O método desenvolvido de marcação com 13C6-glicose combinado com espectrometria de massa de alta resolução por cromatografia líquida é versátil e estabelece as bases para estudos futuros sobre os órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, bem como a utilização abrangente desses metabólitos secundários.
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Artigo de método
13C6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este trabalho apresenta um método novo e eficiente para certificar órgãos primários envolvidos na síntese de metabólitos secundários. Como o metabólito secundário mais importante em Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mão. -Mzt. (PPY), a saponina de Paris (PS) tem uma variedade de atividades farmacológicas e o PPY está em demanda crescente. Este estudo estabeleceu quatro tratamentos com folhas, rizoma e feixes vasculares do caule 13C6-Glicose alimentando e não alimentando para certificar com precisão os órgãos primários envolvidos na síntese de saponinas Paris VII (PS VII). Ao combinar cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), as razões 13C/12C de folha, rizoma, caule e raiz em diferentes tratamentos foram calculadas com rapidez e precisão, e quatro tipos de razões de pico de íons isotópicos PS (M−) foram encontrados: (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− e (M+4) −/M−. Os resultados mostraram que a relação de 13C/12C nos rizomas dos tratamentos caule-vascular-feixe e alimentação do rizoma foi significativamente maior do que no tratamento não alimentar. Em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− nas folhas aumentou significativamente sob os tratamentos de alimentação com feixe vascular foliar e caule. Simultaneamente, em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− nas folhas sob tratamento com rizoma não apresentou diferença significativa. Além disso, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− no caule, raiz e risoma não mostrou diferenças entre os quatro tratamentos. Em comparação com o tratamento não alimentar, a razão da molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) −/M− nas folhas sob tratamento de alimentação foliar não mostrou diferença significativa, e a razão (M+3) −/M− das moléculas de PS II nas folhas sob tratamento de alimentação foliar foi menor. Os dados confirmaram que o órgão primário para a síntese do PS VII são as folhas. Ele estabelece as bases para a futura identificação dos órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais.
Introdução
As vias biossintéticas dos metabólitos secundários nas plantas são intrincadas e diversas, envolvendo órgãos de acumulação altamente específicos e diversos1. Atualmente, os locais de síntese específicos e os órgãos responsáveis pelos metabólitos secundários em muitas plantas medicinais não estão bem definidos. Essa ambigüidade representa um obstáculo significativo para o avanço estratégico e a implementação de métodos de cultivo projetados para otimizar o rendimento e a qualidade dos materiais medicinais.
Técnicas de biologia molecular, bioquímica e marcação de isótopos são amplamente empregadas para desvendar as via....
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Protocolo
1. Preparação experimental
- Certifique-se de que, durante o crescimento das plantas, a umidade relativa da estufa seja de 75%, as temperaturas dia/noite sejam de 20 °C/10 °C, o fotoperíodo seja composto de 12 h de dia e 12 h de noite e a intensidade da luz seja de 100 μmol·m-2·s-1. Forneça irradiância por meio de lâmpadas de diodo emissor de luz (LED), mantendo uma distância de 30 cm entre a lâmpada LED e a copa da planta.
NOTA: O fotoperíodo e a intensidade da luz estão de acordo com o número de horas de sol durante o período de crescimento em Yunnan. A irradiância é medida rotineiramente por um sensor quântico (cons....
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Resultados
Para confirmar que o fornecimento de 13C6-Glucose em rizomas foi bem-sucedido, analisamos ainda mais as razões isotópicas de 13C / 12C em rizomas. As razões isotópicas de 13C / 12C dos tratamentos 3 e 4 foram muito maiores do que as do tratamento 2 (Figura 1A). Os resultados indicaram que a 13C6-Glicose dos tratamentos 3 e 4 entrou nos rizomas por ingestão.
As proporções de
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Discussão
A implementação bem-sucedida deste protocolo depende de pesquisas abrangentes sobre propriedades fisiológicas de plantas, tecidos, órgãos e metabólitos secundários. A abordagem de design experimental descrita no protocolo estabelece uma base robusta para investigar as vias biossintéticas dos metabólitos secundários das plantas. Os fatores críticos neste experimento são (1) determinar a idade das mudas perenes e (2) escolher o tempo correto de detecção de marcação de isótopos. As plantas medicinais são categorizadas em pe.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Programa da Juventude da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82304670).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1% de água de ácido fórmico | Chengdu Kelong Reagente Químico Fábrica | 44890 | |
| 13C6-Glicose em pó | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrila | Chengdu Kelong Reagente Químico Fábrica | 44890 | |
| FRASCOS DE AMOSTRADOR AUTOMÁTICO | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 coluna | Águas, Milfor, MA | 1.7μ m,2.1*100 mm | |
| Limpador ultrassônico CNC | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Forno | DHG-9146A | ||
| Balança analítica eletrônica | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Etanol | Fábrica de Reagentes Químicos Chengdu Kelong | 44955 | |
| Moedor rápido de amostra totalmente automático | Xangai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Espectrômetro de massa de proporção de isótopos estáveis por cromatografia gasosa | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Solução Hoagland | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Tanque hidropônico | JRD | 1020421 | |
| Software Isodat | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Cromatografia líquida de alta resolução espectrometria de massa | Tecnologia Agilent | Agilent 1260 -6120 | |
| Instrumento de fabricação de nitrogênio | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Filtro de fase orgânica | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Bomba de oxigênio | Magic Dragon | MFL | |
| Quantum sensor | Highpoint | UPRtek | |
| Bisturi | Handskit | 11-23 | |
| Aspersão pode | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
Referências
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
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Reimpressões e permissões
