Registrando a atividade muscular dos membros anteriores em camundongos com cabeça fixa com eletrodos EMG implantados cronicamente

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação manual e a implantação cirúrgica de eletrodos eletromiográficos (EMG) nos músculos dos membros anteriores de camundongos para registrar a atividade muscular durante experimentos de comportamento com a cabeça fixa.

Resumo

Poderosas ferramentas genéticas e moleculares disponíveis na pesquisa em neurociência de sistemas de camundongos permitiram aos pesquisadores interrogar a função do sistema motor com precisão sem precedentes em camundongos com cabeça fixa executando uma variedade de tarefas. O pequeno tamanho do camundongo dificulta a medição da saída motora, já que o método tradicional de registro eletromiográfico (EMG) da atividade muscular foi projetado para animais maiores, como gatos e primatas. Na pendência de eletrodos EMG disponíveis comercialmente para camundongos, o método padrão-ouro atual para registrar a atividade muscular em camundongos é fazer conjuntos de eletrodos internamente. Este artigo descreve um refinamento dos procedimentos estabelecidos para a fabricação manual de um conjunto de eletrodos, implantação de eletrodos na mesma cirurgia que o implante da placa de cabeça, fixação de um conector na placa de cabeça e cuidados de recuperação pós-operatória. Após a recuperação, as gravações EMG com resolução de milissegundos podem ser obtidas durante o comportamento fixo da cabeça por várias semanas sem alterações perceptíveis na qualidade do sinal. Essas gravações permitem a medição precisa da atividade muscular dos membros anteriores, juntamente com o registro neural in vivo e / ou perturbação para sondar os mecanismos de controle motor em camundongos.

Introdução

Nas últimas décadas, os camundongos se tornaram um organismo modelo atraente para estudar o sistema motor de mamíferos. Abordagens experimentais comuns envolvem camundongos com a cabeça fixa realizando tarefas motoras juntamente com o monitoramento e / ou perturbação da atividade neural 1,2,3,4,5. Estudos do sistema motor em espécies maiores (como gatos e primatas) tradicionalmente dependem da eletromiografia (EMG) para medir a saída do motor diretamente durante esses experimentos ^6,7,8. No entanto, registrar a atividade muscular em camundongos é um desafio porque sua musculatura é muito pequena para eletrodos EMG disponíveis comercialmente usados em experimentos com grandes mamíferos⁹. Muitos pesquisadores optam por rastrear a cinemática dos membros por meio de vídeo ^4,10,11 e/ou desempenho comportamental ^2,4,12 para sondar a saída motora indiretamente, mas esses métodos não têm resolução para detectar a influência da escala de tempo de milissegundos da atividade neural e sua perturbação nos músculos. Assim, o registro da EMG é desejável para pesquisadores interessados no controle neural direto dos músculos.

A EMG envolve a medição da voltagem entre dois pontos, normalmente separados por uma curta distância aproximadamente paralela às fibras do músculo que está sendo registrado. Os eletrodos EMG vêm em variedades de superfície (ou "patch") e intramusculares (ou "agulha"). Os eletrodos de superfície são colocados sobre a pele ou sobrepostos ao tecido muscular e fixados com adesivo ou sutura. Como tal, os eletrodos de superfície são menos invasivos do que os eletrodos intramusculares e são mais populares entre humanos, gatos e primatas devido à sua relativa facilidade de uso. Eletrodos de superfície também têm sido usados com sucesso em ratos e camundongos^13,14; no entanto, eles devem ser fabricados à mão e implantados cirurgicamente sob a pele devido à tendência dos roedores de tentar remover objetos estranhos durante a limpeza. Os eletrodos EMG intramusculares, por outro lado, são implantados cirurgicamente no tecido muscular. Por estarem envoltos em tecido muscular, eles fornecem alta resolução espacial e permanecem fixos na posição indefinidamente. Assim, os eletrodos EMG intramusculares implantados são ideais sobre os eletrodos de superfície para experimentos de longo prazo usando roedores. Para registrar a EMG intramuscular de forma confiável em camundongos, os pesquisadores desenvolveram um método para fabricar e implantar eletrodos EMG em músculos tão pequenos quanto os do antebraço de um camundongo adulto. Esses eletrodos permitem o registro muscular crônico durante o comportamento motor em roedores ao longo de várias semanas.

O protocolo descrito aqui é o resultado de um refinamento de uma década de métodos estabelecidos^{15 , 16 , 17 , 18} , que resultou em um procedimento para fabricação, implantação e registro manual de eletrodos EMG de fio cronicamente implantados em pares de músculos flexores / extensores do cotovelo e punho em camundongos comportados. A primeira seção descreve a fabricação manual de um conjunto de eletrodos com quatro pares de eletrodos e um conector de 8 pinos para a interface do estágio principal. A próxima seção detalha o implante cirúrgico dos eletrodos por via intramuscular nos músculos do braço e inferior na mesma cirurgia do implante da placa de cabeça. Finalmente, gravações representativas de camundongos realizando uma variedade de comportamentos são discutidas. No geral, esse método é uma maneira econômica e personalizável de incluir medições de atividade muscular em experimentos de comportamento com cabeça fixa, ideal para laboratórios com alguma experiência em fabricação de eletrodos.

Protocolo

Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Northwestern University. Outros países e/ou instituições podem ter regulamentos diferentes que exigem modificações neste procedimento. Os animais incluídos no presente estudo foram machos adultos C57BL6/J (ver Tabela de Materiais) com idades compreendidas entre as 12 e as 20 semanas de idade e um peso corporal mínimo de 20 g.

1. Fabricação do conjunto de eletrodos

NOTA: Execute estas etapas em uma bancada limpa usando um estereomicroscópio com uma faixa de ampliação de 10x-40x e mãos limpas e desprotegidas. Consulte a Figura 1 para obter diagramas detalhando a decapagem do fio do eletrodo (Figura 1A) e o conjunto do conector (Figura 1B).

1. Corte os fios: Para cada par de eletrodos, corte dois pedaços de fio de aço inoxidável trançado revestido com PFA (7 fios, 0.0055" de diâmetro) (consulte a Tabela de Materiais). Para os músculos do braço, corte cada fio com 9,5 cm de comprimento. Para os músculos do braço, corte cada fio com 10,5 cm de comprimento.
2. Amarre os dois fios com um único nó - isso se tornará o nó do lado de fora do local de inserção (nó proximal) quando implantado. Os fios amarrados compreendem um par de eletrodos.
   1. Usando uma agulha de 18 G inserida em um pedaço de papelão ondulado, posicione o nó a 6 cm da extremidade de inserção e aperte ao redor da agulha puxando os fios do eletrodo contra o papelão. A extremidade de inserção encolherá para cerca de 5,5 cm, com os 0,5 cm restantes amarrados no nó.
   2. Remova cuidadosamente a agulha e aperte o nó com as mãos desprotegidas duas vezes para apertar ainda mais.
      NOTA: O nó não deve ser o mais apertado possível; apertar dessa maneira resultará em um nó proximal do tamanho correto para ancorar os eletrodos implantados no tecido.
   3. Para os músculos do braço, certifique-se de que as extremidades do conector tenham 3.5 cm de comprimento. Para os músculos do braço, certifique-se de que as extremidades do conector tenham 4,5 cm de comprimento.
3. Descasque 0,5 mm de isolamento de cada fio: 1-1,5 mm do nó em um fio e 2-2,5 mm do nó no outro fio. A Figura 1 ilustra onde descascar cada fio.
   1. Prenda o eletrodo esticado contra um pedaço de papelão plano com os dois fios da extremidade do conector juntos e os fios da extremidade de inserção separados.
   2. Usando um bisturi, faça cortes no isolamento, marcando as extremidades onde o isolamento será removido.
   3. Em cada corte, faça uma série de ~ 6 cortes com uma lâmina de bisturi em cada corte: ~ 2 na parte superior, ~ 2 na lateral e ~ 2 embaixo do fio.
      NOTA: É fundamental evitar cortar muito o próprio fio. Caso contrário, os fios podem quebrar. É necessária prática para atingir a quantidade apropriada de pressão para cortar completamente o isolamento com danos limitados ao fio.
   4. Gire o par de eletrodos 180 graus e repita os 6 cortes em cada corte.
   5. Coloque cortes adicionais conforme necessário para separar os 0,5 mm de isolamento do fio subjacente. O número de cortes necessários aqui dependerá da pressão aplicada e da nitidez da lâmina do bisturi.
   6. Incline a lâmina do bisturi para cortar ao longo do isolamento solto longitudinalmente e remova-a do fio usando uma pinça.
   7. Inspecione o fio exposto quanto a quebra e/ou isolamento desgastado que possa causar danos durante a inserção no tecido.
4. Descasque 1 mm da extremidade de cada fio na extremidade do conector.
5. Descasque 5 mm da extremidade de cada fio na extremidade de inserção.
6. Torça os segmentos do fio da extremidade de inserção juntos e prenda as extremidades expostas de 5 mm juntas no eixo de uma haste de 0,5 pol. Agulha de 27 G. Agulhas hipodérmicas típicas podem ser usadas após a remoção da terminação da trava luer.
7. Repita as etapas 1.1-1.6 para cada par de eletrodos.
8. Monte o conector.
   1. Corte a extremidade fêmea do conector de 12 pinos (consulte a Tabela de Materiais) até o tamanho: # pares de eletrodos x 2 slots de pinos.
   2. Remova as conexões de latão de cada porta do conector (elas vêm pré-conectadas ao conector de 12 pinos) suavemente com um alicate. Guarde esses acessórios para a próxima etapa.
   3. Solde cada extremidade exposta de 1 mm de cada fio na superfície externa de uma das lâminas de uma conexão de latão.
      CUIDADO: A soldagem libera vapores que podem causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias. Use luvas (ou lave as mãos depois), use proteção para os olhos e use um dispositivo local de extração de fumaça para limitar a exposição.
      1. Prenda o encaixe de latão em um clipe jacaré desdentado preso a uma ferramenta manual com a superfície externa de uma de suas lâminas voltada para cima.
      2. Posicione a conexão sob o microscópio para permitir alto controle visual durante a soldagem. Usando um clipe de papel desdobrado ou um pedaço de fio de sucata, passe uma pequena quantidade de fluxo compatível com aço inoxidável na superfície da lâmina.
      3. Aplique solda suficiente na lâmina para cobrir a parte inferior ~ 1.5 mm da lâmina de latão usando uma ponta de solda cônica estreita.
         NOTA: Muita solda aqui interferirá na montagem do conector, enquanto pouca solda pode deixar uma conexão inadequada. Tenha acessórios de latão extras disponíveis para recomeçar, se necessário.
      4. Cubra generosamente a superfície da solda na lâmina com fluxo compatível com aço inoxidável, mas evite que o fluxo goteje no espaço entre as duas lâminas.
      5. Segure o fio do eletrodo exposto de 1 mm nivelado com a solda na lâmina e aqueça a solda com o ferro para fundir a conexão.
      6. Inspecione a conexão: A maior parte do fio exposto deve estar submersa na solda e o fio deve estar firmemente preso ao encaixe de latão. Certifique-se de que nenhuma solda tenha ficado entre as duas lâminas do encaixe de latão - isso pode dificultar a inserção de um conector macho posteriormente. Por fim, certifique-se de que a conexão esteja nivelada com a lâmina de latão para permitir que a conexão seja reinserida no conector na próxima etapa.
   4. Usando uma pinça reta, reinsira cada encaixe de latão soldado de volta no conector, garantindo que os fios de cada par de eletrodos estejam adjacentes um ao outro e não emaranhados com outros pares de eletrodos. Consulte a Figura 1B para visualizar a orientação de um único par de eletrodos no conector.
      NOTA: A orientação ideal da esquerda para a direita é: bíceps (3,5 mm na extremidade do conector), tríceps (3,5 mm na extremidade do conector), extensor radial do carpo (ECR; 4,5 mm na extremidade do conector) e palmar longo (PL; 4,5 mm na extremidade do conector). Marque um lado com um marcador ou branco para acompanhar a orientação do conector durante a implantação.
   5. Corte um conector macho de 12 pinos do mesmo tamanho (# pares de eletrodos x 2) que a extremidade fêmea e conecte-o ao conector fêmea. Se as conexões forem deslocadas, elas podem ser reinseridas com pinças retas depois que o conector macho estiver assentado.
   6. Remova as abas que emanam dos acessórios de latão com um alicate.
   7. Cubra as ranhuras dos pinos com epóxi, garantindo que todo o metal ou fio próximo ao conector seja isolado do tecido.
      CUIDADO: O epóxi pode causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias com exposição prolongada. Use luvas, proteção para os olhos e use epóxi apenas em uma área bem ventilada ou sob um dispositivo local de extração de fumaça.
   8. Deixe o conector secar ao ar por pelo menos 30 min.
9. Teste a resistência de cada par de eletrodos e rotule as agulhas com pequenos segmentos coloridos de termorretrátil para facilitar a identificação durante a cirurgia.
   NOTA: A resistência deve estar entre 18-50 ohms. Resistência mais baixa pode indicar uma posição vendida. Maior resistência pode indicar muitos danos aos fios de arame. No entanto, a alta resistência geralmente decorre da conexão imperfeita entre o eixo da agulha e o fio (feita na etapa 1.6), que pode ser resolvida por crimpagem adicional nesta junção.
10. Certifique-se de que o conjunto de eletrodos esteja livre de fibras e outros detritos antes da implantação. O pulverizador pode ser usado para isso. Inspecionar ao microscópio pode ser útil para verificar.

2. Cirurgia de implantação de eletrodo

NOTA: Esta seção descreve um único procedimento cirúrgico para implantar uma placa de cabeça e eletrodos fabricados na seção anterior no tríceps, bíceps, extensor radial do carpo (ECR) e palmar longo (PL). Para os dois últimos músculos, é muito difícil implantar o eletrodo exclusivamente nesses músculos individuais sem passar por músculos sinérgicos próximos. Veja a discussão abaixo sobre as ressalvas da tentativa de isolar gravações de músculos individuais. As placas de cabeça são normalmente projetadas e fabricadas sob medida para experimentos específicos. O presente estudo utilizou placas de cabeça de rebites de plástico impressas em 3D¹⁹. Muitos designs de placas de cabeça de código aberto estão disponíveis online por meio de Janelia, do Allen Institute e de grupos de pesquisa independentes. O procedimento de placa de cabeça descrito aqui foi usado com sucesso com placas de titânio e plástico. O procedimento cirúrgico deve ser realizado em um instrumento estereotáxico (ver Tabela de Materiais) com um estereomicroscópio variando de 10 a 40x de aumento.

1. Esterilize a frio os eletrodos e a placa de cabeça usando glutaraldeído a 1,5% durante a noite ou por 8 h. Enxágue brevemente em água estéril e deixe secar completamente ao ar antes de implantar.
   CUIDADO: O glutaraldeído é prejudicial se ingerido e pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Manuseie com luvas em uma hotte ventilada.
2. Induzir anestesia com isoflurano a 2-4% em oxigênio de grau médico em uma câmara de indução até a perda do reflexo de endireitamento (aproximadamente 3 min) seguindo protocolos aprovados institucionalmente.
3. Transfira o animal para o cone nasal móvel para continuar recebendo anestesia. Sob anestesia com isoflurano a 2% em oxigênio de grau médico, raspe a cabeça, o pescoço e os membros do animal antes da cirurgia. Execute todas as etapas restantes nesta seção sob anestesia. Ajuste a dose de isoflurano conforme necessário para manter uma frequência respiratória de 1 Hz e a ausência de reflexo de beliscar os dedos dos pés.
4. Aplique lubrificante ocular e reaplique a cada 1 h durante toda a cirurgia.
5. Administre analgésicos injetáveis (como carprofeno, 5 mg / kg) e antibióticos por via subcutânea (como enrofloxacina, 10 mg / kg) (ver Tabela de Materiais) no início da cirurgia.
6. Implante a placa de cabeça usando as etapas a seguir ou um método alternativo aprovado pela instituição.
   1. Prenda a cabeça do animal nas barras auriculares do instrumento estereotáxico e aplique anestesia (isoflurano a 2%) através do cone do nariz preso ao instrumento estereotáxico. Adicione uma cortina estéril para manter a assepsia.
   2. Limpe a cabeça e o pescoço com almofadas de preparação de iodopovidona e almofadas de preparação de álcool estéreis.
      Reaplique o lubrificante para os olhos, se necessário.
   3. Injete lidocaína (4 mg / kg) (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea no local da incisão.
   4. Garanta a indução anestésica adequada realizando uma pinça no dedo do pé. Se o reflexo de endireitamento estiver ausente, faça uma incisão na linha média da cabeça do animal, da borda caudal dos olhos até a borda caudal das orelhas.
   5. Prenda a pele com clipes de tecido: dois na borda rostral de cada lado, logo atrás dos olhos, e dois na borda caudal, logo atrás das orelhas.
   6. Limpe a superfície do crânio raspando suavemente com uma lâmina de bisturi para remover a fáscia seca.
   7. Aplique uma fina camada de cimento dentário (ver Tabela de Materiais) na superfície do crânio e deixe secar por 5 min.
   8. Posicione a placa de cabeça no crânio do animal. Como e onde a placa de cabeça é implantada varia de acordo com a placa de cabeça e a questão de pesquisa.
   9. Use cimento dental para aderir a placa de cabeça ao crânio. Certifique-se de que o crânio esteja totalmente coberto. Deixe o cimento dental secar por 10 min.
7. Transfira o animal para um cone nasal de plástico móvel para fornecer anestesia para o restante da cirurgia; Isso permitirá o reposicionamento do animal regularmente durante a cirurgia para acessar diferentes músculos, mantendo a anestesia.
8. Estenda a incisão na nuca (feita durante o implante da placa de cabeça) de modo que atinja 1 cm caudal às orelhas.
9. Usando um raspador ósseo rombudo, separe a pele sob a incisão do pescoço do tecido subjacente para abrir caminho da incisão no pescoço até o membro anterior, onde os eletrodos serão implantados.
10. Prenda o conector EMG à placa de cabeça temporariamente usando um pequeno pedaço de fita adesiva para mantê-lo no lugar durante a implantação do eletrodo.
11. Limpe o membro anterior do animal com almofadas de preparação de iodopovidona e almofadas de preparação de álcool estéreis.
12. Faça a incisão do tríceps.
    1. Posicione o animal de lado com o tríceps voltado para cima.
    2. Injete lidocaína (4 mg/kg) no local planejado da incisão. Isso aliviará a dor local e manterá os músculos úmidos durante a implantação.
       NOTA: Os músculos devem permanecer úmidos, mas não molhados durante a cirurgia. Aplique solução salina estéril topicamente conforme necessário se os músculos ou a pele parecerem secos.
    3. Corte 7 mm sobre o tríceps paralelo ao osso.
13. Separe a pele ao redor da incisão do tecido subjacente com o raspador ósseo rombudo. Trabalhe o raspador sob a pele e de volta à incisão do pescoço para abrir caminho para os eletrodos.
14. Apare qualquer fáscia que obscureça o músculo.
15. Certifique-se de que o caminho do pescoço ao tríceps seja grande o suficiente, inserindo uma tesoura fechada através da incisão do tríceps e empurrando para fora o orifício do pescoço, abrindo ligeiramente após sair do orifício.
16. Traga o eletrodo de tríceps para a incisão do tríceps: Insira a ponta da chave de agulha grande através da incisão do tríceps e para fora da incisão do pescoço. Prenda a chave de agulha ao redor da agulha do eletrodo longitudinalmente e puxe até a incisão do tríceps.
17. Inserção do tríceps: Siga o passo 3 "inserir eletrodos nos músculos".
18. Faça a incisão distal do braço.
    1. Posicione o animal de costas.
    2. Prenda o braço ao longo do lado do animal com a palma da mão voltada para baixo.
    3. Injete lidocaína (4 mg/kg) no local planejado da incisão.
    4. Faça uma incisão de 1 cm acima do bíceps e ECR da parte inferior do deltóide até o meio do braço, paralela ao osso. A extremidade distal da incisão deve estar ~ 2 mm acima da extremidade dos músculos do braço.
19. Limpe a fáscia para expor o músculo bíceps.
20. Limpe um caminho da incisão distal do braço de volta à incisão do tríceps acima (proximal) do grande vaso sanguíneo que corre sob a pele do braço.
21. Passe o eletrodo do bíceps sob a pele através da incisão do pescoço até a incisão do tríceps e, em seguida, da incisão do tríceps até a incisão distal do braço.
22. Inserção do bíceps: Siga o passo 3 "inserir eletrodos nos músculos".
    1. Coloque novamente o braço do animal na mesma posição, mas com a palma da mão voltada para baixo.
    2. Insira o mais próximo possível da extremidade proximal do bíceps exposto.
    3. Para submergir pelo menos 3 mm do eletrodo no tecido muscular, certifique-se de inserir ligeiramente na diagonal às fibras musculares, dependendo do tamanho do mouse.
23. Abra um caminho da incisão do tríceps até o local de inserção do braço distal abaixo (distal) do grande vaso sanguíneo que corre sob a pele do braço, criando um caminho distinto daquele do eletrodo do bíceps.
24. Inserção ECR: Siga a etapa 3 "inserir eletrodos nos músculos".
    1. Insira na parte mais proximal do ECR.
    2. Saia no vinco entre ECR e seu antagonista e dê o nó neste vinco.
25. Limpe um caminho da inserção do tríceps até o local de inserção do PL sob o cotovelo.
26. Inserção PL: Siga o passo 3 "inserir eletrodos nos músculos".
    1. Posicione o animal de costas e prenda o braço sobre a cabeça com a palma da mão voltada para cima.
    2. Insira apenas distal ao cotovelo.
    3. Saia suficientemente proximal aos tendões do punho para que o nó no local de saída fique no músculo e não nos tendões do punho.
27. Reposicione o animal de lado e suture a incisão do tríceps usando suturas de seda 6-0.
28. Reposicione o animal de costas e suture a incisão distal do braço usando suturas de seda 6-0.
29. Fixe o conector na parte de trás da placa de cabeça usando cimento dentário.
30. Suturar a incisão no pescoço com suturas de seda 6-0.
31. Aplique creme antibiótico tópico nos locais da incisão para reduzir a inflamação.
32. Afixe um colar elizabetano (ver Tabela de Materiais) no animal para evitar que ele perturbe as suturas durante a recuperação.

3. Inserção de eletrodos nos músculos

1. Curve ligeiramente a agulha (27 G, passo 1) dobrando.
   1. Segure a agulha com a chave de agulha (consulte a Tabela de Materiais) e pressione-a contra o cabo de uma pinça para adicionar uma dobra de 5 a 10 graus.
   2. Adicione três dobras totais em diferentes posições ao longo do comprimento da agulha.
2. Visualize onde entrar e sair do músculo.
3. Remova qualquer gordura e fáscia que obscureça o local de entrada e saída cortando ou puxando com uma pinça fina. Tente evitar danos vasculares para limitar o sangramento.
4. Apontar para 3-5 mm de fio submerso paralelo às fibras musculares. Isso garantirá que os trechos expostos do fio do eletrodo fiquem submersos no músculo.
5. Usando o acionador de agulha, insira a agulha na extremidade proximal do músculo enquanto aplica contrapressão com uma pinça curva romba na outra mão. Empurre a agulha através do músculo até o local de saída.
6. Assim que a agulha sair do músculo, agarre a ponta com uma pinça romba e puxe a agulha. Continue puxando até que o nó proximal fique no topo do local de inserção.
7. Faça o nó distal.
   1. Usando uma pinça, dê um nó solto distal ao local de saída. Aperte o nó até um laço de 1 cm.
   2. Empurre o laço com uma pinça e posicione-o sobre o local de saída.
   3. Visualize onde o nó distal deve ser fechado antes de ser totalmente apertado, cerca de 0,5 mm distal ao local de saída. Segure suavemente o laço com a pinça fina dobrada nesta posição e puxe o laço firmemente sobre a pinça.
      NOTA: Não aperte o nó distal imediatamente sobre o local de saída nesta etapa, ou o músculo será espremido quando o nó estiver totalmente apertado na próxima etapa.
   4. Remova a pinça fina do nó e termine de apertar o nó empurrando o nó em direção ao local de saída com a pinça fina dobrada e puxando a ponta da agulha com os dedos. Certifique-se de que os nós proximal e distal estejam posicionados corretamente fora dos locais de inserção e saída, respectivamente, para ancorar o eletrodo inserido no lugar.
   5. Segure o nó de saída com uma pinça reta e fina e enrole firmemente o fio distal ao redor da pinça para dobrar o fio ao redor do nó e em direção ao músculo / longe da pele.
   6. Corte o fio 0,5 mm distal ao nó distal, deixando uma pequena protuberância enrolada ao redor do nó.
      A etapa anterior garante que a extremidade cortada da protuberância não penetre na pele do animal, o que pode causar irritação.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Imediatamente após a cirurgia, execute as seguintes etapas.
   1. Alojar o animal individualmente para que seus companheiros de gaiola não perturbem suas suturas.
   2. Coloque o animal em uma gaiola limpa com cama baixa. Remova qualquer ninho e material de enriquecimento que possa interferir na mobilidade do animal enquanto estiver usando a coleira elizabetana.
   3. Dê ao animal água e comida úmida que ele possa acessar enquanto estiver usando a coleira.
2. Execute as seguintes etapas 24 h e 48 h após a cirurgia.
   1. Remova a coleira elizabetana para permitir que o animal se limpe por 20 min.
   2. Induza a anestesia com isoflurano, conforme mencionado na etapa 2.2 e na etapa 2.3.
   3. Administre analgésicos injetáveis e antibióticos.
   4. Inspecione os locais de incisão em busca de suturas ausentes, feridas abertas e sinais de infecção ou irritação. Substitua as suturas e aplique mais antibióticos tópicos, se necessário.
   5. Substitua os alimentos úmidos a cada 48 h até que o colar elizabetano seja removido.
3. Execute as etapas a seguir 6 dias após a cirurgia.
   1. Verifique as feridas para cicatrização completa.
   2. Se as feridas estiverem fechadas, remova as suturas. Se as feridas estiverem abertas, espere mais dois dias para remover as suturas. Remova o colar elizabetano quando as suturas forem removidas.
   3. Retorne o mouse para uma gaiola nova e limpa com cama completa e enriquecimento.
      NOTA: Os animais podem prosseguir para experimentação ou privação de água 7 dias após a cirurgia.

Resultados

A Figura 2, a Figura 3 e a Figura 4 mostram a atividade muscular normalizada registrada nos músculos dos membros anteriores de camundongos realizando diferentes comportamentos: caminhada em esteira sem fixação da cabeça (Figura 2), escalada em uma roda giratória sob fixação da cabeça (Figura 3) e alcance de gotículas de água sob fixação da cabeça (Figura 4). A Figura 2 mostra 1,5 s de locomoção em esteira com um ciclo de passo aproximado estimado a partir do tempo entre duas ativações dos flexores do cotovelo. A Figura 3 mostra 5 s de dados EMG de um animal que teve o eletrodo extensor do punho falhando 6 semanas após o implante. Na Figura 3A, todos os quatro eletrodos produzem um sinal EMG limpo que se alinha com o giro da roda (que indica subida). A Figura 3B mostra o sinal dos mesmos eletrodos após a falha: o eletrodo extensor do punho produz um sinal ruidoso que não muda com o movimento do animal. A Figura 4 mostra 1 s de EMG dos quatro grupos musculares dos membros anteriores durante uma tarefa na qual o camundongo fez a transição da imobilidade para alcançar uma gota de água.

Na Figura 2, Figura 3 e Figura 4, os sinais de tensão foram amplificados e filtrados por passagem de banda (250-20.000 Hz) usando um amplificador diferencial. A tensão bruta foi então subamostrada para 1 kHz e z-scored para comparação entre conjuntos de dados. Observe novamente que, embora os eletrodos tenham sido implantados nos quatro músculos especificados no protocolo (bíceps, tríceps, ECR e PL), não é garantido que os músculos sinérgicos adjacentes não influenciem o sinal EMG; portanto, cada gravação é atribuída ao seu grupo de sinergia (flexor do cotovelo, etc.) para precisão. A verificação de gravações isoladas de músculos individuais exigiria gravações simultâneas em vários sinergistas para testar a diafonia entre as gravações musculares, o que pode ser proibitivamente difícil, especialmente na parte inferior do braço de camundongos.

Figura 1: Esquemas da fabricação do conjunto de eletrodos. (A) Diagrama de um único par de eletrodos. As áreas cinzas indicam onde tirar. (B) Diagrama do conjunto do conector com um único par de eletrodos completo inserido no conector. O diagrama em (B) não está em escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Registro EMG representativo de quatro músculos de um camundongo em movimento livre (sem cabeça fixa) andando em uma esteira. A duração total é de 1,5 s. O ciclo do passo foi estimado a partir do tempo entre as ativações sequenciais dos extensores do cotovelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Registro EMG representativo de quatro músculos de um camundongo com a cabeça fixa realizando um comportamento de escalada naturalista. A^5ª linha mostra a posição da roda de escalada lida por um codificador rotativo; Alterações neste valor indicam que a roda está girando e o animal está subindo ativamente. A duração total é de 5 s. (A) Gravação 36 dias após a implantação durante a escalada. (B) Gravação 72 dias após o implante no mesmo camundongo após a falha do eletrodo extensor do punho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Registro EMG representativo de quatro músculos de um camundongo com a cabeça fixa em transição da imobilidade para a realização de um movimento de alcance. A duração total é de 1 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo permite gravações estáveis de atividade muscular de camundongos com a cabeça fixa realizando uma variedade de comportamentos por várias semanas. Recentemente, esse método tem sido empregado para examinar o controle neural da musculatura dos membros durante comportamentos como locomoção em esteira^18,20, tarefa de puxar joystick¹⁸ e tarefa de co-contração²¹. Embora o protocolo descrito aqui seja específico para os músculos do cotovelo e punho do camundongo, ele é facilmente modificado para registrar diferentes músculos ou um número diferente de músculos, alterando o comprimento e/ou o número total de pares de eletrodos. O método aqui descrito foi adaptado daqueles usados anteriormente para registrar a atividade muscular dos membros anteriores e posteriores em camundongos sem apoio de cabeça 15,16,17.

A fabricação de eletrodos requer prática significativa para dominar. Recomenda-se a prática diária por 1-2 h durante o aprendizado. A remoção dos eletrodos é a etapa mais desafiadora devido ao nível preciso de força necessária para cortar o isolamento sem danificar o fio subjacente. Esse nível de força depende da nitidez da lâmina, portanto, substituir frequentemente a lâmina do bisturi pode ajudar a garantir a reprodutibilidade durante o aprendizado. Soldar os fios às lâminas de latão do conector também pode ser difícil porque o aço inoxidável não solda facilmente. A aplicação de uma quantidade generosa de fluxo compatível com aço inoxidável ajuda a promover a conexão.

O principal desafio durante a cirurgia de implantação é amarrar o nó distal sem perturbar o fio implantado ou o nó proximal. O nó proximal deve ser grande o suficiente para resistir ao deslizamento para o músculo no local de inserção - portanto, evite amarrar o nó muito apertado na etapa 2 da fabricação do conjunto de eletrodos. Se o nó proximal migrar após o implante, use uma pinça com ponta de fibra de carbono para reposicioná-lo com cuidado. Aperte o nó distal lentamente, mantendo um aperto firme no fio com uma pinça para evitar puxar todo o eletrodo. Esta etapa é fundamental para garantir a longevidade dos eletrodos implantados: muita tensão colocada no eletrodo pode fazer com que ele se quebre quando o animal se move, enquanto um eletrodo solto pode se deslocar durante a recuperação e perder o contato com o músculo associado à medida que o tecido cicatriza.

Os animais se recuperam notavelmente bem da cirurgia, embora haja complicações potenciais a serem observadas. Primeiro, os ratos mastigam suas suturas e eletrodos se tiverem a chance. Embora a coleira elizabetana impeça isso, ela também impede que o animal se limpe. Alguns camundongos desenvolvem um acúmulo semelhante a muco ao redor dos olhos. Camundongos machos ocasionais, principalmente os mais velhos, apresentam bloqueios de uretra que podem ser angustiantes para o animal. Permitir que o animal se limpe por 20 minutos por dia antes de inspecionar as suturas deve dar ao animal tempo suficiente para evitar esses problemas.

Existem limitações importantes desse método a serem observadas. Primeiro, esses eletrodos personalizados geralmente não podem resolver a atividade de uma única unidade motora. Além disso, não é garantido que o sinal elétrico emane exclusivamente de um músculo específico (ou seja, bíceps), pois é difícil descartar a diafonia da atividade em músculos sinergistas próximos. Portanto, em publicações, os pesquisadores geralmente se referem aos músculos registrados por seu grupo de sinergia (ou seja, flexor do cotovelo). Recomenda-se realizar dissecções post-mortem após cada experimento para verificar a posição de cada eletrodo, pois eles podem se deslocar no tecido durante a recuperação.

Pesquisadores interessados na atividade de uma única unidade motora devem considerar experimentar eletrodos EMG recém-desenvolvidos pelo Centro de Pesquisa Avançada em Bioengenharia Motora (CAMBER) da Universidade Emory. Esses eletrodos ainda estão sendo desenvolvidos, mas a CAMBER fornecerá o design de eletrodo mais recente. A principal desvantagem desses eletrodos é a longevidade: os eletrodos fabricados à mão descritos neste protocolo geralmente permitem gravações por várias semanas, enquanto os eletrodos CAMBER funcionam melhor para experimentos de curto prazo. Os pesquisadores que selecionam um método de gravação EMG podem entrar em contato diretamente com o CAMBER para determinar se seus eletrodos serão adequados para um determinado experimento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#11 Lâminas de Bisturi	World Precision Instruments	504170	Para fabricação de eletrodos EMG
#3 Cabo de Bisturi	Ferramentas de Ciência Fina	10003-12	Para fabricação de eletrodos EMG
Seringa Sub-Q de 1 mL (pacote com 100)	Becton Dickinson	309597	Para administrar drogas injetáveis
Conector de 12 pinos	Newark	33AC2371	Conector de 12 pinos com conexões de latão; para fabricação de eletrodos EMG
18 G Agulhas	Exel International	26419	Para fabricação de eletrodos EMG
27 G Agulhas	Exel International	26426	Para fabricação de eletrodos EMG
3 M Transpore Surgical Tape	3M	1527-0	Para fita adesiva de membros de animais durante a cirurgia
6-0 suturas de seda	Henry Schein	101-2636	Estas suturas funcionam bem com pele delicada ao redor dos pulsos
C& B Metabond Kit Completo	Pearson Dental	P16-0126	Cimento dental para fixar o conector na placa de cabeça
C57BL6/J Mouses	Jackson Laboratories	#000664	Ratos do tipo selvagem
Pinças Carbofib 5-CF (2)	Ferramentas Aven	18762	Pinça com ponta de fibra de carbono, usada para manipular partes delicadas do eletrodo (seções descascadas ou inseridas)
Carprodyl (Carprofeno) 50 mg/mL Injeção	Ceva Animal Health, LLC	G43010B	Analgésico injetável para controle da dor durante e após a cirurgia
Castroviejo Micro Needle	Holder Fine science tools	12060-01	Para sutura
Castroviejo Needle Holder (large)	Fine science tools	12565-14	Para inserir agulha no músculo
Raspador de Osso Delicado	Ferramentas de ciência fina	10075-16	Para separar a pele do tecido subjacente
Dietgel 76A Suplemento Dietético	Clear H2O	72-07-5022	Para cuidados pós-operatórios
Dumont #5/45 Fórceps	Ferramentas de ciência fina	11251-35	Para remover a fáscia sobrejacente ao músculo
Coleira elizabetana para camundongo	Kent Scientific Corporation	EC201V-10	Para cuidados pós-operatórios
Enrofloxacina 2,27%	Covetrus	#074743	Antibiótico injetável para uso durante e após a cirurgia
Gel epóxi	Devcon	14265	Para fabricação de eletrodos EMG
Grampo Hopkins Bulldog (4)	Stoelting	10-000-481	Grampos de tecido para placa de cabeça implante
Solução de Isoflurano	Covetrus	11695067771	Anestesia inalável
Cloridrato de lidocaína injetável - 2%	Covetrus	#002468	Analgésico tópico para controle da dor durante a cirurgia
Oxigênio de grau médico	Airgas	OX USP200	Para administrar isoflurano durante a cirurgia
Metricida 1 Galão	Metrex	10-1400	Solução de glutaraldeído para esterilização a frio da placa de cabeça e eletrodos
Tiras de teste MetriTest 1.5%	Metrex	10-303	Tiras de teste para monitoramento de solução de glutaraldeído (recomendado)
Modelo 900LS Instrumento Estereotáxico para Pequenos Animais	Kopf Instruments	900LS	Stereotax com recurso de susan preguiçoso que permite a rotação da plataforma durante a cirurgia
Fio de aço inoxidável trançado revestido com PFA de 0,0055"	Sistemas A-M	793200	Para fabricação de eletrodos EMG
Almofadas de preparação de iodo-povidona	Dynarex	1108	Para limpeza de pele
Pomada Veterinária Puralube	Pomada para os olhos Dechra	37327	para cirurgia
Almofadas de preparação de álcool estéreis	Dynarex	1113	Para limpeza de pele
Pinça reta fina #5	Ferramentas de ciência fina	11295-10	Para enrolar o fio após a inserção
Tesoura fina reta	Ferramentas de ciência fina	14060-11	Para cortar fio
Tesoura de Mola Student Vannas	Ferramentas de ciência fina	91500-09	Para fazer incisões, aparar gordura e fáscia, e suturar
Pinças Technik 7B-SA (2)	Ferramentas Aven	18074USA	Pinça curva sem corte, para uso geral durante a cirurgia
Pomada antibiótica tripla	Walgreens	975863	Antibiótico tópico para cirurgia
V-1 Sistema de anestesia animal de laboratório de mesa	VetEquip	901806	Contém todo o equipamento necessário para indução e limpeza de anestesia, incluindo vaporizador, câmara de indução, cone de nariz de plástico móvel e tubulação