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Artigo de método

Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

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DOI:

10.3791/66570

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10 de maio de 2024

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1Institute of Animal Science, University of Hohenheim, 2HoLMiR - Hohenheim Center for Livestock Microbiome Research, University of Hohenheim

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Resumo

O trato gastrointestinal (TGI) do frango é um ecossistema complexo que abriga trilhões de micróbios que desempenham um papel fundamental na fisiologia, digestão, absorção de nutrientes, maturação do sistema imunológico e prevenção da intrusão de patógenos do hospedeiro. Para uma ótima saúde e produtividade animal, é imperativo caracterizar esses microrganismos e compreender seu papel. Embora o TGI das aves contenha um reservatório de microrganismos com potenciais aplicações probióticas, a maior parte da diversidade permanece inexplorada. Para melhorar nossa compreensão da diversidade microbiana não cultivada, são necessários esforços conjuntos para trazer esses microrganismos para a cultura. O isolamento e o cultivo de microrganismos colonizadores de TGI produzem material reprodutível, incluindo células, DNA e metabólitos, oferecendo novos insights sobre os processos metabólicos no ambiente. Sem cultivo, o papel desses organismos em seus ambientes naturais permanece obscuro e limitado a um nível descritivo. Nosso objetivo é implementar estratégias de cultivo destinadas a melhorar o isolamento de uma gama diversificada de micróbios anaeróbios do TGI do frango, alavancando o conhecimento multidisciplinar da fisiologia animal, nutrição animal, metagenômica, bioquímica alimentar e estratégias modernas de cultivo. Além disso, pretendemos implementar o uso de práticas adequadas para amostragem, transporte e preparação de meios, que são conhecidas por influenciar o sucesso do isolamento. Metodologias apropriadas devem garantir um ambiente consistente e livre de oxigênio, condições atmosféricas ideais, temperatura de incubação do hospedeiro apropriada e provisão para requisitos nutricionais específicos em alinhamento com suas necessidades distintas. Ao seguir essas metodologias, o cultivo não apenas produzirá resultados reprodutíveis para isolamento, mas também facilitará os procedimentos de isolamento, promovendo assim uma compreensão abrangente do intrincado ecossistema microbiano dentro do GIT do frango.

Introdução

O ressurgimento do cultivo no estudo de microrganismos complementou os insights dos estudos metagenômicos, fornecendo material para testar hipóteses metabólicas que antes eram apenas parcialmente descritas e quantificadas. O cultivo de bactérias intestinais fornece material para sustentar pesquisas futuras sobre interações microbianas-hospedeiras, facilitar estudos de colonização direcionados e melhorar os estudos de interação molecular 1,2,3. O conhecimento adquirido sobre microrganismos gastrointestinais melhorou a nutrição e o bem-estar animal, influenciando as formulações dietéticas e aumentando a disponibilidade de nutrientes4. Esse entendimento contribuiu para melhorias de desempenho na utilização da interação prebiótica e probiótica. No entanto, pesquisas aprofundadas são necessárias para obter uma compreensão completa de como as condições bioquímicas e físico-químicas interagem e afetam o perfil microbiano e sua estrutura. Para atingir esse objetivo, o cultivo continua sendo imperativo, servindo como uma ferramenta crucial para aprofundar a intrincada dinâmica das comunidades microbianas no ambiente gastrointestinal.

Em contraste com a extensa pesquisa sobre micróbios associados ao intestino humano e estudos clínicos de cultivo5, os relatórios sobre microrganismos da pecuária utilizaram predominantemente uma gama limitada de meios para isolamento, potencialmente restringindo a diversidade de isolados 2,3. Além disso, melhorias na formulação de meios e estudos sobre a interação de fosfato e sais com ágar, conforme elucidado por Tanaka et al. e Kawasaki et al., ainda não foram implementados para estudos de microbioma intestinal 6,7,8,9.

Considerada uma substância semi-essencial, o mio-inositol (IM) tem sido relatado como desempenhando um papel fundamental em diversos processos metabólicos, fisiológicos e regulatórios10,11. Estes incluem envolvimento na mineralização óssea, desenvolvimento do músculo mamário, sinalização celular, promoção da ovulação e fertilidade, modulação da sinalização neuronal e atuação como regulador da homeostase da glicose e regulação da insulina em aves10,11. O IM desempenha um papel como precursor por meio de sua interconversão em processos bioquímicos essenciais, incluindo o processo de glicólise / gliconeogênese, o ciclo do ácido cítrico e a via da pentose fosfato. Além disso, também serve como precursor do fosfatidilinositol (PI), que está ainda mais envolvido no metabolismo glicerofosfolipídeo12. Poucas investigações relataram que a metabolização do IM leva a alterações na estabilidade óssea e no desempenho animal. Isso inclui melhorias na taxa de conversão alimentar e ganho de peso corporal, demonstrando seu impacto após a absorção e utilização dentro do animal13,14. No entanto, a via de metabolização do IM e seu impacto no metabolismo das aves permanece indefinida15. Além disso, poucos estudos propõem um papel potencial das bactérias na utilização do IM, particularmente em regiões de alta atividade metabólica, como o íleo 16,17,18,19.

Os esforços no cultivo de bactérias a partir do TGI de animais visam aprimorar os bancos de dados genômicos e expandir a pesquisa, verificar hipóteses baseadas no genoma e entender a importância ecológica desses recursos20. O objetivo deste trabalho é melhorar as estratégias de cultivo bacteriano a partir do TGI de frango para aumentar a diversidade de isolamento e o isolamento direcionado de um grupo ecológico de interesse que assimila e metaboliza o mio-inositol.

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Protocolo

O protocolo é dividido em quatro partes: amostragem, isolamento bacteriano, identificação e preservação dos microrganismos obtidos. As permissões aprovadas para o uso de animais foram emitidas pela comissão de ética do Regierungspräsidium Tübingen, Alemanha, com os números de aprovação HOH50/17 TE e HOH67-21TE.

1. Obtenção de amostras para o cultivo de bactérias anaeróbias

  1. Manutenção de animais
    1. Manter os animais em uma dieta comercial ad libitum à base de milho (Legehennen / Junghennenfutter; ver Tabela de Materiais) e abrigar na estação experimental da Universidade de Hohenheim.
  2. Preparação da solução de transporte
    1. Aos 1-2 dias antes da coleta da amostra, prepare a solução de transporte contendo 1,00 g/L de tioglicolato de sódio, 0,10 g/L de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2,2H 2O) e 0,5% de cisteína21 e 0,1% de solução de resazurina sódica.
    2. Ajuste o pH do meio para 6,0 ± 0,2 a 25 °C e autoclave a 121 °C por 15 min a 15 psi de pressão.
    3. Depois de o meio ter arrefecido até cerca de 50 °C, volte a colocar a tampa do frasco de meio com uma tampa de rosca estéril com um orifício e uma rolha de borracha. Insira duas agulhas de seringa estéreis na rolha de borracha em posições diferentes e fixe um filtro de seringa hidrofóbico (0,22 μm) em uma das agulhas.
      NOTA: A substituição das tampas e a inserção das agulhas e do filtro devem ser realizadas dentro de um fluxo de ar laminar (LAF).
    4. Conecte o tubo de nitrogênio 100% (N2) ao filtro da seringa e espalhe o gás N2 no frasco por 10 min a 1 psi.
    5. Em seguida, transfira o frasco médio e os tubos Hungate estéreis para a estação anaeróbica e transfira assepticamente o meio de transporte para os tubos Hungate. Encha completamente os tubos Hungate até o topo, garantindo a ausência de ar no interior.
  3. Abate e colheita de amostras
    1. Durante o processo de abate, mantenha as condições axênicas para evitar contaminação usando luvas, máscara, avental de laboratório de plástico e instrumentos cirúrgicos estéreis durante todo o procedimento. Além disso, higienize adequadamente a bancada de trabalho usando etanol e lenços de papel para manter um ambiente estéril.
    2. Na estação experimental, anestesiar 10 poedeiras Lohmann de 50 semanas usando uma mistura de gás engarrafado consistindo de 35% de N2, 35% de CO2 e 30% de O2 e decapitá-las imediatamente.
      NOTA: A anestesia e o sacrifício devem ser conduzidos por um técnico de animais de laboratório bem versado em bem-estar animal e procedimentos científicos. Isso garante que o procedimento de sacrifício esteja de acordo com os padrões éticos, regulamentos legais e diretrizes de segurança.
    3. Antes de prosseguir com a dissecção da secção GIT, fixe o segmento intestinal necessário, nomeadamente a cultura, o íleo e o jejuno, utilizando um hemostático de Kelly estéril (também conhecido como pinça de Kelly; Figura 1).
      NOTA: A dissecação do animal deve ser realizada por um veterinário ou por uma pessoa bem treinada que esteja familiarizada com a anatomia das galinhas.
    4. Transfira cada seção individual para um tubo Hungate separado cheio de meio de transporte e feche a tampa corretamente. Se necessário, adicione meio de transporte extra ao tubo para deslocar o ar restante.
      NOTA: A transferência da seção é uma etapa crucial e é essencial minimizar qualquer atraso ou abertura da seção para evitar a exposição prolongada ao oxigênio
  4. Transporte de amostra
    1. Manuseie o transporte dos tubos Hungate com cuidado, colocando-os dentro de uma caixa de isopor para evitar qualquer risco de quebra. Caso a temperatura exterior seja inferior a 15 °C, manter a temperatura da amostra utilizando compressas quentes. Certifique-se de que o tempo de transporte não exceda 4 h.
    2. Transfira os tubos cuidadosamente dentro da estação anaeróbica para posterior processo.

2. Isolamento de bactérias anaeróbias

  1. Preparação de meios de cultura
    NOTA: O método descrito apresenta várias considerações para a preparação de meios de cultura. A Tabela 1 ilustra um exemplo de como as soluções são divididas para o isolamento diversificado de microrganismos.
    1. Divida os ingredientes da formulação do meio a ser usado em quatro grupos de solução: fonte de carbono, fonte de nitrogênio, ágar e fonte mineral. Para meios ricos como a infusão cérebro-coração (BHI), a separação nem sempre é possível (ver exemplo do meio 2 na Tabela 1). Nesses casos, assegure a preparação separada e a autoclavagem do ágar ou de soluções adicionais.
    2. Prepare asolução de carboidratos em 1/4 do volume final de meio necessário, por exemplo, em 250 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 2 g de dextrose e 0,5 g de amido em 250 mL de água destilada.
    3. Prepare asolução de proteína em 1/4 do volume final de meio necessário, por exemplo, em 250 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 10 g de peptona em 250 mL de água destilada.
    4. Prepare a solução de ágar em 45% a 48% do volume final do meio, por exemplo, em 450 a 480 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 15 g de ágar em 450 a 480 mL de água destilada.
    5. Prepare a solução mineral no volume esquerdo de 20 a 50 mL de meio quando o volume final do meio for de 1 L. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolva 0,5 g de K2HPO4 em 20 a 50 mL de água destilada.
    6. Autoclave a solução proteica, a solução de ágar e as soluções minerais a 121 °C por 15 min a 21 psi de pressão. Autoclave a solução de carboidratos a 110 °C por 30 min a 5 psi.
    7. Quando todas as soluções estiverem estéreis, arrefecê-las até 50 °C e misturar em condições estéreis num frasco de vidro autoclavado adequado com uma tampa com um orifício e uma rolha de borracha. Depois disso, siga as etapas 1.2.3 e 1.2.4.
      NOTA: A mistura das soluções deve ser feita dentro de um LAF.
    8. Depois que o meio for misturado e desgaseificado, despeje em placas ou tubos de Petri estéreis dentro da estação anaeróbica.
  2. Isolamento de bactérias anaeróbias
    NOTA: A metodologia a seguir explica uma estratégia de isolamento para cultivar uma ampla gama de bactérias anaeróbicas que habitam o trato digestivo do frango.
    1. Transferir as amostras para uma estação anaeróbia contendo uma mistura de gases engarrafados composta por 80% de N2 (nível de qualidade 5,0), 15% de CO2 (nível de qualidade 3,0) e 5% de H2 (nível de qualidade 5,0) fornecida por um fornecedor comercial (ver Quadro de Materiais).
    2. Dentro da estação anaeróbica, transfira a seção do tubo suspenso para a placa de Petri estéril usando uma pinça autoclavada.
    3. Corte cuidadosamente a seção usando uma tesoura estéril e extraia aproximadamente 1 g de conteúdo de digesta do segmento intestinal usando uma espátula estéril.
      NOTA: Depois de tomar 1 g de conteúdo de digesta, descarte e transfira a digesta restante para seu respectivo tubo de meio de transporte para o isolamento direcionado.
    4. Realize uma diluição seriada de 10 vezes usando uma solução fisiológica estéril (NaCl 0,85%).
    5. Dispense 0,1 mL da amostra das diluições 10−4 a 10−7 em placas de mídia de placas de Petri estéreis e devidamente rotuladas e espalhe com um espator Drigalski estéril.
    6. Incubar as placas no interior da estação anaeróbica durante 24–48 h a 39 °C.
      NOTA: Ao incubar dentro de uma incubadora, transfira as placas de Petri para uma caixa hermética antes de retirá-las da estação anaeróbica.
  3. Isolamento direcionado de um grupo bacteriano específico.
    NOTA: A metodologia a seguir explica uma estratégia de isolamento para bactérias anaeróbicas que podem potencialmente assimilar o IM.
    1. Para a preparação de meio de enriquecimento, meio de ágar mínimo e meio de caldo mínimo, siga a composição especificada na Tabela 2 e na Tabela 3, seguindo as diretrizes descritas na etapa 2.1. Adicione 0,2 mL / L de mistura de vitaminas estéreis por filtro (conforme descrito na composição) em meio de ágar mínimo e meio de caldo mínimo após o processo de autoclavagem.
    2. Homogeneizar a amostra inicial usando um misturador de vórtice por 10-15 s. Em seguida, transfira a amostra homogeneizada para o tubo contendo o meio de enriquecimento a uma taxa de 5% (por exemplo, se o volume do meio de enriquecimento for de 10 mL, inocule 0,5 mL de amostra homogeneizada) usando uma pipeta. Incubar a amostra recém-inoculada durante 24 h a 39 °C no interior da estação anaeróbia.
    3. Após a incubação, misture bem o tubo enriquecido usando um misturador de vórtice por 10-15 s ou pipetando. Em seguida, transferir a amostra misturada para um meio de caldo mínimo estéril a uma taxa de 5% e depois incubar durante 24 h a 39 °C.
    4. Dilua as amostras em série em solução salina estéril (ou seja, NaCl a 0,85%), começando com uma diluição de 1:10 e continuando até a diluição de 1:1000. Após cada diluição, homogeneizar bem a amostra à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice por 10-15 s ou por pipetagem.
    5. Em condições estéreis e anaeróbicas, transferir 1 ml de amostra diluída para uma placa de Petri. Despeje aproximadamente 15-20 mL de meio de ágar mínimo derretido na placa de Petri e gire suavemente horizontalmente para uma mistura uniforme.
      NOTA: A temperatura do ágar deve ser de cerca de 45 °C para que não haja grumos e para evitar que a amostra seja morta pelo calor. O vazamento médio deve ser feito em condições anaeróbicas.
    6. Após a solidificação do ágar, incubar as placas de Petri durante 24 h a 39 °C na posição invertida dentro de uma estação anaeróbia ou em incubadora. Após 24 h de incubação, as colônias bacterianas aparecem como pequenos pontos distintos embutidos no meio.
      NOTA: Ao incubar a placa de Petri dentro de uma incubadora, transfira as placas para uma caixa hermética antes de retirá-las da estação anaeróbica.
    7. Usando uma alça de inoculação estéril, escolha cuidadosamente a colônia bacteriana individual e transfira-a para tubos separados de meio de caldo mínimo.
    8. Após a transferência das colônias para tubos individuais, incubar anaerobicamente os tubos inoculados a 39 °C por 24 h. Após a incubação, o aumento da turbidez no meio indicará o crescimento bacteriano.
      NOTA: Sempre que antes de transferir os frascos de mídia para dentro da estação anaeróbica, eles devem ser desgaseificados conforme mencionado anteriormente na etapa 2.1.7. As etapas 2 a 8 devem ser realizadas dentro da estação anaeróbica.

3. Identificação de bactérias anaeróbias

  1. Extrair DNA de culturas de 24 h a 48 h de tempo de incubação, seguindo um protocolo de lise enzimática22.
  2. Centrifugar a cultura a 3000 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante com uma pipeta.
  3. Lave o pellet 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) suspendendo em 2 mL de PBS. Homogeneizar a amostra usando um misturador de vórtice por 10-15 s. Repetir a etapa de centrifugação a 3000 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
  4. Suspenda o pellet celular em 0,2 mL de PBS pH 7,4 e incube a 50 ° C com 1 U de lisozima e 1 U de mutanolisina recombinante por 30 min, seguido por uma incubação de 30 min a 56 ° C com 5 μL de proteinase K.
  5. Adicione 4 μL de unidade de RNAseA a cada tubo e incube em temperatura ambiente por 10 min. Tubos de centrífuga a 21168 x g por 1 min. Recupere o sobrenadante e purifique usando esferas magnéticas.
  6. Realize a quantificação do DNA com um método fluorométrico de acordo com as instruções do fabricante para o kit de quantificação de dsDNA (mencionado na Tabela de Materiais).
    NOTA: O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C.
  7. Use amostras de DNA como modelos para amplificação por PCR usando os primers 27f e 1492r23 seguindo as condições mostradas na Tabela 4. Para garantir que a reação de PCR foi bem-sucedida, execute a eletroforese em gel de agarose de acordo com o método padrão de eletroforese em gel de agarose usando tampão 1X TAE e 1% de agarose.
  8. Purifique o produto de PCR usando um kit de purificação de PCR comercial para se livrar de primers, nucleotídeos e outros contaminantes.
  9. Envie o produto de PCR para sequenciamento Sanger para o provedor de serviços de sequenciamento adequado.
    NOTA: Juntamente com o sequenciamento, os provedores de serviços também podem fornecer serviços, incluindo purificação do produto PCR com taxas extras. Os produtos de PCR podem ser armazenados a 4 °C ou a -20°C.
  10. Depois de obter os resultados do sequenciamento no formato FASTA junto com o arquivo de cromatograma (geralmente no formato ABI ou SCF), analise as sequências usando ferramentas de bioinformática. Use o software de análise de sequência para abrir e visualizar o arquivo do cromatograma.
    NOTA: A qualidade geral do cromatograma foi verificada com base em picos claros e distintos sem ruído excessivo
  11. Compare amplicons e alinhe-os com as espécies intimamente relacionadas no banco de dados de RNA ribossômico GenBank 16S não redundante do National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)24 e o banco de dados do genoma Refseq.
    NOTA: Ao usar o NCBI BLAST, copie toda a sequência FASTA na barra de pesquisa.

4. Preservação de culturas bacterianas puras

  1. Colha células bacterianas de uma cultura bem cultivada de 24 h a 48 h por centrifugação (3000 x g por 10 min) ou coleta de biomassa de uma cultura axênica em uma placa.
  2. Suspender a cultura bacteriana numa solução isotónica estéril adequada (NaCl 0,85%) e lavar centrifugando a solução bacteriana a 3000 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em um pequeno volume de solução isotônica estéril (0,5 mL). Para garantir a remoção de qualquer resíduo de meio de crescimento, repita 1x.
  4. Ressuspenda o pellet em 0,8 mL a 1 mL de concentrado de meio de cultura estéril e homogeneize com um misturador de vórtice por 5-10 s ou pipetando suavemente.
  5. Transfira 0,5 mL de suspensão celular para um criovial estéril e devidamente rotulado de 1 mL e adicione 0,5 mL de solução autoclavada de glicerol a 50%. Homogeneizar o criogénio utilizando um misturador de vórtice e conservar numa grelha de congelação a -80 °C (figura 3).
    NOTA: Todas as etapas antes de transferir os criogenianos para -80 °C devem ser feitas dentro da estação anaeróbica.

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Resultados

Monitoramento das condições anaeróbicas durante o transporte
Devido à adição de resazurina sódica, a mudança na cor da solução de transporte para rosa antes da transferência da amostra para o tubo indica uma interrupção ou falha na manutenção das condições anaeróbicas. Assim, os tubos com mudança de cor foram impedidos de serem usados durante o transporte e apenas os tubos sem mudança de cor foram usados, como pode ser visto na Figura 2.

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Discussão

O objetivo desta metodologia é melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas intestinais, melhorando a qualidade das condições de amostragem, processamento de amostras e formulação e preparação de meios. As condições físico-químicas das amostras (pH, disponibilidade de carbono, nitrogênio e cofatores) devem ser levadas em consideração na formulação dos meios de cultura. Em comparação com coleções de culturas bacterianas obtidas de porcos, humanos ou camundongos...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro ou pessoal concorrente relacionado ao trabalho relatado neste roteiro.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o programa de parceria Rehovot-Hohenheim e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Este projeto foi desenvolvido no âmbito da unidade de investigação P-FOWL (FOR 2601).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoVWR20104.334
ÁgarVWR97064-332
Cloreto de amônioCarl RothP726.1
Estação anaeróbicaDon Whitley ScientificA35 HEPA
Ácido butíricoMerck8.0045.1000
Cloreto de cálcio di-hidratado VWR97061-904
CentrífugaEppendorf5424R
Lisozima de frango (Muramidase)VWR1.05281.0010
CisteínaVWR97061-204
DextroseVWR90000-908
Hidrogenofosfato dipotássicoCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü sseldorf,Alemanha-MagAttract
HMW DNA KitQiagen67563
Cloreto de magnésioCarl Roth2189.1
Gás misto (80% N2 (nível de qualidade 5.0), 15% CO2 (nível de qualidade 3.0) e 5% H2 (nível de qualidade 5.0))Westfalen Gase GmbH,Alemanha-Mutanolisina
, recombinante (liofilizado)A& A Biotecnologia1017-10L
Mio-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Potássio dihidrogenofosfatoCarl Roth3904.2
Ácido propiônicoCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A Ribonuclease A (RNase A) QIAGEN 19101
Cloreto de sódioVWR27800.291
Resazurina de sódioVWR85019-296
Tioglicolato de sódioSigma-Aldrich102933
Peptona de soja, sem OGM, sem animaisVWR97064-186
TermocicladorBio-RadT100
TriptonaCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Mistura de vitaminas (suplemento)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Extrato de leveduraCarl Roth9257.05
β-D-FrutoseVWR53188-23-1

Referências

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