior.

2. Hibridização in situ fluorescente (FISH) (Figura 2B)

  1. Hibridizar células de E. coli com a sonda de oligonucleotídeo Gam42a10 marcada com um fluoróforo de cianina5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) e células de B. theta com a sonda de oligonucleotídeo Bac30311 marcada com um fluoróforo de cianina3 (Cy3) (Bac303-Cy3), seguindo um protocolo FISH padrão.
    NOTA: Fundamentos do rRNA-FISH para identificação: As moléculas de rRNA são alvos ideais do FISH, pois são distribuídas de forma ubíqua e naturalmente amplificadas dentro das células microbianas. O rRNA também contém regiões de sequência conservadas e variáveis, de modo que a profundidade filogenética do grupo-alvo pode ser determinada pelo grau de conservação da sonda de oligonucleotídeos. Por ligação específica da sonda projetada à sequência alvo, o fluoróforo marcado mostra sinais fluorescentes para células individuais.
  2. Consulte a literatura publicada anteriormente 12,13,14 para o protocolo detalhado de hibridização in situ de fluorescência. As etapas abaixo descrevem brevemente o protocolo padrão para células microbianas.
    1. Desidratação:
      1. Centrifugue as células fixas (100 μL) a 14.000 x g por 10 min para granular, ressuspenda em 100 μL de etanol de grau analítico a 96% e incube por 1 min em RT.
      2. Em seguida, centrifugue as células novamente a 14.000 x g por 5 min, remova o etanol e deixe o pellet da célula secar ao ar.
    2. Hibridização: Hibridizar as células em solução (100 μL) por 3 h a 46 °C.
      NOTA: O tampão de hibridização consiste em 900 mM de NaCl, 20 mM de Tris-(hidroximetil)-amino metano HCl, 1 mM de ácido etilenodiamina tetracético, 0,01% de dodecilsulfato de sódio, 100 ng do respectivo oligonucleotídeo marcado com fluorescência e concentração de formamida necessária para obter condições rigorosas.
    3. Centrífuga: Imediatamente após a hibridização, transfira as amostras para uma centrífuga com rotor pré-aquecido a 46 °C e centrifugue a 14.000 x g por 15 min na temperatura máxima permitida (geralmente 40 °C).
    4. Lave e armazene:
      1. Lavar as amostras num tampão de rigor adequado durante 15 min a 48 °C. Em seguida, centrifugue as células a 14.000 x g por 15 min à temperatura máxima permitida em uma centrífuga com rotor pré-aquecido a 46 °C.
      2. Finalmente, lave as células com 500 μL de PBS gelado, ressuspenda-as em 20 μL de PBS 1x e armazene-as a 4 ° C até o uso posterior.
        NOTA: A ligação específica da sonda é garantida pelo rigor de hibridização correto. O alto rigor pode ser alcançado aumentando a temperatura de hibridização, diminuindo a concentração de sal ou adicionando formamida desnaturante. A formamida interfere nas ligações de hidrogênio que estabilizam os duplex de ácidos nucleicos. Aqui, a temperatura e a concentração de sal não são modificadas na hibridização durante o ajuste da concentração de formamida. A concentração ideal de formamida para sondas recém-projetadas é determinada experimentalmente usando curvas de dissociação de formamida10. A concentração de formamida necessária para sondas publicadas pode ser encontrada em probeBase15 ou por uma pesquisa bibliográfica. Alternativamente, as concentrações previstas de formamida podem ser obtidas a partir de análises in-silico usando mathFISH16. Na etapa de lavagem, uma temperatura ligeiramente mais alta leva a uma condição um pouco mais rigorosa, o que leva a uma maior especificidade de ligação.

3. Preparo da amostra (Figura 2C)

  1. Limpeza e revestimento da lâmina:
    1. Use lâminas CaF2 padronizadas (10 mm de diâmetro e 350 μm de espessura para compatibilidade com o porta-amostras do instrumento). Mergulhe o CaF2 em etanol a 70% por 15 min e enxágue duas vezes com água DI.
    2. Transfira as lâminas limpas para uma solução de poli-L-lisina a 0,1% e incube durante a noite a 4 °C. Enxágue as lâminas uma vez com água DI e seque ao ar.
  2. Descongele as amostras de células preparadas em RT enquanto protegidas da luz.
  3. Para evitar cristais de sal excessivos do PBS durante a secagem da amostra, siga as etapas 3.3.1-3.3.2.
    1. Lave as células duas vezes com água deionizada (DI). Centrifugue a 14.000 x g por 10 min e remova o sobrenadante.
    2. Adicione de volta o volume original de água DI e vortex suavemente. Repita a centrifugação e adicione a lavagem com água DI novamente.
  4. (Opcional) Para amostras de mistura, transfira o mesmo volume de cada amostra e misture em um tubo de centrífuga.
  5. Concentre as amostras de células bacterianas por centrifugação a 14.000 x g por 10 min e remova o sobrenadante.
  6. Vortex suavemente a solução restante por ~ 30 s e adicione 1-2 μL de solução na lâmina CaF2 preparada. Seque a amostra ao ar por 30 min enquanto protegida da luz.
    NOTA: Um pequeno ponto redondo deve aparecer na lâmina após a secagem ao ar. Devido ao efeito "anel de café", as bordas do ponto teriam uma densidade maior de células bacterianas. Esta etapa de centrífuga é para atingir uma densidade apropriada para imagens bacterianas eficientes de célula única. A concentração ideal deve levar a uma camada uniforme e densa de células bacterianas individuais sob o microscópio. Se houver um pellet transparente que possa ser visto a olho nu após a centrifugação, remova o sobrenadante para que, após o vórtice, a solução pareça quase límpida. Um teste rápido pode ser realizado na amostra de controle para estimar o volume de remoção do sobrenadante. Uma série de gotículas com diferentes quantidades de sobrenadante restante pode ser depositada na lâmina de vidro do microscópio para examinar o volume ideal de diluição sob o microscópio de campo claro. Se não houver pellets visíveis após a centrifugação, remova a maior parte do sobrenadante para concentrar as amostras ao máximo. O truque é posicionar o tubo da centrífuga com a dobradiça do lado de fora em um rotor de ângulo fixo para que o pellet apareça no mesmo lado da dobradiça do tubo. Além disso, reduza os tamanhos das pipetas (P1000, P200, P10) para aumentar a precisão durante a remoção do sobrenadante para manter o pellet intacto.
  7. Monte a lâmina em um sample suporte fornecido e use pequenos pontos de fita de poliéster para prender a lâmina durante a medição.

4. Imagem OPTIR-FISH

NOTA: A imagem de fluorescência e a imagem OPTIR serão realizadas no sistema OPTIR.

  1. Geometria do sistema:
    1. Use contrapropagação de bomba de infravermelho médio e sonda visível, detecção reversa (epi) de luz visível com este protocolo.
    2. Para focar a luz visível e coletar a luz visível refletida e dispersa, use uma objetiva de ar (50x 0.8NA). Para focar a luz infravermelha média, use uma objetiva Cassegrain (40x 0.78NA).
    3. Certifique-se de que o sistema também esteja equipado com um módulo de epifluorescência de campo amplo com vários conjuntos de filtros de fluorescência. Para os fluoróforos usados neste protocolo, selecione o conjunto de filtros de proteína fluorescente verde (GFP) para detecção de Cy3 e o conjunto de filtros Alexa Fluor 647 para detecção de Cy5.
  2. Prepare-se para as medições:
    1. Ligue o sistema e abra o software de controle do instrumento. Após a inicialização, alterne o controle deslizante Contraprop e Fluorescência para a posição ligado.
    2. Defina o objetivo como 50x e, em seguida, execute o plano de fundo automático para adquirir o espectro de potência de infravermelho. Use o espectro de potência para normalizar os espectros de amostra adquiridos ou normalizar as imagens OPTIR em diferentes números de onda. Isso excluirá o efeito das diferenças de potência do laser infravermelho médio na análise e quantificação de dados.
      NOTA: A aquisição de espectros de potência IR para normalização é imperativa para a análise quantitativa downstream, pois a intensidade medida está linearmente relacionada à potência IR. Depois de executar o plano de fundo automático, o software normalizará os espectros OPTIR e as imagens OPTIR para os espectros de potência IR automaticamente para os usuários. A purga do sistema com N2 pode minimizar a influência do vapor d'água e aumentar a reprodutibilidade entre os experimentos.
  3. Para carregar a amostra, use o botão Descarregar para mover o estágio de amostra para fora. Use uma objetiva de baixa ampliação, como 10x, para localizar a área de amostra e navegar até a região que tem a densidade de amostra ideal. Focalize a amostra ajustando a altura da objetiva no software de controle. Altere a seleção do objetivo para 50x.
  4. Aquisição de imagem
    NOTA: As amostras utilizadas são: i) E. coli (13C-glicose incubada); ii) E. coli (12C-glicose incubada); iii) B. theta (12C-glicose incubada); iv) mistura de E. coli (13C-glicose incubada) e B. theta (12C-glicose incubada).
    1. Imagens de campo claro (Figura 2D): Traga a amostra em foco observando as imagens de campo claro.
    2. Imagens de fluorescência (Figura 2E): Altere o conjunto de filtros clicando no botão de nome do filtro (GFP para Cy3 e Alexa Fluor 647 para Cy5) para detectar fluoróforos associados às sondas FISH projetadas e adquirir imagens de fluorescência sequencialmente usando o módulo de fluorescência no software. Ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para obter contraste de sinal adequado antes de branquear os fluoróforos.
      NOTA: Como a sonda usada nas medições OPTIR pode fotobranquear fluoróforos, sempre adquira imagens de fluorescência antes das imagens OPTIR. Para se preocupar com o efeito dos marcadores fluorescentes na detecção de OPTIR, consulte um trabalho publicado anteriormente que demonstrou que o FISH com fluoróforo Cy5 não afeta a seguinte quantificação com base em imagens OPTIR, pois Cy5 é pequeno em tamanho e baixo em abundância em comparação com a proteína bacteriana alvo9.
    3. Imagens OPTIR (Figura 2F):
      1. Determine o pico normal e a posição do pico desviado para o vermelho induzido por isótopos. No caso da síntese de proteínas a partir da 13C-glicose, o pico normal da amida I é detectado em torno de 1656 cm-1, e o pico desviado para o vermelho é em torno de 1612 cm-1 (Figura 3A).
        NOTA: A posição normal do pico depende do componente bioquímico e/ou produto metabólico de interesse. A posição de pico deslocada também depende de qual isótopo é usado para rotulagem. Esses dois números de onda também podem ser determinados experimentalmente medindo os espectros completos de células não marcadas e marcadas ao máximo (consulte a etapa 4.5)
      2. Ajuste o comprimento de onda da bomba IR para 1656 cm-1 usando o software. Modifique a potência da sonda e o ganho do detector de acordo para evitar a saturação do sinal CC (8 V). Ajuste a altura da objetiva inferior do Cassegrain para maximizar o sinal CA.
        NOTA: A potência IR típica na amostra é de cerca de 5 mW e a potência da sonda na amostra é de cerca de 3-15 mW, dependendo da amostra. Tanto o IR quanto a potência da sonda podem ser ajustados usando o software de controle para otimizar o nível de potência para garantir alto contraste de imagem, evitando danos às células.
      3. Defina as imagens OPTIR para conter 200 x 200 pixels e defina a taxa de varredura para 100 μm/s. Defina o tamanho do passo nas direções X e Y para 150 nm, de modo que o tamanho da imagem seja de cerca de 30 x 30 μm2.
      4. Adquira a imagem.
      5. Ajuste o comprimento de onda da bomba IR para 1612 cm-1 e adquira uma imagem do mesmo campo de view neste número de onda.
      6. Para cada amostra, imagem de pelo menos três campos de visão para análise estatística.
  5. (Opcional) Medição espectral: Após a aquisição da imagem, se uma característica espacial de interesse for localizada, execute a medição espectral.
    1. Selecionar locais: Escolha um único ponto ou especifique uma matriz de pontos para análise no módulo Espectral do software.
    2. Defina o parâmetro de varredura espectral. Selecione a faixa de cobertura do número de onda, a velocidade de varredura e o espaçamento de saída de dados com base nos requisitos.
      NOTA: se a velocidade de varredura e o espaçamento de saída de dados forem diferentes em comparação com os usados na etapa de aquisição em segundo plano (etapa 4.2), um novo plano de fundo com base nos parâmetros de varredura espectral atuais é necessário para a normalização correta.
    3. Defina o número de co-média e inicie a medição espectral. O aumento da co-média também aumenta a relação sinal-ruído dos espectros, mas requer tempos de aquisição mais longos.
      NOTA: Se for observada uma flutuação significativa durante a co-média, isso pode indicar instabilidade da amostra induzida pelo aquecimento do laser. Isso geralmente pode ser resolvido diminuindo a potência de infravermelho e/ou diminuindo a potência visível da sonda.

5. Processamento e análise de dados no nível de célula única

  1. Quantificar a síntese metabólica a partir de substratos isotópicos (Figura 2G)
    NOTA: A seguinte quantificação da incorporação metabólica de substratos isotópicos é baseada em imagens OPTIR de dois números de onda correspondentes aos picos normais e deslocados das macromoléculas alvo. Em comparação com uma pilha hiperespectral completa, a imagem de dois números de onda pode reduzir muito o tempo necessário para cada FOV e melhorar o rendimento, ao mesmo tempo em que recaptura totalmente o efeito isotópico crítico para a quantificação do metabolismo.
    1. Subtrair a imagem OPTIR de pico deslocada da imagem OPTIR de pico normal gera um mapa visual das atividades de síntese de substratos isotópicos. Como demonstração (Figura 3C), para E. coli cultivada com 13C-glicose, os pixels positivos na imagem (1656 cm-1-1612 cm-1) indicam incorporação ativa de 13C em proteínas, portanto, um maior nível de síntese proteica.
      NOTA: A subtração pode ser realizada usando a função ImageJ Image Calculator. Alternativamente, a subtração pode ser facilmente realizada em qualquer linguagem de programação preferida para processamento em lote.
    2. Quantificação da atividade metabólica de uma única célula
      1. Obtenha coeficientes (representados por h na Figura 2G) de amostras de referência não rotuladas e totalmente rotuladas. Como o pico desviado para o vermelho induzido por isótopos se sobrepõe parcialmente ao pico normal, tanto as amostras não marcadas quanto as marcadas (recém-sintetizadas a partir do substrato marcado isotopicamente) contribuirão para os sinais OPTIR no pico normal e deslocado. Quantifique essas diferentes contribuições usando a intensidade do sinal OPTIR normalizado no pico normal e deslocado de amostras de referência não rotuladas e totalmente marcadas.
        NOTA: Para amostras de referência, amostras de referência não rotuladas são cultivadas (ou incubadas) sem qualquer substrato rotulado isotopicamente. As amostras de referência totalmente marcadas são geralmente cultivadas com a maior concentração de substrato marcado isotopicamente com o maior tempo de cultivo.
      2. Para análise de célula única, obtenha máscaras de célula única com base nas imagens de campo claro.
        NOTA: Várias técnicas de processamento de imagem podem ser aplicadas aqui para gerar essa máscara, incluindo diferentes detecções de partículas, como análise de bolhas, e métodos de segmentação de células, como bacias hidrográficas.
      3. Meça a intensidade do sinal OPTIR a partir de células individuais. Aplique a máscara de célula única adquirida às duas imagens OPTIR (no pico normal e no pico deslocado) e, para cada célula única, calcule a média dos valores de pixel na região da máscara de célula única. O valor médio de células individuais será usado na quantificação.
      4. Para cada célula, calcule a contribuição relativa de biocomponentes não rotulados e rotulados com base nos coeficientes da etapa 5.1.2.1 e nos sinais da etapa 5.1.2.3.
        NOTA: Uma taxa de substituição isotópica é definida como a contribuição relativa dos biocomponentes rotulados sobre a soma dos biocomponentes rotulados e não rotulados (Figura 2G). Essa proporção deve estar na faixa de 0 a 1. A razão de reposição isotópica é linearmente proporcional à razão de 13C-glicose para 12C-glicose (com uma quantidade fixa de glicose total)9. Uma alta sensibilidade de detecção de 5% de 13C-glicose foi demonstrada para células de E. coli .
  2. Identifique espécies bacterianas a partir de imagens de fluorescência multicanal (Figura 2H)
    1. Mescle os canais de fluorescência multicoloridos para criar orientação visual para diferentes espécies bacterianas usando ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. Para análise de célula única, para cada canal de fluorescência, gere um conjunto de regiões de interesse (ROIs) para células individuais.
      NOTA: Várias técnicas de processamento de imagem podem ser aplicadas aqui para gerar a máscara, incluindo diferentes métodos de limite automático e métodos de segmentação de células.
  3. Correlacionar identidades FISH e atividades metabólicas OPTIR (Figura 2I)
    1. Vincule as identidades bacterianas de nível de célula única das imagens de fluorescência FISH diretamente às atividades metabólicas das imagens OPTIR, correlacionando as posições das ROIs.
    2. Realize análises estatísticas para comparar as atividades metabólicas de diferentes espécies.
      NOTA: As máscaras são geradas separadamente das imagens de fluorescência e das imagens OPTIR porque as atividades metabólicas podem ser analisadas para todas as células das imagens OPTIR, enquanto as células desconhecidas não aparecem em nenhum dos canais de fluorescência. Isso garante que todas as células possam ser incluídas na análise metabólica. Se houver um grande número de células não identificadas, diferentes sondas FISH direcionadas ao rRNA de diferentes táxons de interesse podem precisar ser consideradas.

Resultados

O fluxo de trabalho geral para análise metabólica microbiana de célula única com identificação genética por OPTIR-FISH é resumido em Figura 2. Os resultados representativos que demonstram a capacidade de imagem metabólica de célula única do OPTIR são mostrados em Figura 3. Este exemplo usou células de E. coli incubadas com 12C- ou 13C-glicose por 24 h. A incorporação de 13C em proteínas demonstrou causar um desvio significativo para o vermelho das amidas proteicas I e II (Figura 3A)17,18. Portanto, esses dois números de onda principais que representam o 12Proteína C (1656 cm-1, banda normal de amida I) e 13Proteína C (1612 cm-1, banda de amida I deslocada) foram selecionadas e as imagens OPTIR nesses dois números de onda foram adquiridas. As imagens de campo claro correspondentes também são mostradas para demonstrar a morfologia das células (Figura 3B,E). As bactérias em forma de bastonete podem ser claramente resolvidas no nível de uma única célula em imagens de campo claro e OPTIR, confirmando a alta resolução espacial da técnica OPTIR (Figura 3B-G). Para células incubadas com 12C-glicose (Figura 3B-D), uma intensidade mais alta em 1656 cm-1 foi observado, enquanto um maior 1612 cm-1 intensidade foi observada para as células incubadas com 13C-glicose (Figura 3E-G). Essa mudança de pico indica a incorporação de isótopos de carbono mais pesados na massa proteica17. A avaliação foi estendida para avaliar a capacidade do OPTIR-FISH em discriminar táxons bacterianos e suas atividades metabólicas em amostras multiespécies. Misturamos artificialmente duas espécies bacterianas que são predominantes no microbioma intestinal humano: E. coli e B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli células incubadas com 13A C-glicose foi hibridizada com uma sonda Gam42a-Cy5, visando o rRNA 23S de Gammaproteobacteria10. B. theta células incubadas com 12A C-glicose foi hibridizada com a sonda Bac303-Cy3, visando o rRNA 16S da maioria das espécies de Bacteroidaceae11. É muito difícil diferenciar as duas espécies com base nas imagens de campo claro, uma vez que ambas são em forma de bastonete (Figura 4A). Assim, a imagem de fluorescência multicolorida de sondas hibridizadas foi essencial para atribuir uma identidade taxonômica a cada célula bacteriana analisada (Figura 4B). Ao subtrair imagens OPTIR adquiridas em 1612 cm-1 de 1656 cm-1, notamos que um segmento de células nesta amostra bi-espécie apresentou valores de subtração positivos (Figura 4C), indicando a incorporação de 13Isótopos C. Com base nas condições de cultivo, atribuímos as células com valor de subtração positivo a serem E. colie o valor de subtração negativo a ser B. theta. A atribuição de espécies bacterianas é confirmada pelos resultados da imagem de fluorescência: as células que produzem valores de subtração positivos produzem contraste Cy5, que é específico para E. coli, e as células que produzem valores de subtração negativos produzem B. theta-contrastes específicos do Cy3. Em seguida, foi calculada a razão de substituição isotópica, neste caso, recém-sintetizada 13Proteína C de 13C-glicose (Figura 4D). Como esperado, uma diferença significativa na taxa de substituição isotópica entre as duas espécies bacterianas (teste t pareado, p = 9,74 x 10-33) foi observado. Este conjunto de dados ressalta a viabilidade de aplicar a plataforma OPTIR-FISH para estudar o metabolismo em um ambiente complexo onde várias espécies de amostras estão presentes.

Análise microbiana; hibridização de fluorescência, marcação isotópica, imagem OPTIR, fenótipo de genótipo.
Figura 1: Esquema para a plataforma OPTIR-FISH para identificação simultânea de espécies e análise do metabolismo. Diferentes membros da comunidade microbiana podem ser identificados pela ligação específica das sondas de RNA ribossômico microbiano por meio de hibridização in situ de fluorescência e detectados por imagens de fluorescência dos fluoróforos anexados. A atividade metabólica pode ser analisada por cultura com substratos isotópicos e detectada por imagens OPTIR. A imagem OPTIR detecta a mudança de espalhamento induzida pela absorção de IR, e o OPTIR é inerentemente compatível com ferramentas fluorescentes amplamente utilizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama do processo de marcação isotópica: FISH microbiano, análise OPTIR, determinação de identidade, proporções.
Figura 2: Fluxo de trabalho geral para análise de célula única da atividade metabólica com identificação genética por OPTIR-FISH. (A) As células bacterianas foram cultivadas com substratos marcados isotopicamente. (B) A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi então realizada. (C) Preparação da amostra em lâmina transparente IR. (D) Imagens de campo claro identificam as regiões com densidade celular ideal. (E, H) A imagem de fluorescência multicolorida de diferentes fluoróforos FISH revela a identidade genética de células individuais conforme especificado por sondas FISH ou permanece desconhecida. (F, G) A imagem OPTIR multiespectral subsequente no pico normal e deslocado revela a incorporação isotópica na biomassa microbiana. Referenciando os espectros OPTIR para amostras não rotuladas e totalmente marcadas (coeficiente h), a contribuição relativa dos biocomponentes regulares (cr) e isotópicos (ci) pode ser quantificada. A síntese de proteínas a partir de substratos metabolizados marcados isotopicamente foi quantificada usando a "taxa de substituição isotópica". (I) Por OPTIR-FISH, uma análise de alto rendimento da atividade metabólica de espécies microbianas em uma população complexa pode ser obtida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Espectroscopia de E. coli usando 12C/13C-glicose; Espectros OPTRIR; imagens de campo claro e OPTIR.
Figura 3: Espectros OPTIR representativos e resultados de imagem. (A) Espectros OPTIR para células de E. coli cultivadas com 12C-glicose (ciano) e 13C-glicose (laranja) cobrindo a região da amida I e amida II. Um pico claro de amida I com desvio para o vermelho (1656 cm-1 a 1612 cm-1) é observado para 13células cultivadas com C-glicose. Imagens representativas de campo claro e OPTIR de células de E. coli em amida I normal e banda de amida I deslocada sob condições de cultura de (BD) 12C-glicose e (EG) 13C-glicose. Barras de escala: 10 μm. Essa figura foi modificada com permissão de Bai et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de campo claro e microscopia FISH com subtração OPTIR, gráfico de quantificação de E. coli e B. theta.
Figura 4: Imagens representativas e resultados de quantificação de misturas bacterianas. As células de E. coli foram incubadas com 13C-glicose, seguida de hibridização com a sonda de oligonucleotídeos Gam42a-Cy5. As células B. theta foram incubadas com 12C-glicose, seguida de hibridização com a sonda de oligonucleotídeos Bac303-Cy3. (A) A imagem de campo claro mostra a morfologia da mistura celular. (B) A imagem de fluorescência em duas cores mostra a distribuição de E. coli (vermelho) e B. theta (verde). (C) O resultado da subtração OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) mostra o metabolismo proteico das células bacterianas. (D) Quantificação da taxa de substituição isotópica representando a proteína 13C recém-sintetizada a partir da glicose 13C. (Teste t pareado: p = 9,74 x 10-33). Barras de escala: 10 μm. Essa figura foi modificada com permissão de Bai et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para aplicação da plataforma OPTIR-FISH para identificação simultânea de espécies microbianas e quantificação de atividades metabólicas na resolução de célula única. As etapas críticas incluem cultura com marcação de isótopos estáveis para estudar atividades metabólicas específicas e hibridização in situ fluorescente para identificar espécies microbianas alvo. A imagem de fluorescência multicanal e a imagem OPTIR em números de onda selecionados podem ser realizadas sequencialmente no mesmo microscópio. Mostramos como analisar quantitativamente essas imagens para revelar os níveis de atividade metabólica de diferentes espécies dentro da comunidade complexa. O protocolo pode ser especialmente atraente para o estudo metabólico de diversas espécies dentro da comunidade complexa em seu ambiente nativo.

Usamos bactérias como exemplo aqui, mas esse protocolo pode ser adaptado para outros organismos, como fungos e células de mamíferos. Um ponto-chave é adicionar as sondas vibracionais do processo metabólico alvo no meio de cultura livre da contraparte normal. Por exemplo, se estudar o metabolismo lipídico de ácidos graxos, os ácidos graxos marcados com azido devem ser suplementados ao seu meio de cultura padrão composto de soro bovino fetal (FBS) deslipídico, pois os ácidos graxos vêm originalmente do FBS. Além disso, o tempo de incubação também precisa corresponder à taxa de crescimento de diferentes fungos ou células de mamíferos. Isso garante o crescimento normal das células enquanto maximiza a eficiência de marcação das sondas vibracionais nas macromoléculas alvo.

O protocolo descrito aqui também pode ser adaptado para estudar outros processos metabólicos além da síntese de proteínas a partir da glicose. Todas as principais biomoléculas, incluindo proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e carboidratos, podem ser visualizadas pelo OPTIR19,20. Além disso, há uma vasta seleção de estratégias de rotulagem, incluindo marcação isotópica, como 13C, 15N, 18O e 2H, e a adição de etiquetas vibracionais, como C≡C e C≡N, a pequenas moléculas21. Devido aos pequenos tamanhos de rótulo e alta biocompatibilidade, é um método preferido para estudo do metabolismo em comparação com análogos de fluorescência. Para estudar outros processos metabólicos usando diferentes sondas vibracionais, este protocolo pode ser modificado, incluindo as etapas de cultura celular e marcação metabólica, bem como a seleção do número de onda com base em diferentes sondas e produtos metabólicos, que podem ser encontrados nas referências correspondentes 21,22,23. Alguns dos exemplos incluem o mapeamento de lipídios recém-sintetizados a partir do ácido azida-palmítico em sistemas de cultura bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) derivados de humanos24, imagens de proteínas recém-sintetizadas a partir de azidohomoalanina em células de macrófagos23, imagens do metabolismo da glicose com deutério-glicose em células PC325 e análise da incorporação de deutério de água pesada como um marcador de atividade no microbioma intestinal humano26.

Uma limitação potencial do protocolo é o limite de detecção de 13C em comunidades complexas. Mostramos que, para a cultura pura usada aqui, o limite de detecção é de 5% de 13C no carbono total9. Também demonstramos que, misturando 13células de E. coli marcadas com C com amostras de microbioma intestinal complexo humano não marcado, podemos diferenciar com segurança a E. coli com base em perfis metabólicos, apesar da potencial variação espectral associada a diferentes composições químicas celulares originárias de várias espécies de microbioma intestinal não rotuladas9. No entanto, comunidades microbianas complexas, influenciadas pelas fisiologias únicas das espécies microbianas presentes, podem exibir taxas de assimilação de 13C inconsistentes. Nesses casos, vale a pena testar ainda mais a capacidade de diferenciação metabólica de 13células marcadas com C e 12marcadas com C de OPTIR-FISH no contexto de uma comunidade complexa. O desempenho da plataforma pode ser melhorado ainda mais. Por exemplo, combinando a configuração OPTIR de campo amplo, a velocidade de imagem pode ser significativamente aumentada27. Métodos avançados de redução de ruído baseados em aprendizado de máquina podem ser incorporados à plataforma para aumentar ainda mais a velocidade de imagem28,29. Para melhor visualizar a distribuição detalhada de metabólitos em células microbianas, as tecnologias de super-resolução recentemente desenvolvidaspodem ser adotadas 30,31.

As etapas críticas para este protocolo incluem a otimização da eficiência da marcação de FISH para micróbios-alvo, o que pode ser alcançado pelo projeto racional da sonda de oligonucleotídeos, otimização da concentração de formamida e controle cuidadoso do ambiente de hibridização. A preparação de amostras em uma densidade de célula única apropriada para análise de alto rendimento é importante para o alto rendimento na prática. Também é fundamental otimizar o sistema para obter sinal adequado para quantificação. Isso é feito automaticamente no software de controle do instrumento durante a etapa de fundo automático. Se houver um desvio na preparação da amostra, como usar um tipo diferente de lâmina em vez da lâmina CaF2 padrão, a otimização manual pode ser realizada no software. Durante a etapa de otimização manual, a sobreposição entre o infravermelho médio e a luz visível é otimizada pela varredura de uma matriz de posições do infravermelho médio. Os principais desafios incluem a escolha dos substratos vibracionais mais adequados e os números de onda OPTIR correspondentes para quantificar as atividades metabólicas de interesse.

Em conclusão, este estudo demonstra como a atividade metabólica e a identificação microbiana podem ser alcançadas simultaneamente no nível de célula única pela plataforma OPTIR-FISH. Acreditamos que este protocolo detalhado fornecerá orientações úteis para promover a adoção generalizada desta nova plataforma de imagem vibracional com alta compatibilidade com ferramentas de fluorescência amplamente utilizadas, permitindo aplicações em diversos campos das ciências da vida e da medicina e abrindo oportunidades para novas descobertas.

Divulgações

Y.B. é consultor em tempo parcial da Photothermal Spectroscopy Corp.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde R35GM136223, R01AI141439 a J.X.C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
96%Etanol ThermoScientificT032021000
Fluoreto de CálcioCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-AldrichE9884-100G
formamidaThermoScientific17899
Luria-Bertani caldo Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Sais Mínimos 5xSIGMAM6030-1KG
Instrumento OPTIREspectroscopia Fototérmica Corp.mIRage
, 4% em PBSSolução deJ19943-K2
0,1% (p/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Cloreto de SódioSigma-AldrichS9888-25G
Dodecil sulfato de sódioSigma-AldrichL3771-25G
Cloridrato de Tris(hidroximetil)aminometano, 99+%ThermoScientificA11379.18
Caldo de soja TrypicSigma-Aldrich22092-500G
Solução de Paraforaldeído LS poli-L-lisina da ThermoScientific

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