Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Resumo

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Resumo

As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) podem promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos. Pesquisas recentes sugerem que sua função regenerativa pode ser atribuída ao contato célula-célula e aos efeitos parácrinos celulares. O efeito parácrino é uma forma importante de as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, nas quais as vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel funcional como transportadoras. Existe um potencial significativo para ADSC EVs em medicina regenerativa. Vários estudos relataram a eficácia desses métodos. Vários métodos para extrair e isolar EVs são atualmente descritos com base em princípios como centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. A ultracentrifugação é considerada o padrão-ouro para isolar EVs. No entanto, ainda não existe um protocolo meticuloso para destacar as precauções durante a ultracentrifugação. Este estudo apresenta a metodologia e as etapas cruciais envolvidas na cultura de ADSC, coleta de sobrenadante e ultracentrifugação EV. No entanto, embora a ultracentrifugação seja econômica e não exija tratamento adicional, ainda existem algumas desvantagens inevitáveis, como baixa taxa de recuperação e agregação de EV.

Introdução

A maioria das ADSCs é derivada do tecido adiposo e demonstrou promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos, incluindo miocárdio, osso e pele¹. Pesquisas recentes sugerem que a função regenerativa das ADSCs pode ser devida ao contato intercelular e aos efeitos parácrinos das células². O efeito parácrino é um meio importante para as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, e essa função é alcançada por meio de vesículas extracelulares (EVs).

Os EVs são estruturas de membrana de camada dupla produzidas pelas células, com um diâmetro variando de 40 nm a 160 nm (com uma média de cerca de 100 nm). Eles afetam diferentes funções celulares, como produção de citocinas, proliferação celular, apoptose e metabolismo ^3,4. Numerosos estudos foram realizados sobre as funções dos ADSC EVs, incluindo a promoção da regeneração óssea, regeneração do tecido da mucosa oral, sobrevivência do tecido adiposo após o transplante de tecido e reparo de feridas cutâneas 5,6,7,8. O enorme potencial dos ADSC EVs na medicina regenerativa é evidente. Existem vários métodos para extrair e separar EVs do sobrenadante, como técnicas baseadas em centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. O método de ultracentrifugação é amplamente considerado o padrão-ouro para isolar EVs⁹. O princípio fundamental da ultracentrifugação para separação de EV baseia-se no fato de que as partículas na amostra têm coeficientes de sedimentação variados, resultando em sua sedimentação e agregação em camadas de separação distintas. No entanto, um protocolo detalhado enfatizando as precauções durante a ultracentrifugação ainda não foi estabelecido.

Portanto, este estudo descreve objetivamente a cultura ADSC, a coleta de sobrenadantes e os procedimentos de ultracentrifugação de EVs e pontos-chave com um fluxo lógico de informações e linguagem clara e formal. Isso fornece uma referência valiosa para experimentos futuros.

Protocolo

A visão geral das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia

1. Prepare um meio de cultura para ADSC sem exossomos usando 450 mL de meio de cultura basal, 50 mL de soro fetal bovino sem exossomos e 5 mL de antibióticos triplos.

2. Ressuscitação e cultura de ADSCs

NOTA: Ressuscite ADSCs.

1. Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
2. Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.
3. Recupere 2 tubos de ADSCs congelados (P3) do nitrogênio líquido e agite-os em banho-maria a 37 °C com temperatura constante até que estejam totalmente descongelados.
   NOTA: A abertura do tubo do freezer não deve estar em contato com a água para evitar contaminação.
4. Desinfete o tubo de criopreservação com álcool 75% e depois mova-o para a mesa ultralimpa. Aspirar a suspensão celular com uma pipeta e colocá-la num tubo de centrifugação de 15 ml.
5. Coloque o tubo de centrífuga em uma centrífuga de baixa velocidade e centrifugue a 250 x g por 5 min a 4 °C.
6. Prepare quatro placas de cultura de 10 cm e coloque 9 mL de meio em cada prato. Marque o nome, o tipo de célula, a geração e a data experimental e, em seguida, pré-aqueça-os em uma incubadora termostática de células a 37 °C.
7. Desinfete o tubo da centrífuga e mova-o para a mesa ultralimpa. Remova o sobrenadante com uma pipeta.
8. Adicione 4 mL de meio e agite suavemente a solução (1 x 10⁵ células / mL) até que esteja uniformemente dispersa.
   NOTA: Tome cuidado para não eliminar o pellet celular ao extrair o sobrenadante.
9. Adicione 1 mL de suspensão celular a cada placa. Agite a louça com um método cruzado.
   NOTA: Posicione a placa em uma superfície nivelada e agite-a em um padrão cruzado (movendo-a para cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) por 5-6 repetições. Evite movimentos circulares, pois eles podem causar acúmulo de células no centro.
10. Observe as células com ampliação de 40x com o microscópio óptico e, em seguida, coloque os pratos na incubadora.
    NOTA: O objetivo principal da observação das células é determinar se elas estão distribuídas uniformemente, pois a distribuição desigual afetará o crescimento subsequente.
11. Prepare o meio de troca para as células.
    1. Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
    2. Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.
    3. Observe o estado da célula sob o microscópio óptico com ampliação de 40x. O nível de confluência é de aproximadamente 50%.
       NOTA: O nível de confluência é calculado como a razão entre a área ocupada pelas células e a área da superfície da placa de Petri depois que as células aderem à parede e se esticam totalmente.
    4. Transfira a placa de cultura para a mesa ultralimpa (nível de biossegurança 2) após a desinfecção e remova o meio.
    5. Enxágue cada placa de cultura duas vezes com 2 mL de solução de PBS suavemente.
    6. Adicione 10 mL de meio a cada prato. Transfira os pratos para a incubadora.

3. Coletando o sobrenadante ADSCs e extraindo os EVs

1. Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.
2. Observe o estado da célula ao microscópio. O nível de confluência é de aproximadamente 80%.
3. Transfira o prato para a mesa ultralimpa após a desinfecção. Recolha cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e coloque-o num tubo de centrifugação de 50 ml.
   NOTA: As células podem ser congeladas ou descartadas. Se a esterilidade não for necessária, as etapas a seguir podem ser executadas na mesa de operação. Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde. Se a experiência for interrompida, conservar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C durante uma semana não superior a uma semana. O armazenamento de longo prazo não é recomendado, pois pode afetar a atividade dos VEs. A abordagem ideal é extrair EVs imediatamente.
4. Centrifugue (300 x g, 10 min, à temperatura ambiente) para remover as células em suspensão. Recolher o sobrenadante com uma pipeta.
   NOTA: Não despeje. Deixe um pouco de sobrenadante para evitar que o pellet seja sugado.
5. Centrifugar para remover os detritos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) e, em seguida, continuar a recolher o sobrenadante com uma pipeta.
   NOTA: Os pontos-chave são os mesmos da etapa 3.4.
6. Filtre o sobrenadante com uma membrana de 0,22 um para remover partículas grandes e detritos celulares.
   NOTA: Filtre o sobrenadante com 2 mL de PBS estéril para umedecer a membrana do filtro antes da filtração.
7. Centrifugue na máquina de ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Em seguida, centrifugue a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para remover o pellet e recolher o sobrenadante.
   NOTA: Os EVs obtidos foram purificados por centrifugação várias vezes para aumentar sua pureza. O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, é crucial operar a pipeta suavemente e deixar um pouco de sobrenadante no fundo para evitar a coleta de pellets.
9. Remova o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é fundamental removê-lo de forma suave e completa para maximizar a pureza dos EVs.
10. Remova o sobrenadante e obtenha o pellet EVs. Ressuspenda-o com 1 mL de PBS, transfira-o para um tubo de centrífuga de 1 mL e guarde-o em um refrigerador a 4 ° C para detecção subsequente.
    NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Consequentemente, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é crucial remover suave e completamente o sobrenadante para maximizar a pureza dos EVs. Se as amostras não forem necessárias por um longo período, armazene-as em uma geladeira a -80 °C.

Resultados

Primeiramente, as ADSCs foram caracterizadas e identificadas, incluindo sua morfologia¹⁰ e anticorpos de superfície. Com base na Figura 2A, é evidente que as ADSCs estão dispostas em forma de fuso e formam um vórtice após um crescimento denso. As células cultivadas foram diferenciadas em células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas e coradas com Oil Red O, Alizarin Red e Alcian^{Blue 11}. O experimento de diferenciação induzida e a citometria de fluxo validaram que eles são de fato ADSCs com potencial para diferenciação multidirecional. No entanto, 22% das células são CD45 positivas nos resultados, o que não afetará a conclusão, pois anticorpos positivos e negativos suficientes o suportam (Figura 2A, B).

Em seguida, a identificação dos EVs extraídos é essencial. Inclui principalmente três aspectos: morfologia, tamanho de partícula e proteínas marcadoras. Os resultados do MET revelam claramente a estrutura EV em forma de copo com uma membrana de bicamada¹² (Figura 3A). NTA indica que os EVs têm uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 50-150 nm, com uma concentração de aproximadamente 1,6 x 10¹⁰ partículas/mL (Figura 3B). A análise de Western Blot também mostra que as proteínas marcadoras de EVs, incluindo CD9, CD63 e TSG101¹³, são expressas suavemente ( Figura 3C ).

Figura 1: Visão geral das etapas do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização das ADSCs. (A) A morfologia das ADSCs é fusiforme. As ADSCs foram cultivadas no meio para diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica, respectivamente. A diferenciação adipogênica foi identificada pela coloração Oil Red O. A diferenciação osteogênica e condrogênica foi confirmada pela coloração com Vermelho de Alizarina e Azul de Alcian, respectivamente. Barra de escala: 100 μm. (B) Análise de citometria de fluxo de ADSCs para marcadores de superfície MSC (CD90, CD105, CD29 e CD73) e marcadores específicos de células hematopoiéticas (CD31, CD34, CD45 e HLA-DR). A estratégia de gating: circule o grupo em branco primeiro. Com base nisso, circule CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 e HLA-DR sucessivamente de acordo com os anticorpos marcados de cada grupo. Essa figura é adaptada de Han, Y. D. et ^al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização de EVs. (A) Os resultados do MET revelam claramente a estrutura EV em forma de copo da membrana de bicamada. Barra de escala: 200 nm. (B) NTA indica que os EVs têm uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 50-150 nm, com uma concentração de aproximadamente 1,6 x 10¹⁰ partículas/mL. (C) Detecção de expressões de TSG101, CD9 e CD63 em exossomos por Western blot. Essa figura é adaptada de Han, Y. D. et ^al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Durante o processo experimental formal, vários pontos são cruciais para alcançar os melhores resultados experimentais. Com base em nossa experiência anterior, recomenda-se optar pela passagem 3-6 ADSCs, pois garantem o melhor estado celular possível. Antes do P3, os glóbulos vermelhos, as células endoteliais e outras células diversas podem não ter sido excluídos. Após P6, as células podem envelhecer gradualmente, o que pode afetar o estado dos EVs secretados. Em segundo lugar, o sobrenadante deve ser coletado quando o grau de confluência celular estiver entre 80% e 90% para garantir secreção suficiente do maior número possível de EVs. Para manter a pureza máxima dos EVs, os pesquisadores devem ser cautelosos durante as três primeiras centrifugações e garantir que nenhum resíduo líquido seja deixado para evitar a aspiração de impurezas e pellets. Durante as duas últimas centrifugações, certifique-se de que o sobrenadante seja completamente removido enquanto protege o pellet.

A ultracentrifugação é econômica e não requer tratamento adicional. Essa técnica tem sido amplamente utilizada em estudos de EV e tem demonstrado eficiência satisfatória na obtenção de EVs, conforme confirmado por experimentos de caracterização. No entanto, existem algumas desvantagens inevitáveis. Primeiro, a taxa de recuperação de EVs é baixa. Em segundo lugar, os EVs tendem a se agregar às vezes. Além disso, componentes não celulares podem ser isolados e algumas EVs podem se romper durante o processo, levando ao acúmulo de detritos 14,15,16. Para resolver esses defeitos, a maioria das pesquisas se concentra na purificação de EVs^12,13. No entanto, este protocolo abrange todo o processo, desde a cultura de células até a purificação do exossomo, porque acreditamos que todo o processo afeta o status e a pureza dos EVs extraídos finais. É crucial seguir as diretrizes acima mencionadas durante a operação. Além disso, coletar mais sobrenadante e implementar cultura de células 3D pode ser benéfico, pois vários estudos demonstraram que a cultura 3D é mais eficaz em estimular a secreção de EVs em comparação com a cultura 2D^17,18.

Este protocolo descreve o processo de extração de EVs de ADSCs usando ultracentrifugação. Ele fornece orientação prática e permite que os experimentadores evitem detalhes durante a operação, tanto quanto possível. Em resumo, o protocolo auxilia os experimentadores a melhorar a qualidade das amostras e serve como um lembrete de que não devemos nos concentrar apenas nos detalhes de cada etapa, mas também considerar o experimento como um todo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de Agulha Acrodisc de Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μ m
Meio Basal Para Cultura de Células	OriCell	BHDM-03011
Soro Bovino Fetal Sem EXO + Suplemento de Cultura (Para Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano)	OriCell	HUXMD-05002
Microscópio Invertido	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Centrífuga de Baixa Velocidade	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Ultracentrífuga de mesa	Beckman Coulter	393315
penicilina-estreptomicina-gentamicina (100x)	Solarbio	P1410