Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) podem promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos. Pesquisas recentes sugerem que sua função regenerativa pode ser atribuída ao contato célula-célula e aos efeitos parácrinos celulares. O efeito parácrino é uma forma importante de as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, nas quais as vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel funcional como transportadoras. Existe um potencial significativo para ADSC EVs em medicina regenerativa. Vários estudos relataram a eficácia desses métodos. Vários métodos para extrair e isolar EVs são atualmente descritos com base em princípios como centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. A ultracentrifugação é considerada o padrão-ouro para isolar EVs. No entanto, ainda não existe um protocolo meticuloso para destacar as precauções durante a ultracentrifugação. Este estudo apresenta a metodologia e as etapas cruciais envolvidas na cultura de ADSC, coleta de sobrenadante e ultracentrifugação EV. No entanto, embora a ultracentrifugação seja econômica e não exija tratamento adicional, ainda existem algumas desvantagens inevitáveis, como baixa taxa de recuperação e agregação de EV.
Introdução
A maioria das ADSCs é derivada do tecido adiposo e demonstrou promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos, incluindo miocárdio, osso e pele1. Pesquisas recentes sugerem que a função regenerativa das ADSCs pode ser devida ao contato intercelular e aos efeitos parácrinos das células2. O efeito parácrino é um meio importante para as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, e essa função é alcançada por meio de vesículas extracelulares (EVs).
Os EVs são estruturas de membrana de camada dupla produzidas pelas células, com um diâmetro variando de 40 nm a 160 nm (com uma média de cerca de 100 nm). Eles afetam diferentes funções celulares, como produção de citocinas, proliferação celular, apoptose e metabolismo 3,4. Numerosos estudos foram realizados sobre as funções dos ADSC EVs, incluindo a promoção da regeneração óssea, regeneração do tecido da mucosa oral, sobrevivência do tecido adiposo após o transplante de tecido e reparo de feridas cutâneas 5,6,7,8. O enorme potencial dos ADSC EVs na medicina regenerativa é evidente. Existem vários métodos para extrair e separar EVs do sobrenadante, como técnicas baseadas em centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. O método de ultracentrifugação é amplamente considerado o padrão-ouro para isolar EVs9. O princípio fundamental da ultracentrifugação para separação de EV baseia-se no fato de que as partículas na amostra têm coeficientes de sedimentação variados, resultando em sua sedimentação e agregação em camadas de separação distintas. No entanto, um protocolo detalhado enfatizando as precauções durante a ultracentrifugação ainda não foi estabelecido.
Portanto, este estudo descreve objetivamente a cultura ADSC, a coleta de sobrenadantes e os procedimentos de ultracentrifugação de EVs e pontos-chave com um fluxo lógico de informações e linguagem clara e formal. Isso fornece uma referência valiosa para experimentos futuros.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A visão geral das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de mídia
- Prepare um meio de cultura para ADSC sem exossomos usando 450 mL de meio de cultura basal, 50 mL de soro fetal bovino sem exossomos e 5 mL de antibióticos triplos.
2. Ressuscitação e cultura de ADSCs
NOTA: Ressuscite ADSCs.
- Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
- Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.
- Recupere 2 tubos de ADSCs congelados (P3) do nitrogênio líquido e agite-os em banho-maria a 37 °C com temperatura constante até que estejam totalmente descongelados.
NOTA: A abertura do tubo do freezer não deve estar em contato com a água para evitar contaminação. - Desinfete o tubo de criopreservação com álcool 75% e depois mova-o para a mesa ultralimpa. Aspirar a suspensão celular com uma pipeta e colocá-la num tubo de centrifugação de 15 ml.
- Coloque o tubo de centrífuga em uma centrífuga de baixa velocidade e centrifugue a 250 x g por 5 min a 4 °C.
- Prepare quatro placas de cultura de 10 cm e coloque 9 mL de meio em cada prato. Marque o nome, o tipo de célula, a geração e a data experimental e, em seguida, pré-aqueça-os em uma incubadora termostática de células a 37 °C.
- Desinfete o tubo da centrífuga e mova-o para a mesa ultralimpa. Remova o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicione 4 mL de meio e agite suavemente a solução (1 x 105 células / mL) até que esteja uniformemente dispersa.
NOTA: Tome cuidado para não eliminar o pellet celular ao extrair o sobrenadante. - Adicione 1 mL de suspensão celular a cada placa. Agite a louça com um método cruzado.
NOTA: Posicione a placa em uma superfície nivelada e agite-a em um padrão cruzado (movendo-a para cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) por 5-6 repetições. Evite movimentos circulares, pois eles podem causar acúmulo de células no centro. - Observe as células com ampliação de 40x com o microscópio óptico e, em seguida, coloque os pratos na incubadora.
NOTA: O objetivo principal da observação das células é determinar se elas estão distribuídas uniformemente, pois a distribuição desigual afetará o crescimento subsequente. - Prepare o meio de troca para as células.
- Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
- Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.
- Observe o estado da célula sob o microscópio óptico com ampliação de 40x. O nível de confluência é de aproximadamente 50%.
NOTA: O nível de confluência é calculado como a razão entre a área ocupada pelas células e a área da superfície da placa de Petri depois que as células aderem à parede e se esticam totalmente. - Transfira a placa de cultura para a mesa ultralimpa (nível de biossegurança 2) após a desinfecção e remova o meio.
- Enxágue cada placa de cultura duas vezes com 2 mL de solução de PBS suavemente.
- Adicione 10 mL de meio a cada prato. Transfira os pratos para a incubadora.
3. Coletando o sobrenadante ADSCs e extraindo os EVs
- Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
- Observe o estado da célula ao microscópio. O nível de confluência é de aproximadamente 80%.
- Transfira o prato para a mesa ultralimpa após a desinfecção. Recolha cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e coloque-o num tubo de centrifugação de 50 ml.
NOTA: As células podem ser congeladas ou descartadas. Se a esterilidade não for necessária, as etapas a seguir podem ser executadas na mesa de operação. Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde. Se a experiência for interrompida, conservar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C durante uma semana não superior a uma semana. O armazenamento de longo prazo não é recomendado, pois pode afetar a atividade dos VEs. A abordagem ideal é extrair EVs imediatamente. - Centrifugue (300 x g, 10 min, à temperatura ambiente) para remover as células em suspensão. Recolher o sobrenadante com uma pipeta.
NOTA: Não despeje. Deixe um pouco de sobrenadante para evitar que o pellet seja sugado. - Centrifugar para remover os detritos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) e, em seguida, continuar a recolher o sobrenadante com uma pipeta.
NOTA: Os pontos-chave são os mesmos da etapa 3.4. - Filtre o sobrenadante com uma membrana de 0,22 um para remover partículas grandes e detritos celulares.
NOTA: Filtre o sobrenadante com 2 mL de PBS estéril para umedecer a membrana do filtro antes da filtração. - Centrifugue na máquina de ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
- Em seguida, centrifugue a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para remover o pellet e recolher o sobrenadante.
NOTA: Os EVs obtidos foram purificados por centrifugação várias vezes para aumentar sua pureza. O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, é crucial operar a pipeta suavemente e deixar um pouco de sobrenadante no fundo para evitar a coleta de pellets. - Remova o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é fundamental removê-lo de forma suave e completa para maximizar a pureza dos EVs. - Remova o sobrenadante e obtenha o pellet EVs. Ressuspenda-o com 1 mL de PBS, transfira-o para um tubo de centrífuga de 1 mL e guarde-o em um refrigerador a 4 ° C para detecção subsequente.
NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Consequentemente, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é crucial remover suave e completamente o sobrenadante para maximizar a pureza dos EVs. Se as amostras não forem necessárias por um longo período, armazene-as em uma geladeira a -80 °C.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Primeiramente, as ADSCs foram caracterizadas e identificadas, incluindo sua morfologia10 e anticorpos de superfície. Com base na Figura 2A, é evidente que as ADSCs estão dispostas em forma de fuso e formam um vórtice após um crescimento denso. As células cultivadas foram diferenciadas em células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas e coradas com Oil Red O, Alizarin Red e AlcianBlue 11. O experimento de diferenciação induzida e a citometri...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Durante o processo experimental formal, vários pontos são cruciais para alcançar os melhores resultados experimentais. Com base em nossa experiência anterior, recomenda-se optar pela passagem 3-6 ADSCs, pois garantem o melhor estado celular possível. Antes do P3, os glóbulos vermelhos, as células endoteliais e outras células diversas podem não ter sido excluídos. Após P6, as células podem envelhecer gradualmente, o que pode afetar o estado dos EVs secretados. Em segundo lugar, o sobrenadante deve ser coletado quando o gr...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesse financeiro a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82202473).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de Agulha Acrodisc de Supor Membrane | Acros Organics | 4652 | 0.22 μ m |
| Meio Basal Para Cultura de Células | OriCell | BHDM-03011 | |
| Soro Bovino Fetal Sem EXO + Suplemento de Cultura (Para Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano) | OriCell | HUXMD-05002 | |
| Microscópio Invertido | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
| Centrífuga de Baixa Velocidade | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd. | SC-3612 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| Optima Max-XP Ultracentrífuga de mesa | Beckman Coulter | 393315 | |
| penicilina-estreptomicina-gentamicina (100x) | Solarbio | P1410 |
Referências
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
