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Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

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DOI:

10.3791/66566

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19 de abril de 2024

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Resumo

As complicações após o transplante pulmonar estão amplamente relacionadas à resposta do sistema imunológico do hospedeiro ao enxerto. Essas respostas imunes são reguladas por interferência entre células doadoras e receptoras. Uma melhor compreensão desses processos depende do uso de modelos animais pré-clínicos e é auxiliada pela capacidade de estudar o tráfego de células imunes intra-enxerto em tempo real. A microscopia intravital de dois fótons pode ser usada para obter imagens de tecidos e órgãos para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotodano mínimo, o que oferece uma grande vantagem sobre a microscopia confocal de fóton único. O uso seletivo de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente específica do promotor e/ou transferência adotiva de células marcadas com corante fluorescente durante a microscopia intravital de dois fótons permite o estudo dinâmico de células únicas em seu ambiente fisiológico. Nosso grupo desenvolveu uma técnica para estabilizar pulmões de camundongos, o que nos permitiu obter imagens da dinâmica celular em pulmões virgens e enxertos pulmonares transplantados ortotopicamente. Essa técnica permite uma avaliação detalhada do comportamento celular dentro da vasculatura e no interstício, bem como o exame das interações entre várias populações celulares. Este procedimento pode ser prontamente aprendido e adaptado para estudar os mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias e tolerogênicas após o transplante pulmonar. Também pode ser expandido para o estudo de outras condições pulmonares patogênicas.

Introdução

O transplante de pulmão é a opção final para muitos pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal; no entanto, a sobrevida em longo prazo após o transplante de pulmão é baixa em comparação com outros transplantes de órgãos sólidos. A sobrevida em 5 anos é de apenas ~ 60% -70% 1, em comparação com 80% -90% nos corações2 e 85% -90% nos rins3. Muitas complicações após o transplante pulmonar, como disfunção primária do enxerto, rejeição mediada por anticorpos e disfunção crônica do aloenxerto pulmonar, são devidas à resposta imune do hospedeiro ao aloenxerto. Por exemplo, nosso grupo mostrou que os neutrófilos são rapidamente recrutados para o aloenxerto pulmonar após lesão de isquemia-reperfusão induzida por transplante e formam agrupamentos dinâmicos em torno dos monócitos sanguíneos4. A diafonia entre células doadoras e receptoras é responsável por respostas aloimunes deletérias 5,6,7, e a capacidade de estudar essas interações celulares dinâmicas em um modelo animal vivo é inestimável.

A microscopia de dois fótons permite imagens intravitais de alta resolução para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotobranqueamento mínimo dos tecidos 8,9. É usado em uma variedade de tecidos e locais anatômicos, incluindo o neocórtex10,11, a pele12,13 e o rim14,15. Mais recentemente, foi adaptado para órgãos não estáticos, como pulmão e coração4,16,17. Neste protocolo, descrevemos uma técnica para obter imagens de enxertos pulmonares estabilizados, ventilados e perfundidos após transplante de pulmão esquerdo ortotópico murino. Um dos principais benefícios do modelo de transplante é a capacidade de manipular geneticamente o doador e o receptor separadamente. Populações de células individuais podem ser visualizadas com cepas de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente knock-in, transferência adotiva de células marcadas com fluorescência5 ou injeção intravenosa de anticorpos marcados com fluorescência para ligar marcadores específicos de células 4,16,17,18.

Para estabilizar o pulmão durante a imagem, esse protocolo envolve a colagem do pulmão a uma lamínula, enquanto outros grupos descreveram a estabilização da sucção usando um dispositivo de vácuo reversível feito sob medida19. Nosso protocolo tem várias vantagens, incluindo uma área maior de imagem e relativa facilidade de configuração usando materiais comumente disponíveis em um laboratório de microscopia (incluindo lamínula e cola). Como essa técnica de colagem restringe o pulmão na superfície superior, espera-se que diminua o movimento ventilatório e permita imagens mais profundas. Essa técnica de imagem intravital permite a observação detalhada do comportamento e das interações das células imunes em tempo real, o que contribui para o estudo dos mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias versus tolerogênicas após o transplante pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos de manejo de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

1. Anestesia e intubação

NOTA: O transplante ortotópico de pulmão esquerdo de camundongo é realizado, conforme descrito anteriormente20,21. Pulmões de camundongos C57BL/6 (B6) de 20-25 g são transplantados para receptores B6 pareados por sexo e idade. B6. Camundongos repórteres LysM-GFP são usados como receptores para experimentos selecionados para visualizar a infiltração de neutrófilos em enxertos pulmonares. Os camundongos receptores podem ser visualizados imediatamente após um transplante de pulmão.

  1. Reanestesiar camundongos com administração intraperitoneal de cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (8-10 mg / kg). Administre buprenorfina de liberação sustentada (0,5-1,0 mg / kg) por via subcutânea para controle adicional da dor. Confirme a profundidade adequada da anestesia com uma pitada da pata.
    NOTA: Se o tempo entre o transplante de pulmão e a imagem intravital planejada for inferior a duas horas, pode-se redosar o anestésico com 50% da dose inicial de cetamina.
  2. Remova o cabelo de todo o peito esquerdo usando um aparador elétrico e limpe o peito para remover o excesso de pelos cortados.
  3. Aplique pomada oftálmica não medicamentosa nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento da córnea.
  4. Reintubar o camundongo por via orotraqueal com um angiocateter de 20 G, conforme descrito anteriormente21.
  5. Ventile com ar ambiente a uma taxa de 120 respirações/min e volume corrente de 0,5 cc.
  6. Administre isofluorano a 1% por via endotraqueal durante todo o procedimento.
  7. Para visualizar os vasos sanguíneos durante a imagem, injete 20 μL de pontos quânticos não direcionados de 655 nm (q-dots) em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato por via intravenosa pelo menos 5 minutos antes da imagem.

2. Preparo cirúrgico do pulmão esquerdo para exames de imagem

  1. Coloque o mouse em decúbito lateral direito (consulte a Figura 1A).
  2. Desinfete a pele do peito com uma mistura de 0,75% de iodo e 70% de etanol, três vezes.
  3. Reabra a toracotomia esquerda (de transplante de pulmão de camundongo) através do terceiro espaço intercostal (ver Figura 1A).
  4. Remover uma porção da pele e tecido mole sobre o local da toracotomia esquerda, medindo 1,5 cm x 1,5 cm (ver Figura 1B).
  5. Antes da ressecção da costela, primeiro clampeie as costelas por ~ 10 s para trombosar qualquer microvasculatura para obter hemostasia (ver Figura 1C, D).
  6. Ressecção porções da3ª à5ª costelas para criar uma janela de imagem grande o suficiente para desencarcerar o pulmão (~ 0,8 cm craniocaudalmente e ~ 1,0 cm ântero-posteriormente, Figura 1D, E).
  7. Pare qualquer sangramento adicional das bordas das costelas com eletrocautério.
    NOTA: É fundamental obter hemostasia na borda cortada das costelas para evitar perda excessiva de sangue durante o período de imagem.
  8. Coloque uma pequena protuberância (gaze de 4 cm x 4 cm dobrada longitudinalmente 3 vezes) sob o peito direito (ver Figura 1E).
  9. Usando cotonetes, eleve o enxerto pulmonar para fora do tórax e coloque a parte inferior do pulmão em uma tira de gaze embebida em solução salina de 1 cm x 3 cm (ver Figura 1F).
    NOTA: Esta tira de gaze embebida em solução salina evita o deslizamento do pulmão, mantém um ambiente úmido para o pulmão, protege o pulmão das bordas afiadas das costelas ressecadas e separa o pulmão do movimento do coração. Uma vez que a câmara de imagem circunferencial é aplicada sobre o pulmão (Figura 1G, H, descrita na seção 3), deve haver perda mínima de calor e fluido da cavidade torácica aberta durante o período de imagem.

3. Preparação da câmara de imagem

NOTA: Uma câmara de imagem é construída sob medida (consulte a Figura 2A). Esta câmara de imagem consiste em uma placa de base e uma placa superior entre as quais o mouse é colocado e fixado no lugar com parafusos com mola em ambos os lados (Figura 2B). A placa superior contém um recorte circular medindo ~2 cm de diâmetro. Um anel de vedação preto de tamanho correspondente é colocado nesta abertura na parte frontal da placa superior, que protegerá a lente objetiva (Figura 2C). Uma lamínula de 24 mm x 50 mm é colada na parte de trás da placa superior usando graxa de alto vácuo, o que criará uma vedação à prova d'água. Esta lamínula servirá como janela de imagem, aderindo ao pulmão abaixo e segurando o meio de imagem (ou seja, água) acima. Certifique-se de que nenhuma graxa a vácuo entre na janela circular de imagem. A lamínula será substituída para cada novo experimento de imagem. A placa de base é aquecida a 35-37 °C usando uma sonda de temperatura de termopar (Figura 2A).

  1. Coloque o camundongo intubado na placa de base da câmara de imagem com o tórax esquerdo aberto voltado para cima (ver Figura 1G, H). Prenda o mouse com fita adesiva sobre o rosto, patas dianteiras e cauda (consulte a Figura 1H e a Figura 2A).
  2. Aplique cola na parte inferior da lamínula fixada na placa superior (círculo cinza na Figura 2C, parte inferior), deixando um círculo sem cola de 0,8-1,0 cm no centro.
    NOTA: Há uma compensação entre o tamanho do círculo sem cola e a quantidade de artefato de movimento; Assim, recomenda-se que o círculo não exceda 1,0 cm de diâmetro.
  3. Abaixe a placa superior até que a lamínula entre em contato com o pulmão, com a cola tocando a superfície pulmonar (consulte a Figura 1G).
    NOTA: O pulmão esquerdo será colado à lamínula com um círculo limpo e sem cola no meio, que é a área que será fotografada.
  4. Segure a lamínula contra o pulmão e encha o pulmão por 1-2 s para que a área da cola adira ao tecido circundante. Realize a insuflação pulmonar ocluindo o tubo de saída do tubo endotraqueal do camundongo para o ventilador.
    NOTA: Não infle o pulmão por mais de 1-2 segundos, pois isso pode causar barotrauma excessivo.
  5. Afaste ligeiramente a placa superior para reduzir a pressão no tecido pulmonar. Certifique-se de que a área do pulmão dentro da janela de imagem não se mova com a ventilação.
  6. Prenda ambas as extremidades da placa superior prendendo a porca de aperto manual sobre cada parafuso (consulte a Figura 2B).

4. Imagem de dois fótons

NOTA: Um microscópio vertical de estágio fixo com uma objetiva de imersão em água de abertura numérica (NA) de 20x ou 25x >1,0 deve ser usado para microscopia intravital. Abaixo está a configuração usada neste estudo para um B6 a B6. Transplante de pulmão esquerdo LysM-GFP com marcação de vasos sanguíneos q-dot de 655 nm. Ao aplicar este protocolo, a configuração do microscópio, lasers e filtros dicróicos pode ser adaptada com base nas necessidades do experimento específico e dos repórteres fluorescentes usados.

  1. Coloque toda a câmara de imagem com o camundongo receptor intubado (B6 pulmão esquerdo transplantado em B6. LysM-GFP com pontos q de 655 nm) na platina do microscópio (ver Figura 2A).
  2. Use filtros dicróicos de comprimentos de onda de 480 nm, 560 nm e 635 nm, que separarão adequadamente os sinais do repórter GFP, pontos q e sinal de geração de segundo harmônico (SHG) (445 nm) gerado pelo colágeno. Esses filtros podem ser adaptados com base no experimento específico.
    NOTA: O sinal SHG gerado pelo colágeno demarca estruturas escuras semelhantes a crateras, que representam espaços aéreos alveolares (veja as setas brancas na Figura 3).
  3. Defina o laser pulsado de femtossegundo de titânio-safira para 890 nm (dentro da faixa do infravermelho próximo) para excitação. Use a menor potência de laser possível para obter um sinal suficiente.
    NOTA: As configurações do laser devem ser ajustadas para o experimento específico para maximizar a separação do sinal.
  4. Aplique ~ 1 mL de água para cobrir completamente a lamínula na placa superior, que será mantida no lugar pelo O-ring e pela vedação de graxa a vácuo da lamínula na placa superior (consulte a Figura 1G e a Figura 2C).
  5. Use a objetiva de imersão em água 20x >1.0 NA no microscópio. Certifique-se de que a lente objetiva seja adaptada com base no experimento específico.
    NOTA: NA maior permite mais coleta de luz, maior contraste e imagens mais detalhadas. As objetivas de imersão em água são preferidas, pois a água ou o tampão são mais compatíveis com os tecidos biológicos.
  6. Abaixe a objetiva do microscópio na água e concentre-se na superfície do pulmão.
  7. Ative o aquecedor da placa de base e mantenha a temperatura em 35-37 °C.
    NOTA: Se houver preocupações sobre a incapacidade de manter a temperatura do tecido ou perfusão adequada para o pulmão, dois resistentes adicionais podem ser anexados para aquecer a placa superior, além da placa de base (ver Figura 1 suplementar).
  8. Adquira pilhas de imagens com o software de aquisição de sua escolha.
    NOTA: Certifique-se de que a sala esteja completamente escura durante a aquisição, o que pode envolver o uso de cortinas/persianas blackout e cobertura estratégica de todas as fontes de luz.

5. Aquisição de vídeo

NOTA: Os seguintes parâmetros podem ser adaptados com base no experimento específico. As etapas 5.1-5.3 descrevem os parâmetros específicos usados para B6 a B6. Transplante de pulmão esquerdo murino Lysm-GFP, que pode ser usado como guia de referência.

  1. Usando um scanner bidirecional de taxa de vídeo, defina as dimensões de digitalização x-y para 512 x 512 pixels.
  2. Usando uma unidade de passo xyz, adquira gravações de lapso de tempo de uma pilha z de 21 etapas com média de 10 quadros por etapa. Cada pilha leva cerca de 20 s para ser adquirida, o que inclui o tempo necessário para a média do quadro, o motor de passo para se mover e verificar sua posição e um atraso de 100 ms.
    NOTA: O scanner bidirecional no microscópio usado neste estudo opera a uma taxa de vídeo de 30 quadros / s. Isso pode diferir dependendo da configuração específica do microscópio.
  3. Adquira 80 pilhas z consecutivas para obter imagens de lapso de tempo da migração de leucócitos dentro do parênquima tecidual. Isso leva cerca de ~ 27 min a 20 s / pilha.
    NOTA: O tamanho da pilha, a média do quadro, a potência do laser e a duração total da gravação de lapso de tempo devem ser minimizados para evitar a exposição excessiva do laser ao tecido. Se os repórteres fluorescentes usados forem brilhantes (ou seja, GFP) e a potência do laser for baixa, repetir uma pilha z de 21 etapas com uma média de 10 quadros, varredura de 512 x 512 pixels, em intervalos de 20 s por ~ 27 min é bem tolerado pelo mouse. Se forem desejados períodos mais longos de imagem, o tempo de aquisição por pilha deve ser aumentado para manter a exposição total do laser igual (ou seja, 1 min por pilha durante ~1,5 h). Essas configurações precisarão ser otimizadas com base nos repórteres fluorescentes usados.
  4. Eutanásia do mouse no final da aquisição da imagem. Para eutanasiar, anestesiar o camundongo com cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg), seguida de luxação cervical subsequente. As preparações de imagem típicas manterão facilmente a viabilidade do camundongo por até 2 h.
    NOTA: Para estender esse período, pode ser necessária suplementação adicional de fluidos, anestesia com isoflurano e atenção à regulação da temperatura.
  5. Renderização de vídeo completa com Imaris. Outros softwares de imagem (como o ImageJ) também podem ser usados.
    NOTA: As imagens podem ser processadas após a aquisição usando aprimoramento de contraste, suavização e aritmética de canal para remover a diafonia do canal.

Resultados

Após 1 h de armazenamento isquêmico frio a 4 °C, transplantamos ortotopicamente o pulmão esquerdo de um camundongo B6 para um B6. LysM-GFP camundongo4 e, em seguida, foi realizada imagem intravital de dois fótons, conforme descrito acima. Realizamos exames de imagem em dois momentos pós-transplante - 2 h (Figura 3A) e 24 h (Figura 3B). Os vasos sanguíneos são marcados em vermelho pelos pontos q injetados imediatamente antes da imagem. Além disso, podemos visualizar monócitos que ocuparam q-dots em 24 h4. Neutrófilos derivados do receptor marcados em verde podem ser vistos infiltrando-se no enxerto pulmonar no vídeo correspondente 24 h após o transplante (Vídeo Suplementar 1). Os alvéolos podem ser visualizados como crateras escuras devido ao SHG do colágeno (setas brancas na Figura 3). Observamos que 24 h pós-transplante, há mais neutrófilos no pulmão em comparação com 2 h pós-transplante (Figura 3).

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Figura 1: Preparação do camundongo para imagens de dois fótons. (A) Pele reaberta sobre a toracotomia esquerda. (B) Excisão de pele e tecidos moles sobre o tórax esquerdo. (C, D) Costelas presas por 10 s antes de se dividir. (E) Costelas esquerdas da3ª à 5ª ressecadas para criar uma janela medindo ~ 0,8 cm craniocaudalmente x 1,0 cm ântero-posteriormente. (F) Pulmão esquerdo elevado para fora do tórax esquerdo e colocado em uma tira de gaze. (G) Uma câmara de imagem com uma janela de imagem sobrepõe-se ao pulmão esquerdo. (H) A câmara de imagem colocada na platina do microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Configuração da câmara de imagem. (A) A câmara de imagem colocada na platina do microscópio. (B) Vista ampliada do mecanismo do parafuso com mola para prender a placa superior sobre o pulmão esquerdo. (C) Frente e verso da placa superior com O-ring e lamínula aplicados. As linhas brancas representam a área onde a graxa a vácuo é aplicada para aderir a lamínula à placa superior. O círculo cinza representa um anel de cola para aplicar na lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagem intravital de dois fótons de transplante de pulmão esquerdo de camundongo de B6 para B6. Camundongo LysM-GFP com armazenamento isquêmico a frio de 1 h. A imagem é realizada em (A) 2 h e (B) 24 h após o transplante. Vermelho representa pontos q. Verde representa neutrófilos de B6. Destinatário do LysM-GFP. O azul representa SHG de alvéolos ricos em colágeno. As setas brancas mostram os espaços aéreos alveolares. A barra de escala representa 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Placa superior com dois resistentes conectados para fornecer aquecimento adicional. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Imagem de lapso de tempo de dois fótons do pulmão esquerdo de camundongo transplantado de B6 para B6. Camundongo LysM-GFP com 1 h de armazenamento isquêmico frio, realizado 24 h após o transplante. Vermelho representa pontos q. Verde representa neutrófilos do receptor LysM-GFP. O azul representa a segunda geração harmônica de alvéolos ricos em colágeno. A barra de escala representa 20 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A excitação de dois fótons foi descrita pela primeira vez em sua tese de doutorado por Maria Göppert-Mayer em 1931, que mais tarde ganhou o Prêmio Nobel de Física por descrever a estrutura da camada nuclear22,23. A microscopia de fluorescência tradicional depende da excitação de fóton único, com comprimentos de onda de excitação mais curtos e de maior energia do que os comprimentos de onda de emissão. Em contraste com a microscopia de fóton único, a microscopia de dois fótons envolve excitação simultânea por dois fótons, cada um com comprimentos de onda mais longos do que o do sinal de fluorescência emitido 24,25,26. Como dois fótons individuais precisam co-localizar para excitar um único ponto focal no tecido, a excitação de dois fótons é espacialmente para um pequeno volume de amostra, permitindo o seccionamento óptico 24,25,26 e há menos fotobranqueamento acima e abaixo do plano que contém o ponto focal27. A probabilidade de excitação simultânea por dois fótons é muito baixa, portanto, um laser pulsado de femtossegundo é necessário para atingir a intensidade de excitação necessária para um sinal de emissão de fluorescência 25,26,27. O laser de excitação está na faixa do infravermelho próximo (700-1100 nm), uma vantagem da qual é a menor dispersão, o que permite que a luz penetre mais profundamente no tecido28. A profundidade da imagem depende da velocidade de oscilação e da potência do laser24. Dentro do pulmão, profundidades de imagem de ~ 500-600 μm podem ser alcançadas17. Assim, a combinação de profundidade de imagem e baixo fotobranqueamento torna a microscopia de dois fótons altamente adequada para imagens intravitais de órgãos.

A microscopia de dois fótons tem sido usada em vários tecidos e locais anatômicos diferentes, como pele12,13, linfonodos29, endotélio venoso30, córtex cerebral10,11, rim14,15 e fígado31,32. Por exemplo, na derme de camundongos, a imagem intravital de dois fótons tem sido usada para descrever o enxame de neutrófilos após lesão física estéril12. Em um modelo de trombose venosa, monócitos sanguíneos e neutrófilos foram visualizados rastejando ao longo do endotélio da veia cava inferior30. A microglia humana foi fotografada com sucesso in vivo após ser xenotransplantada em um modelo organoide do cérebro humano33. Com os avanços contínuos na microscopia de dois fótons, a imagem intravital é possível em profundidades maiores e até mesmo em órgãos não estáticos. Por exemplo, profundidades de até 1000 μm foram visualizadas no neocórtex em camundongos usando um amplificador regenerativo Ti: Al2O3 34.

Um dos desafios da imagem intravital em órgãos torácicos é a estabilização da imagem. Devido ao movimento do coração batendo e das respirações pulmonares, os artefatos de movimento podem reduzir significativamente a qualidade da imagem. Vários métodos de estabilização para imagens cardíacas e pulmonares foram desenvolvidos, incluindo colagem do órgão 4,7, estabilização por sucção 19,35,36,37 e correção de movimento a posteriori38. Nossa técnica de imagem do pulmão depende da colagem da superfície pulmonar a uma lamínula estabilizada. Mantemos o pulmão perfundido, ventilado e normotérmico, o que simula as condições encontradas in vivo. Comparado ao método de sucção-estabilização descrito por Looney et al.19, esse protocolo apresenta várias vantagens. Em primeiro lugar, não exigimos a criação de um dispositivo de sucção especializado. Em vez disso, nossa câmara de imagem e placa superior podem ser construídas com materiais prontamente disponíveis em um laboratório de microscopia. Além disso, em comparação com o dispositivo de sucção (que tem um diâmetro interno de 4 mm), a técnica de colagem utilizada neste estudo permite uma maior área de superfície de imagem (até 10 mm). Com a colagem circunferencial, a área do pulmão dentro do círculo de cola é adequadamente restringida e o movimento ventilatório é minimizado. Em comparação com a técnica de sucção, a abordagem da lamínula evita a deformação convexa da superfície pulmonar, o que pode afetar o fluxo sanguíneo capilar subpleural. As desvantagens do nosso sistema incluem a incapacidade de remover a lamínula sem comprometer a junção pleuroparenquimatosa. Assim, não é possível obter imagens do pulmão uma segunda vez com a técnica de cola usada aqui, enquanto a técnica de sucção permite imagens seriadas. Além disso, o uso de uma toracotomia requer a perda da pressão intratorácica negativa normal, que, combinada com a ventilação com pressão positiva, não é fisiológica. Limitações adicionais e limitações da imagem de dois fótons são discutidas abaixo.

Enquanto o tórax está aberto durante a imagem intravital, é fundamental manter-se o mais próximo possível de um ambiente fisiológico. A placa de base sobre a qual o mouse se encontra é mantida a uma temperatura de 35-37 °C. Com apenas a placa de base aquecida, descobrimos que a temperatura do núcleo do camundongo (medida por meio de uma sonda retal) é bem regulada ao longo de várias horas. Em nossa experiência, a motilidade e o comportamento celular só são visivelmente afetados quando a temperatura cai abaixo de 32 °C, o que é improvável que ocorra com essa configuração. Se houver uma dificuldade encontrada em manter a normotermia tecidual ou a perfusão pulmonar durante a configuração inicial desta câmara de imagem, dois resistentes adicionais podem ser anexados para aquecer a placa superior, além da placa de base (Figura Suplementar 1). Uma vez que a câmara de imagem é otimizada, não é necessário monitorar rotineiramente a temperatura interna do mouse durante cada experimento de imagem. Além disso, descobrimos que a combinação de gaze embebida em solução salina colocada sobre a cavidade torácica aberta e o anel oclusivo de cola ao redor da área do pulmão a ser visualizada são eficazes para minimizar as perdas de fluido durante a imagem.

Uma consideração técnica importante é obter uma boa hemostasia durante a ressecção da costela ao criar a janela de imagem torácica. Partes da3ª à5ª costelas esquerdas são ressecadas e a hemorragia contínua dessas costelas cortadas comprometerá a sobrevivência do camundongo durante a imagem. Para combater isso, recomendamos primeiro pinçar as costelas proximalmente ao local onde devem ser ressecadas por 10 s para trombosar a microvasculatura (ver Figura 1C, D). Então, após a ressecção das costelas, as bordas cortadas das costelas devem ser generosamente coaguladas com eletrocautério. Finalmente, é fundamental colocar o pulmão esquerdo em cima da tira de gaze embebida em solução salina (ver Figura 1F) durante a imagem para evitar que as bordas afiadas das costelas perfurem o pulmão. Com essa combinação de considerações técnicas, podemos capturar vídeos claros do tráfego de células imunes dentro do parênquima pulmonar com artefato de movimento mínimo por várias horas sem lesão pulmonar ou perda de padrões normais de perfusão.

A microscopia de dois fótons tem sido usada em pulmões para estudar modelos de doenças infecciosas e inflamação estéril. Um grupo usou imagens de dois fótons para estudar a motilidade e migração de células B de memória residente após desafios repetidos de pulmões de camundongos com vírusinfluenza 39. Além disso, a microscopia de dois fótons tem sido usada no transplante de pele, rim e ilhotas pancreáticas 40,41,42,43. Com um modelo de transplante, o doador e o receptor podem ser alterados geneticamente para estudar suas respectivas populações de células. Até onde sabemos, nosso grupo foi o primeiro a realizar imagens intravitais de dois fótons em transplantes de pulmão murino4. Observamos rápido recrutamento e agrupamento de neutrófilos após lesão de isquemia-reperfusão mediada por transplante, que foi reduzida com a depleção farmacológica dos monócitos sanguíneos4. Em trabalhos subsequentes, mostramos que os monócitos derivados do baço do receptor facilitam o extravasamento de neutrófilos por meio da produção de IL-1B44. A imagem intravital nesses estudos nos permitiu descobrir reguladores a montante do extravasamento de neutrófilos como possíveis alvos terapêuticos para reduzir a resposta inflamatória pós-transplante45. Além disso, também realizamos imagens intravitais em corações de camundongos batendo após transplante heterotópico16. Visualizamos o recrutamento de neutrófilos para o miocárdio e descobrimos que a morte celular ferroptótica das células do enxerto cardíaco inicia a inflamação após o transplante cardíaco46. Aplicamos uma técnica de estabilização semelhante aos arcos aórticos transplantados para visualizar o tráfego monocítico em placas ateroscleróticas47. Esses estudos demonstraram a viabilidade e a utilidade da imagem intravital de órgãos torácicos transplantados não estáticos.

Finalmente, vale a pena discutir métodos para visualizar diferentes tipos de células e o parênquima pulmonar. Dois métodos principais são usados para rotular células - 1) cepas de camundongos transgênicos com mutações knock-in de proteínas fluorescentes e 2) anticorpos marcados com fluorescência para corar as células. Cepas de camundongos transgênicos comumente usadas para identificar células imunes por microscopia de dois fótons incluem LysM-GFP para neutrófilos48, CX3Cr1-GFP para várias populações de macrófagos intersticiais49,50, CCR2-GFP para monócitos clássicos51, CD19-tdTomato para células B52 e Foxp3-GFP para células T reguladoras5. Notavelmente, CX3Cr1 sozinho não é suficiente para identificar células de forma inequívoca, mas isso pode ser auxiliado pela morfologia celular e localização consistente com a dos macrófagos intersticiais. Os macrófagos alveolares podem ser visualizados sem marcação devido à sua autofluorescência 53,54, morfologia e comportamento distintos (ou seja, falta de motilidade na resolução de tempo dos registros de lapso de tempo). Em comparação com os eosinófilos, que também são autofluorescentes, os macrófagos alveolares são maiores e consideravelmente mais brilhantes com excitação de 890 nm54. Alternativamente, os macrófagos alveolares também podem ser marcados com base em sua função fagocítica por meio da administração intrapulmonar de agregados de corantes54.

A visualização de células imunes em receptores de transplante também pode ser realizada por transferência adotiva intravascular de células marcadas com fluorescência ou por injeção de anticorpos marcados com fluorescência contra marcadores de superfície específicos da célula18,55. Outro benefício inerente da microscopia de dois fótons é o SHG por certas estruturas birrefringentes dentro do tecido, como o colágeno56. Esse fenômeno é particularmente útil para imagens pulmonares devido ao alto teor de colágeno nos sacos alveolares, que atua como um indicador intrínseco da estrutura alveolar sem corantes fluorescentes adicionais. Além disso, os alvéolos também são circunscritos por capilares alveolares marcados por pontos q de 655 nm. Finalmente, os vasos sanguíneos podem ser marcados com injeção intravenosa de q-dots (conforme descrito neste protocolo) ou rodamina B dextrana. Ao projetar um experimento de microscopia intravital de dois fótons, recomendamos o uso de não mais do que quatro canais de emissão diferentes para minimizar o risco de sangramento e má diferenciação entre os canais.

Uma das principais limitações de nossa técnica de estabilização de cola descrita é a incapacidade de remover a lamínula do pulmão sem possíveis danos teciduais e cola residual na superfície pulmonar. Assim, o pulmão só pode ser visualizado uma vez, em vez de em vários pontos de tempo ao longo de vários dias. Para lidar com essa limitação, um grupo descreveu uma janela de imagem torácica semipermanente, que permite imagens seriadas do pulmão57. No entanto, em nossa experiência, essa abordagem não permite a estabilização pulmonar adequada para períodos prolongados de imagem. Essa técnica oferece a capacidade de obter imagens do pulmão por várias horas, o que fornece informações importantes sobre as respostas imunes inatas e adaptativas após o transplante.

Outras limitações da imagem de dois fótons incluem o caro custo inicial de configuração e a experiência necessária para manter o sistema. Os campos de varredura são relativamente pequenos em comparação com a imagem imunofluorescente. Danos térmicos e fotodanificados podem ser significativos sem uma otimização cuidadosa dos parâmetros de aquisição. A função de propagação do ponto de excitação de dois fótons é ampla, o que limita um pouco a resolução, especialmente na dimensão z. Além disso, a imagem de dois fótons requer que as células de interesse sejam marcadas com fluorescência e algumas células não podem ser marcadas de forma inequívoca com um único marcador celular. O número de sinais que podem ser fotografados simultaneamente é geralmente limitado a quatro ou menos. Finalmente, anestesia, cirurgia e imagem podem induzir inflamação adicional e alterações fisiológicas no transplante de pulmão que podem confundir os resultados e interpretações experimentais, apesar dos melhores esforços para manter um ambiente fisiológico. As direções futuras incluem o desenvolvimento de métodos minimamente invasivos de imagem intravital (como por meio de uma toracotomia menor ou abordagem broncoscópica).

Em conclusão, a microscopia intravital de dois fótons é uma ferramenta inestimável no estudo de múltiplos processos patológicos. Aqui, descrevemos uma técnica confiável de imobilização pulmonar e imagem de dois fótons, que permite a observação intravital do tráfego celular e interações dinâmicas entre diferentes populações de células após o transplante de pulmão murino. Essa técnica ampliou nossa compreensão do cenário imunológico pós-transplante e continuará a ser uma ferramenta indispensável no estudo do transplante de pulmão e outros processos de doenças pulmonares.

Divulgações

Os autores não relatam divulgações relevantes.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por doações do NIH 1P01AI11650 e da Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Agradecemos ao In Vivo Imaging Core da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,75% de iodopovidonaAplicareNDC 52380-0126-2Para desinfetante
cateter IV 20GTerumoSROX2025CAPara tubo endotraqueal (ETT)
Fita de seda de 1 polegadaDurapore3M ID 7100057168Para fixar o mouse na posição
Lente objetiva longa de imersão em água 20xCola
3M VetbondMedi-Vet.com10872Para colar lamínula no pulmão
655 nm pontos quânticos não direcionadosThermoFisherQ21021MPPara rotulagem de vasos sanguíneos
etanol 70%Sigma AldrichEX0281Para desinfetante
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)Loja de ferragensN/APara imagens personalizadas Parafuso da câmara
(2)Loja de ferragensN/APara câmara de imagem personalizada
Porca de aperto manual de latão (2)Loja de ferragensN/APara câmara de imagem personalizada
Buprenorfina 1,3 mg/mLFidelis Saúde AnimalNDC 86084-100-30Para controle da dor
Camaleão titânio-safira laser pulsado de femtossegundoCoerente/A
Vidro de cobertura (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Para câmara de imagem personalizada
Grampo de mosquito curvo (1)Ferramentas Fine Science13009-12
Controlador de aquecedor de canal duploWarner InstrumentsTC-344B
Tesoura fina (1)Ferramentas Fine Science15040-11
Microscópio vertical de estágio fixoOlympusBX51WI
Gaze (cortada em 1 cm x 3 cm)McKesson476709Para colocar sob o pulmão esquerdo
Graxa de alto vácuoDow CorningN/APara colar a lamínula na placa superior
Isoflurano 1%Sigma Aldrich26675-46-7Para anestesia
Cloridrato de cetamina 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Para anestesia
Chapa metálica (3 cm x 7 cm)Loja de ferragensN/APara câmara de imagem personalizada
Aplicadores pontiagudos com ponta de algodãoSolon56225Para manipular o pulmão e para dissecção sem corte
Tosquiadeira Power Pro UltraOster078400-020-001
Pomada para os olhos Puralube VetMedi-Vet.com11897Para evitar a dessecação dos olhos
Ventilador para pequenos animaisHarvard Aparelho55-0000
Fórceps reto (1)Ferramentas de ciência fina91113-10
Driver de obturador de três canaisUniblitzVMM-D3Scanner ressonante
motor de passo óptico xyzPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg / mLAkornNDC 59399-110-20Para controle da dor
Olympus N20X-PFH N

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