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Avaliando as medidas de resultados da conectividade da unidade motora do diafragma do rato como biomarcadores quantitativos da degeneração e compensação do neurônio motor frênico

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DOI:

10.3791/66568

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19 de abril de 2024

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1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, apresentamos um método in vivo para estimar o número e o tamanho da unidade motora para quantificar a conectividade da unidade motora do diafragma de ratos. Uma abordagem passo a passo para essas técnicas é descrita.

Resumo

A perda da função muscular ventilatória é uma consequência da lesão do neurônio motor e da neurodegeneração (por exemplo, lesão da medula espinhal cervical e esclerose lateral amiotrófica, respectivamente). Os neurônios motores frênicos são o elo final entre o sistema nervoso central e o músculo, e suas respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por um único neurônio motor) representam a menor unidade funcional do sistema ventilatório neuromuscular. O potencial de ação muscular composto (CMAP), o potencial de unidade motora única (SMUP) e a estimativa do número de unidades motoras (MUNE) são abordagens eletrofisiológicas estabelecidas que permitem a avaliação longitudinal da integridade da unidade motora em modelos animais ao longo do tempo, mas têm sido aplicadas principalmente aos músculos dos membros. Portanto, os objetivos deste estudo são descrever uma abordagem em estudos pré-clínicos com roedores que pode ser usada longitudinalmente para quantificar o MUNE frênico, o tamanho da unidade motora (representado como SMUP) e o CMAP e, em seguida, demonstrar a utilidade dessas abordagens em um modelo de perda de neurônios motores. Biomarcadores sensíveis, objetivos e translacionalmente relevantes para lesão neuronal, degeneração e regeneração em lesões e doenças do neurônio motor podem ajudar significativamente e acelerar as descobertas de pesquisas experimentais para testes clínicos.

Introdução

Os neurônios motores frênicos (MNs), estendendo-se dos níveis de miótomo C3 a C6, formam o elo final do sistema nervoso central (SNC) ao músculo diafragma1. As unidades motoras frênicas (MUs) são compostas por um único MN espinhal e suas fibras musculares diafragmáticas inervadas formando a menor unidade funcional do sistema neuromuscular respiratório. A função ventilatória requer contração adequada do músculo diafragma obtida por meio da ativação coordenada do pool frênico deMU2,3. Muitas doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica (ELA), resultam em grave comprometimento ventilatório, contribuindo para a causa da morte4.

Várias abordagens eletrofisiológicas podem ser empregadas para avaliar e monitorar a integridade do pool de unidades motoras (MU) in vivo. O potencial de ação muscular composto (CMAP) reflete a despolarização somada de todas as fibras musculares em um músculo ou grupo muscular específico após a estimulação do nervo periférico e é sensível a uma variedade de condições neuromusculares, incluindo ELA 5,6 e atrofia muscular espinhal (AME)7,8,9. Uma limitação da avaliação do CMAP é que o brotamento colateral pode levar à manutenção da amplitude e área do CMAP, mesmo na presença de perda de MU10. Para superar essa limitação, modificações foram feitas na técnica de CMAP para avaliar o número de unidades motoras e o tamanho11. Além disso, um estudo in vivo que investigou a avaliação funcional da CMAP do diafragma por um sistema eletrofisiológico sugeriu que também pode ser viável utilizar a técnica de registro da CMAP do diafragma descrita para estimativa do número de unidades motoras12.

A técnica de estimativa do número de unidades motoras incrementais (MUNE) foi inicialmente introduzida no início da década de 1970 por McComas et al. para o músculo extensor curto dos dedos em humanos13. A abordagem incremental MUNE foi uma modificação da técnica tradicional de registro CMAP, durante a qual uma estimulação gradualmente crescente foi fornecida para registrar incrementos submáximos quantais, tudo ou nada, como índices de respostas de unidade motora única. Os incrementos somados e médios foram usados para calcular uma estimativa para o tamanho de um único potencial de unidade motora (SMUP). Esse tamanho calculado foi então dividido na amplitude do CMAP para estimar o número de MUs que inervam o músculo examinado11. O MUNE demonstra alta sensibilidade na detecção e monitoramento da perda de unidades motoras, permitindo a identificação de disfunção da unidade motora antes de alterações observáveis em medidas como amplitude ou área de CMAP14,15. Em pacientes com ELA, o MUNE provou ser excepcionalmente sensível, servindo como um biomarcador proeminente para o início, progressão e prognóstico da doença16,17.

Numerosas adaptações do MUNE foram desenvolvidas e amplamente utilizadas para avaliar a função do MU em condições como neurodegeneração, lesão neural e o processo natural de envelhecimento 18,19,20,21. Desde a descrição inicial, várias adaptações utilizando respostas eletrofisiológicas e medições de força incremental (mecânica) foram empregadas em estudos em humanos e modelos animais22. O MUNE fornece uma avaliação funcional não invasiva da conectividade do neurônio motor com o músculo. A aplicação longitudinal do MUNE permite a compreensão da progressão da doença ou do fenótipo induzido e a avaliação dos efeitos protetores ou regenerativos das intervenções terapêuticas, tanto em ambientes clínicos quanto pré-clínicos. Independentemente da eficácia da reprodutibilidade das medidas do MUNE e da relevância clínica da técnica para pools de MU na maior parte do corpo humano, os esforços têm se concentrado principalmente nos músculos dos membros nos músculos de roedores 10,23,24,25.

Portanto, os objetivos deste estudo foram descrever uma abordagem para obter potencial de ação muscular composto (CMAP), SMUP e número de unidades motoras frênicas (MUNE) como avaliações in vivo que podem ser usadas longitudinalmente em estudos pré-clínicos com roedores para quantificar o MUNE, tamanho da unidade motora (representada como SMUP) e CMAP. Além disso, apresentamos dados representativos que destacam a perda do número de MU do diafragma após a administração intrapleural de um agente degenerativo frênico do NM, fragmento B da toxina da cólera conjugado à saporina (CTB-SAP).

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados e conduzidos em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri. Os experimentos foram realizados em ratos Sprague-Dawley machos adultos, com idade entre 11 e 15 semanas. Esses ratos foram alojados em pares e mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12:12, com acesso a alimentos peletizados comerciais padrão e água tratada com HCl disponível o tempo todo.

1. Preparação do animal e administração da anestesia

  1. Use equipamento de proteção individual adequado ao manusear ratos.
  2. Administrar anestésico inalatório com isoflurano a 3-5%, garantindo a indução adequada. Uma vez que o rato esteja adequadamente anestesiado, coloque-o em decúbito dorsal e mantenha a anestesia com isoflurano inalado a 1-3%. Verifique a suficiência da profundidade da anestesia aplicando pressão suavemente na almofada do pé do membro posterior usando uma pinça para garantir que não haja resposta de retirada.
    NOTA: Com base no tamanho e peso do rato, monitore a profundidade da anestesia e ajuste a concentração de isoflurano de acordo.
  3. Mantenha a temperatura de 37 °C usando uma placa de aquecimento termostática para evitar variações de temperatura que possam afetar a amplitude e a latência do CMAP.
  4. Aplique uma pomada veterinária à base de petróleo nos olhos para evitar o ressecamento. Monitore a profundidade da anestesia observando a frequência respiratória e verificando as respostas de retirada ao aplicar pressão na almofada do pé com uma pinça.
  5. Remova os pelos do terço inferior do tórax e pescoço para serem estudados com aparadores. Monitore a respiração do rato durante todo o experimento.
    NOTA: Após os registros CMAP e MUNE e a descontinuação da anestesia, não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente. Não devolva o animal à gaiola de casa até que esteja totalmente recuperado.

2. Colocação e configuração do eletrodo

  1. Coloque um par de eletrodos de agulha monopolares de 28 G para registrar o CMAP, SMUP e MUNE conforme ilustrado na Figura 1.
    1. Coloque o eletrodo de agulha ativo (E1) por via subcutânea sobre a linha clavicular média inferior à última borda da costela e o eletrodo de agulha de referência (E2) por via subcutânea no ângulo entre o processo xifóide e a última cartilagem esternocostal.
      NOTA: Os eletrodos da agulha não devem ser inseridos no músculo diafragma; em vez disso, eles devem ser posicionados na área subcutânea.
  2. Para a estimulação do nervo frênico na lâmina carotídea, use um par de eletrodos de agulha monopolar 28 G como cátodo e ânodo para estimulação nervosa e colocados subcutaneamente sobre o pescoço lateral entre os músculos escaleno anterior e médio, separados por aproximadamente 1 cm. Certifique-se de que a colocação das agulhas estimulantes esteja no nível abaixo da quarta vértebra cervical (C4).
    NOTA: Evite inserir os eletrodos estimulantes muito fundo para evitar lesões no nervo frênico ou em outra estrutura. A Figura 1 ilustra a colocação do eletrodo.
  3. Para o eletrodo de aterramento, coloque um eletrodo de superfície descartável na cauda.

3. Aquisição de dados

  1. CMAP frênico
    1. Registre as respostas frênicas do CMAP aplicando pulsos catódicos monofásicos de onda quadrada com duração de 0,1 ms e intensidade variando de 60 a 100 mA para estimular o nervo frênico.
    2. Obtenha respostas CMAP enquanto aumenta progressivamente a intensidade do estímulo até que a amplitude da resposta deixe de mostrar qualquer aumento adicional. Para garantir a estimulação supramáxima, aumente a intensidade do estímulo para aproximadamente 120% do nível usado para obter uma resposta máxima e registre uma resposta adicional. Se o tamanho do CMAP não aumentar mais, considere essa resposta como o CMAP máximo.
      NOTA: Fornecer estimulação durante a expiração é preferível para minimizar o ruído da atividade muscular simultânea durante a gravação do CMAP.
    3. Meça e documente as amplitudes pico a pico do CMAP em milivolts (mV) (Figura 2).
      NOTA: A amplitude do CMAP pode ser avaliada de base a pico e pico a pico. Os sistemas de eletrodiagnóstico clínico são frequentemente padronizados para avaliar a base ao pico, que é calculada a partir da linha de base isoelétrica até o pico negativo inicial.
  2. Tamanho médio do potencial de unidade motora única (SMUP) e cálculo do MUNE
    1. Calcule o tamanho médio do SMUP usando uma técnica de estimulação incremental.
      1. Para obter respostas incrementais, administre estimulação submáxima com duração de 0,1 ms na frequência de 1 Hz, aumentando gradualmente a intensidade em incrementos de 0,03 mA até que uma resposta mínima de tudo ou nada seja alcançada. Adquira a resposta inicial com uma intensidade de estímulo variando entre 2 mA e 10 mA.
      2. Se a resposta inicial não ocorrer com uma intensidade de estímulo entre 2 mA e 10 mA, modifique a posição do cátodo estimulante, aproximando-o ou afastando-o do nervo frênico no pescoço, para diminuir ou aumentar a intensidade do estímulo necessário, respectivamente.
      3. Se a primeira resposta incremental for alcançada com uma intensidade de estímulo variando de 2 mA a 10 mA, salve a primeira resposta e adquira incrementos adicionais com intensidades de estímulo progressivamente mais altas, ajustando em incrementos de 0,03 mA, para obter um total de 9 incrementos adicionais que atendam aos seguintes critérios na etapa 3.2.2.
        NOTA: Cada SMUP é quantificado subtraindo cada incremento do incremento anterior.
    2. Ao medir as respostas incrementais, certifique-se de que cada incremento atenda aos seguintes critérios:
      1. Certifique-se de que o pico negativo inicial das respostas incrementais esteja alinhado temporalmente com o pico negativo da resposta CMAP máxima.
        NOTA: Os pequenos movimentos observados devido ao ruído de fundo dos ciclos respiratórios são inerentes à natureza do experimento. No entanto, a presença consistente de SMUPs durante a observação ao vivo confirma sua identidade para esse CMAP específico.
      2. Como o diafragma é um músculo dinâmico envolvido na respiração, cada ciclo respiratório pode induzir o movimento basal. Assim, verifique a estabilidade e a ausência de fracionamento em cada resposta incremental, confirmando a consistência em três respostas duplicadas.
        NOTA: Para distinguir os potenciais evocados de baixa amplitude, especialmente o primeiro SMUP, do ruído de fundo devido à atividade respiratória, é importante permanecer vigilante e observar por 3-4 ciclos respiratórios. Garanta também o alinhamento dos picos com os do CMAP para precisão.
      3. Certifique-se de que cada incremento seja distinto e maior que o anterior. Portanto, distinga visualmente as respostas incrementais em tempo real, observando-as à medida que se sobrepõem aos incrementos registrados anteriormente.
        NOTA: Várias réplicas do estímulo em cada amplitude podem ser conduzidas para garantir a consistência nos incrementos e a conformidade com os critérios predefinidos.
      4. Depois de verificar visualmente cada incremento com os critérios acima mencionados, confirme se a amplitude do incremento é de pelo menos 25 μV. Se o incremento for inferior a 25 μV, rejeitar a medição e reavaliar a resposta.
      5. Após o registro de 10 respostas incrementais, verifique se a amplitude de cada resposta de incremento não é maior que um terço da amplitude combinada de todos os 10 incrementos, representando a amplitude total da resposta final. Se este critério não for satisfeito, repetir a medição das 10 respostas incrementais.
        NOTA: O limite de um terço é baseado na suposição de que cada resposta incremental representa a ativação de uma única unidade motora. Se a amplitude de qualquer resposta incremental exceder um terço da amplitude combinada de todos os dez incrementos, isso sugere que a resposta pode não ser exclusivamente atribuível à ativação de uma única unidade motora. Em vez disso, pode ser influenciado pelo recrutamento de unidades motoras adicionais ou pela presença de atividade inespecífica, como ruído elétrico ou artefatos22,26.
      6. Para estimar a amplitude média dos SMUPs, calcule a média dos valores dos 10 incrementos. Outro método para medir a amplitude média do SMUP é dividir toda a amplitude da resposta incremental final pelo número total de incrementos11.
    3. Determine o MUNE dividindo a amplitude máxima do CMAP (pico a pico) pela amplitude média do SMUP (pico a pico). Em certos sistemas eletrofisiológicos, os SMUPs são registrados em microvolts (μV), enquanto o CMAP é geralmente expresso em milivolts (mV). Se necessário, converta as medições CMAP e SMUP para as mesmas unidades antes de calcular o MUNE.
      NOTA: CMAP pico a pico, SMUP médio e MUNE são normalmente calculados automaticamente por sistemas de eletromiografia clínica):
      figure-protocol-1
      CMAP = Potencial de Ação Muscular Composto
      SMUP = Potencial de Unidade de Motor Único
      MUNE = Estimativa do Número de Unidades Motoras

Resultados

As técnicas CMAP, SMUP e MUNE descritas neste relatório permitem o registro da função neuromuscular no músculo diafragma empregando a colocação de eletrodos minimamente invasivos (Figura 1). Os parâmetros de amplitude e área podem ser empregados para caracterizar o tamanho supramáximo do CMAP, fornecendo uma medida global da produção do grupo muscular (Figura 2). No entanto, em nossos métodos atuais, contamos com a amplitude para quantificar os tamanhos CMAP e SMUP. CMAP, SMUP e MUNE podem ser utilizados para medir a função neuromuscular em vários modelos de doença neuromuscular em ratos. Para demonstrar a perda de MU no contexto da degeneração do NM, os ratos foram submetidos a injeção intrapleural bilateral com CTB-SAP (25 μg) para atingir NMs frênicos e CTB extra (25 μg), e os ratos controle receberam CTB não conjugado (25 μg) e SAP (25 μg)1,27.

Na Figura 3, são comparados os achados em um rato controle adulto e um rato adulto (12 semanas) sete dias após a injeção intrapleural de CTB-SAP. Após a injeção intrapleural de CTB-SAP, o MONE é reduzido em 60 unidades motoras funcionais estimadas em comparação com os achados normais de 74 unidades motoras funcionais no rato controle. No entanto, a amplitude do CMAP no rato CTB-SAP (14,25 mV pico a pico) exibiu alterações mínimas em comparação com o controle (14,5 mV pico a pico) provavelmente devido à brotação colateral. Na Figura 4, CMAP diafragmático, SMUP e MUNE foram adquiridos bilateralmente e calculados em média no início do estudo/pré-injeção (n = 14), bem como 7 (n = 14), 14 (n = 14), 21 (n = 6) e 28 (n = 14) dias após a injeção. Na Figura 4, não foram encontradas diferenças basais entre os grupos. O MUNE apresentou uma mudança significativa para o tempo (p < 0,05), CTB-SAP (p < 0,001) e tempo de interação x CTB-SAP (p < 0,01) com redução de ~40% do MUNE em ratos CTB-SAP. O SMUP médio dos ratos CTB-SAP demonstrou uma mudança significativa com o tempo (p < 0,05) e CTB-SAP (p < 0,01), mas nenhuma interação significativa com aumento de ~ 50-60% na amplitude do SMUP. O CMAP não apresentou alteração significativa.

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Figura 1: Colocação do eletrodo. O cátodo estimulante (A) e o ânodo (B) são inseridos subcutaneamente na lateral do pescoço entre os músculos escaleno anterior e médio a aproximadamente 1 cm de distância. O (C) eletrodo "ativo" (E1) e (D) o eletrodo de registro "referência" (E2) são posicionados sobre a linha hemiclavicular inferior à última borda da costela, seguindo o ângulo entre o apêndice xifóide e a última cartilagem costoesternal. Além disso, (E) um eletrodo de disco descartável está situado na cauda como um aterramento para minimizar os artefatos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Potencial de ação muscular composto. Uma ilustração de uma resposta representativa da CMAP registrada no músculo da cúpula diafragmática esquerda. A amplitude pico a pico do CMAP é determinada da tensão de pico negativa para a tensão de pico positiva. Abreviatura: CMAP = Potencial de ação muscular composto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Dois registros representativos de CMAP e MUNE de um rato controle e um rato adulto sete dias após a injeção intrapleural de CTB-SAP. (A) Potencial de ação muscular composto frênico esquerdo (CMAP) em um rato adulto controle (12 semanas de idade) com amplitude pico a pico de 14,5 mV. Sensibilidade da tela = 1 mV/divisão e duração da tela 1 ms/divisão. (B) Dez respostas incrementais subsequentes com uma amplitude total de 1,940 mV são divididas por 10 para determinar o tamanho médio do SMUP (0,194 mV). Sensibilidade da tela = 0,2 mV/divisão e velocidade de varredura de 1 ms/divisão. MUNE calculado = 74 (MUNE=CMAP/SMUP médio (14,5 mV/0,194 mV)) (C) CMAP frênico sete dias após a injeção de CTB-SAP mostrando quase nenhuma alteração na amplitude pico a pico do CMAP 14,25 mV. Sensibilidade da tela = 1 mV/divisão e velocidade de varredura de 1 ms/divisão. (D) Dez respostas incrementais subsequentes com uma amplitude total pico a pico de 2,360 mV dividida por 10 para obter um tamanho médio de SMUP de 0,236 mV. Sensibilidade da tela = 0,2 mV/divisão e uma velocidade de varredura de 1 ms/divisão. Assim, o MUNE calculado foi de 60. Abreviaturas: CMAP = potencial de ação muscular composto; MUNE = estimativa do número de unidades motoras; CTB-SAP = fragmento B da toxina da cólera conjugado à saporina; SMUP = potencial de unidade motora única. * Ilustra o artefato causado pela estimulação elétrica; é importante notar que, devido ao contraste entre a amplitude do estímulo elétrico e o CMAP, bem como as respostas incrementais, representamos graficamente apenas uma parte do estímulo. Cores amigáveis de cor cega foram utilizadas para melhorar a visualização das respostas incrementais para melhorar a acessibilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Avaliação eletrofisiológica de CMAP, SMUP e MUNE após CTB-SAP. Não foram encontradas diferenças basais entre os grupos (sete ratos machos de 11 semanas de idade nos grupos CTB-SAP e controle). (A) O CMAP não mostrou nenhuma mudança significativa. (B) O SMUP médio dos ratos CTB-SAP apresentou uma mudança significativa ao longo do tempo (p < 0,05) e com o CTB-SAP (p < 0,01), sem interação significativa, indicando um aumento de 50-60% na amplitude do SMUP. (C) Sete dias após a injeção de CTB-SAP, o MUNE médio diminuiu significativamente em 27,07%, de 102,58 ± 20,54 para 72,43 ± 15,59 unidades motoras funcionais estimadas (Média ± DP). Essa redução persistiu, com um declínio adicional de 11,75% em 28 dias (MUNE: 60,64 ± 11,33, p < 0,01). Todas as medições no início do estudo, 7, 14 e 28 dias após a injeção foram obtidas de 14 ratos, com n = 7 ratos injetados com CTB-SAP conjugado e n = 7 ratos recebendo CTB e SAP não conjugados como grupo controle. Seis ratos foram utilizados no dia 21. Os dados de CMAP, SMUP e MUNE são apresentados como média, e as comparações foram realizadas usando ANOVA de duas vias. Os asteriscos indicam diferenças em vários momentos: *p < 0,05 e **p < 0,01. Abreviaturas: CMAP = potencial de ação muscular composto; MUNE = estimativa do número de unidades motoras; CTB-SAP = fragmento B da toxina da cólera conjugado à saporina; SMUP = potencial de unidade motora única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nas doenças degenerativas do NM, como a ELA, é crucial avaliar as MUs envolvidas na ventilação28. Apesar da ocorrência de degeneração respiratória do NM em pacientes com ELA, o início específico e a progressão da morte por NM permanecem incompletamente compreendidos 29,30,31. Reconhecendo a importância desse aspecto, vários modelos, tanto de base genética (por exemplo, SOD1 2,32) quanto não genéticos (por exemplo, injeção intrapleural CTB-SAP 3,27,33), têm sido empregados para emular o comprometimento respiratório em modelos animais de doenças neurodegenerativas. Assim, identificar um biomarcador para diagnosticar, monitorar e avaliar os efeitos potenciais do tratamento é vantajoso para esses modelos. Além disso, os biomarcadores podem facilitar a tradução clínica dos resultados da pesquisa pré-clínica.

Para quantificar o número de MNs inervantes em modelos degenerativos de roedores, diferentes técnicas de marcação, incluindo traçadores retrógrados e adenovírus, foram empregadas 25,34,35,36. Anteriormente, a imuno-histoquímica foi utilizada para marcar neurônios motores frênicos no corno anterior da medula espinhal cervical 2,3,33. As técnicas de rotulagem, embora valiosas para avaliações de NM, têm limitações na avaliação da funcionalidade das MUs e não são adequadas para avaliações longitudinais37. Avaliações eletrofisiológicas objetivas são cruciais para o sucesso da tradução entre espécies, especialmente considerando diferenças estruturais pronunciadas nas características funcionais e anatômicas dos sistemas motores entre humanos e roedores38,39. A incorporação de diferenças neurobiológicas apresenta um desafio na tradução de achados de modelos de roedores para os pacientes. O MUNE supera esses obstáculos servindo como uma medida eletrofisiológica objetiva da função do MN, permitindo a avaliação da conectividade funcional do MU como um biomarcador em experimentos de modelo degenerativo do MN 3,40.

CMAP, SMUP e MUNE são comumente empregados em pesquisas e na avaliação de pacientes com distúrbios neuromusculares 9,10,11. Esses biomarcadores potenciais são minimamente invasivos, permitindo a avaliação longitudinal da função dentro do mesmo indivíduo ao longo do tempo. É importante ressaltar que, embora não avaliem diretamente a ativação ou recrutamento da MU por MNs corticais, eles fornecem uma estimativa clinicamente relevante da integridade da MN e de sua contraparte funcional, a MU. Modelos de roedores de doenças degenerativas da NM são cruciais para a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes às doenças humanas e para o avanço pré-clínico de tratamentos eficazes. O desenvolvimento de medidas de resultados e biomarcadores traduzíveis entre espécies pode agilizar e agilizar a tradução de achados pré-clínicos promissores para ensaios clínicos11. Dada a relativa complexidade das medidas, adaptamos e refinamos essas técnicas de membros de ratos para o músculo diafragma. Esta tradução foi apresentada em um formato visual para facilitar uma utilização e implementação mais amplas em estudos com ratos.

Pela nossa experiência, os sistemas eletrodiagnósticos clínicos são adequados para os estudos descritos neste contexto. Essa adequação decorre da ergonomia aprimorada na interface entre o examinador e o sistema de eletrodiagnóstico, facilitando o controle conveniente. Em nosso grupo de laboratório, utilizamos um sistema de dois canais com dois canais amplificadores não comutados. Esses canais são equipados com um conversor analógico para digital de 24 bits e operam a uma taxa de amostragem de 48 kHz por canal. O ganho de hardware é ajustável dentro de uma faixa de 10nV a 100 mV por divisão. Empregamos um filtro de baixa frequência com uma faixa de 0,2 Hz a 5 kHz, e as configurações de filtro de alta frequência cobriram uma faixa de 30 Hz a 10 kHz. Além disso, utilizamos um estimulador de corrente constante com intensidade ajustável variando de 0 a 100 mA e duração de 0,02 a 1 ms. A maioria dos sistemas clínicos oferece recursos comparáveis que são adequados para registrar respostas CMAP, SMUP e MUNE. Esses sistemas podem ser ajustados de acordo para garantir o registro preciso dos dados desejados. Por exemplo, a amplitude do CMAP pode ser avaliada de base a pico e pico a pico. Os sistemas de eletrodiagnóstico clínico são frequentemente padronizados para avaliar a base ao pico, que é calculada a partir da linha de base isoelétrica até o pico negativo inicial.

O processo de obtenção de respostas CMAP, SMUP e MUNE do diafragma envolve várias etapas cruciais. A colocação consistente e precisa do eletrodo, juntamente com a profundidade adequada do eletrodo, é essencial para medir amplitudes de forma confiável e minimizar ruídos de fundo durante a gravação. A colocação incorreta de eletrodos estimulantes pode levar a consequências não intencionais. A colocação de eletrodos estimulantes muito posteriormente pode resultar em contrações musculares exageradas do membro anterior para excitação do plexo braquial, enquanto a colocação acima do nível C4 pode dificultar a estimulação do nervo frênico. A colocação mais profunda acarreta o risco de ferir a artéria carótida ou evocar o nervo vago, potencialmente causando problemas de condutividade cardíaca. Colocando eletrodos de registro mais altos ou mais baixos que a última costela, podem ocorrer medidas de estimulação intercostal ou reto abdominal, respectivamente. Para evitar o registro de outros músculos, observe que o pico negativo do diafragma da latência do CMAP é tipicamente de 1,5 a 3,5 ms, e sua forma característica é mostrada na Figura 2. Nossas observações indicaram que os eletrodos de agulha produzem registros CMAP, SMUP e MUNE mais consistentes em comparação com os eletrodos em forma de disco para o músculo diafragma. Essa consistência aumentada é atribuída à forma de cúpula do músculo diafragma e à presença de outros músculos próximos, como os músculos intercostais e retos abdominais. Além disso, a colocação flexível dos eletrodos da agulha é outro fator vantajoso. Em relação à intensidade da estimulação elétrica, utilizamos uma faixa de 60 a 100 mA para estimular o nervo frênico, o que excede as faixas relatadas para outros sistemas motores. Essa diferença decorre da localização mais profunda do nervo frênico no pescoço em comparação com as localizações mais superficiais do nervo ciático e do plexo braquial no membro posterior e no membro anterior, respectivamente.

A obtenção do SMUP médio apresenta maiores desafios técnicos em comparação com o CMAP. O tamanho menor da resposta, na faixa de microvolts em vez de milivolts, torna o impacto do ruído de fundo mais pronunciado. Para mitigar o ruído de fundo, considere otimizar o posicionamento do eletrodo ajustando o eletrodo de aterramento, o cátodo e o ânodo. Além disso, certifique-se de que haja interferência mínima de dispositivos elétricos próximos na configuração experimental. Uma gaiola de Faraday, comumente utilizada em aplicações de eletrofisiologia intracelular, não é necessária para essa configuração. A identificação visual de respostas individuais de SMUP é uma habilidade desafiadora que requer prática para resultados consistentes e repetíveis. Como o diafragma é um músculo dinâmico, a linha de base pode mudar a cada ciclo de ventilação. Estar atento aos incrementos do SMUP, garantindo o alinhamento com o SMUP anterior, é um fator crítico para superar esse desafio. Além disso, garantir que os SMUPs sejam iniciados dentro do período de latência do CMAP máximo é importante para gravações precisas.

Outro desafio do registro diafragmático é a natureza assimétrica desse músculo, caracterizado por espessuras variadas da esquerda para a direita e influenciado pela pressão exercida pelo fígado do lado direito41. Para resolver isso, realizamos medições eletrofisiológicas separadamente nas membranas diafragmáticas esquerda e direita. Em seguida, calculamos as médias das respostas CMAP, SMUP e MUNE separadamente.

Como a resposta do CMAP reflete a despolarização coletiva das fibras musculares em um músculo específico, qualquer patologia que afete o NM frênico para a fibra muscular do diafragma pode resultar em uma redução no tamanho do CMAP. Portanto, o cálculo da média da CMAP de hemidiafragmas bilaterais oferece uma excelente avaliação do estado funcional geral do sistema neuromuscular respiratório. Alterações compensatórias, como brotamento colateral, podem levar à preservação do tamanho do CMAP mesmo na presença de NM ou perda axonalmotora 11. O registro de incrementos individuais permite estimar a produção média de MUs individuais (tamanho SMUP), apresentando informações mais detalhadas sobre o estado funcional das MUs do sistema respiratório. Assim, a técnica MUNE torna-se essencial para avaliar os MNs frênicos ou a entrada dos axônios no diafragma. A aplicação desses biomarcadores em experimentos pré-clínicos de terapias para o estudo de doenças de NM tem o potencial de melhorar a tradução para ensaios clínicos.

Divulgações

A WDA recebeu financiamento de pesquisa da NMD Pharma, Avidity Biosciences e honorários de consultoria da NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals e Novartis.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Missouri (NLN e WDA).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de Vidro de 2 mLKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, Modelo 705 RN seringaHamilton Company7637-01Utilizada para realizar injeção intrapleural
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Agulhas autoclaváveis de 26 G (26S RN 9,52 mm 40°)Hamilton Company7804-04Utilizado para realizar injeção intrapleural
Subunidade B da toxina da cólera (CTB)MilliporeSigmaC9903Utilizado para injeção intrapleural para rotular neurônios motores sobreviventes
Subunidade B da toxina da cólera conjugada à saporina (CTB-SAP)Sistemas Avançados de DirecionamentoIT-14Utilizado para injeção intrapleural para causar a morte do neurônio motor
Cabo destacávelTechnomed202845-0000para conectar o eletrodo do gravador à máquina de eletrodiagnóstico
Eletrodo de disco descartável de 2" x 2" com eletrodosCadwell302290-000eletrodo de aterramento
agulhas monopolares descartáveis 28 GTechnomed202270-000eletrodos estimulantes de cátodo e ânodo - eletrodos de gravação
Cabo de agulha EMG (caixa de comutação Amp/stim)Cadwell190266-200para conectar eletrodos monopolares ao estimulador eletrodiagnóstico
Helping Hands garra jacaré com base de ferroRadio Shack64-079Mantendo a colocação do eletrodo de gravação 
Isoflurano (frasco de 250 mL)Piramal Healthcare
Covidien81412012utilizado para aplicação de gel de eletrodo
Sistema de Monitoramento Fisiológico PhysioSuite com Aquecimento Homeotérmico RightTempKent Scientific CorporationPS-RTInclui almofada de aquecimento infravermelho, sonda retal e sonda de temperatura da almofada
Aparador Pro Pet Kit de limpezaOster078577-010-003tosquiadeiras para depilação
Saporin (SAP)Advanced Targeting SystemsPR-01Utilizado para injeção intrapleural (agente de controle quando injetado por si só)
Sistema Sierra Summit EMGCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAsistema de eletrodiagnóstico portátil
SomnoSuite Sistema de anestesia digital de baixo fluxoKent Scientific CorporaçãoSOMNOInclui adaptador de tampa de garrafa anti-derramamento e anti-vapor; Tubulação do adaptador de Y; filtro de carvão
Sprague-Dawley ratEnvigo colony 208a, Indianápolis, IN
Pomada oftálmica veterinária à base de petróleo Puralube26870aplicado durante a anestesia para evitar lesões na córnea
Seringa de irrigação de ponta curva monojeto

Referências

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