Identificação microbiana direta usando um sistema automatizado de identificação microbiana para facilitar o método EUCAST RAST sem espectrometria de massa

Summary

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Abstract

A sepse Gram-negativa (GN) é uma emergência médica em que o manejo em ambientes com recursos limitados depende de técnicas convencionais de cultura microbiológica que fornecem resultados em 3-4 dias. Reconhecendo esse atraso no tempo de resposta (TAT), tanto o EUCAST quanto o CLSI desenvolveram protocolos para determinar os resultados da AST diretamente de frascos de hemocultura automatizados sinalizados positivamente (+aBCs). O protocolo EUCAST rapid AST (RAST) foi introduzido pela primeira vez em 2018, onde podem ser relatados pontos de interrupção do diâmetro da zona para quatro agentes etiológicos comuns da sepse GN, ou seja, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complexo Acinetobacter baumannii . No entanto, os laboratórios clínicos que implementaram esse método em seu fluxo de trabalho de rotina dependem da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa, que não está facilmente disponível, impedindo assim sua implementação em ambientes com recursos limitados. Para contorná-lo, avaliamos um protocolo de inóculo direto (DIP) usando um sistema comercial automatizado de identificação microbiana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (aMIAST) para permitir a identificação microbiana precoce dentro de 8 h após a sinalização positiva de aBC. Avaliamos este protocolo de janeiro a outubro de 2023 para identificar os quatro GN relatáveis RAST (RR-GN) no aBC sinalizado positivamente. Os resultados da identificação microbiana na DIP foram comparados com o protocolo de preparação de inóculo padrão (SIP) em aMIAST. De 204 +aBCs com GN monomórfico (+naBC), um dos 4 RR-GN foi identificado em 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complexo A. baumannii : 26). Destes, 94% (98/105) foram corretamente identificados pelo DIP, enquanto as taxas de erro maior e muito maior foram de 6% (7/105) e 1,7% (4/240), respectivamente. Quando a DIP para identificação microbiana é feita usando o método EUCAST RAST, relatórios clínicos provisórios podem ser fornecidos dentro de 24 horas após o recebimento da amostra. Essa abordagem tem o potencial de reduzir significativamente o TAT, permitindo a instituição precoce de terapia antimicrobiana apropriada.

Introduction

A sepse, um importante problema de saúde global, é definida como disfunção orgânica com risco de vida devido a uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. O Global Burden of Diseases Study estimou que houve 48,9 milhões de casos de sepse e 11 milhões de mortes relacionadas à sepse em todo o mundo em 2017, o que representou quase 20% de todas as mortes globais¹. Cerca^{de 2} /3 das infecções da corrente sanguínea (ICS) que causam mortalidade são devidas a patógenos bacterianos gram-negativos². As principais causas de mortalidade entre gram-negativos (GN) são Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, que respondem por cerca de 40% dos casos entre 33 patógenos bacterianos².

As hemoculturas continuam sendo o padrão-ouro para o diagnóstico de BSI, e a rápida identificação microbiana, juntamente com os resultados do teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST), é a chave para o tratamento. Estima-se que haja um aumento de 9% nas chances de mortalidade com cada hora de atraso na instituição de antimicrobianos apropriados na sepse³. O tempo de resposta (TAT) de relatórios de hemocultura microbiologicamente positivos com resultados AST é de cerca de 48-72 h com as ferramentas microbiológicas disponíveis em ambientes com recursos limitados, mesmo com sistemas automatizados. Como resultado desse TAT abaixo da média, antimicrobianos de amplo espectro são usados empiricamente, contribuindo para o crescente problema da resistência antimicrobiana (AMR). Reconhecendo essa extrema necessidade de reduzir o TAT para técnicas de cultura microbiológica para sepse, o EUCAST e o CLSI estão se movendo para a realização de AST diretamente de frascos de hemocultura sinalizados positivamente (+aBC)^4,5.

Em 2018, a EUCAST introduziu pela primeira vez o método AST rápido (RAST) para determinar AST pelo método de difusão de disco Kirby-Bauer em tempos de incubação curtos, ou seja, 4 h, 6 h e 8 h, diretamente de +aBC ^6,7. O método está atualmente validado para determinar AST para +aBCs contendo uma das 8 causas mais comuns de ICS, a saber, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e complexo A. baumannii entre gram-negativos e Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium e Streptococcus pneumoniae entre gram-positivos⁸. Os pontos de interrupção para determinação de AST em vários intervalos de tempo são fornecidos de acordo com as espécies microbianas listadas acima. Portanto, antes da interpretação categórica dos resultados da AST, a identificação microbiana é necessária. No entanto, o padrão RAST não especifica o método para permitir a identificação microbiana dentro desse período de tempo.

A maioria dos estudos que avaliam o método EUCAST RAST em seu cenário usou a identificação microbiana baseada em espectrometria de massa após curta incubação em meio plaqueado para identificar microrganismos 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . No entanto, os instrumentos de espectrometria de massa não estão amplamente disponíveis, especialmente em países de baixa e média renda (LMICs), o que limita muito a utilidade potencial desse método. Poucos estudos relataram a implementação desse método em seus centros sem o uso de espectrometria de massa 18,19,20. Tayşi et ^al.18 relataram uma ampla categorização de GN entre Enterobacterales, Pseudomonas e Acinetobacter spp. com base na morfologia da coloração de Gram e no teste da oxidase antes de interpretar os resultados da AST. Em outros estudos desse centro, de Gupta et ^al.19 e Siddiqui et ^al.20, a identificação microbiana em nível de espécie foi feita preparando um pellet bacteriano a partir da mistura de caldo de sangue sinalizada positivamente e inoculando-o nos testes bioquímicos convencionais. Embora Tayşi et ^al.18 não tenham comentado sobre a precisão da identificação microbiana com sua abordagem, Gupta et ^al.19 relataram que, com sua abordagem, em 165/176 (94%) casos, um Gram-negativo relatável por RAST (RR-GN), ou seja, de E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii complexo. No entanto, com a última abordagem, a leitura dos resultados do RAST foi feita retrospectivamente usando pontos de interrupção de 8 h de diâmetro de zona somente após a incubação completa dos resultados bioquímicos convencionais, ou seja, 18-24 h após a inoculação, e o tempo médio para relatório foi de cerca de 2 dias.

Para reduzir ainda mais o TAT dos relatórios clínicos, propomos uma metodologia alternativa para permitir a identificação precoce de GN presente em +aBCs usando aMIAST. Antes da introdução de sistemas de identificação microbiana baseados em espectrometria de massa, esses sistemas de identificação automatizados eram considerados o padrão de atendimento para identificação microbiana, onde a identificação era possibilitada por alterações colorimétricas e/ou fluorométricas induzidas por bactérias de teste quando inoculadas em testes bioquímicos miniaturizados abrigados em um e combinando os resultados com seu banco de dados de isolados. O tempo médio de identificação nesses sistemas é de cerca de 4 h a 8 h, no entanto, eles são limitados pelo fato de que os fabricantes recomendam o crescimento noturno de micróbios antes que seus respectivos cartões de identificação possam ser inoculados. Esse requisito limita muito sua utilidade na redução do tempo de relatório.

Poucos estudos avaliaram métodos para identificar diretamente micróbios de +aBCs usando esses sistemas automatizados 21,22,23,24,25,26,27. No caso de +aBCs contendo GN monomórfico, a maioria dos estudos mostrou excelente concordância entre a inoculação direta de pellets bacterianos feitos de mistura de caldo de sangue positiva e incubação de colônias padrão. No entanto, no caso dos gram-positivos, as taxas de concordância foram abaixo do ideal. Como o tempo médio para positividade de +aBCs está entre 8 h e 16 h e a identificação de GN leva ~4 h a 8 h em um sistema automatizado de identificação microbiana, levantamos a hipótese de que, empregando o protocolo de inoculação direta na identificação microbiana automatizada, podemos concluir o relatório clínico de +aBCs com GN tendo um RR-GN dentro de 24 h após o recebimento da amostra.

Cenário para o estudo
O presente estudo foi realizado no laboratório de bacteriologia clínica de um instituto acadêmico de cuidados terciários de importância nacional (INI) com 950 leitos na Índia Central, de janeiro a outubro de 2023. O laboratório está equipado com um sistema de monitorização contínua da hemocultura (CBCMS) e aMIAST. O laboratório de bacteriologia funciona 24 horas por dia, com a disponibilidade de técnicos e microbiologistas para processar e relatar qualquer frasco de hemocultura sinalizado positivamente (+aBCs).

Métodos microbianos usados aqui
O fluxo de trabalho do estudo é mostrado na Figura 1. Os +aBCs que mostram GNs monomórficos (+naBC) foram processados por inoculação direta dos cartões de identificação correspondentes para permitir a identificação e AST usando o protocolo EUCAST RAST. Esses resultados foram comparados com o método padrão de tratamento (SoC) para +aBCs, ou seja, subcultura em meio convencional plaqueado por meio de ágar sangue de ovelha (SBA), ágar chocolate (CA) e ágar MacConkey (MA), incubado aerobicamente por 16 h a 24 h, seguido de cartões de identificação e AST dados por aMIAST quando colônias isoladas aparecem. Hemoculturas mostrando cocos gram-positivos, bacilos gram-positivos, células de levedura em brotamento e ≥2 microrganismos diferentes na coloração inicial de Gram ou em meio plaqueado foram excluídas do estudo.

Protocol

O estudo, financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pelo AIIMS Bhopal, foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana Institucional (IHEC) vide carta nº: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Um volume amostral de 5 ml foi utilizado com base nos estudos realizados por Quesada et ^al.25 e Munoz-Davila et ^al.27.

1. Protocolo de inóculo padrão (SIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

1. Use luvas limpas e, dentro de um gabinete de biossegurança Classe IIa (BSC), desinfete o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
2. Retire aproximadamente 1 mL da mistura de caldo de sangue usando uma seringa estéril com uma agulha de 21 G.
3. Dispense 1 gota grande da mistura de caldo de sangue da agulha na superfície do meio plaqueado, ou seja, SBA, CA e MA. Riscar as placas e incubar as placas de cultura numa incubadora a 37 °C ± 2 °C em condições aeróbias durante 18-24 h.
4. Após a incubação, examinar as placas quanto ao aparecimento de colónias isoladas num BSC e prosseguir para a identificação e AST por aMIAST.
5. Para cada isolado, coloque um tubo de poliestireno aMIAST no suporte do tubo aMIAST e adicione 3 mL de solução salina estéril usando um dispensador conectado ao frasco de solução salina.
6. Toque de três a cinco colônias morfologicamente semelhantes com um fio de inoculação estéril e reto e transfira o inóculo bacteriano para o primeiro tubo.
7. Ajuste a turbidez usando solução salina estéril no tubo inoculado entre 0,47-0,63 McFarland usando um densitômetro.
8. Coloque a fixação capilar do cartão de identificação gram-negativo aMIAST no primeiro tubo.
9. Coloque os cartões selecionados em uma posição apropriada no. O inóculo no está pronto e chega ao aMIAST na seção de enchimento.
   CUIDADO: A idade da suspensão não deve exceder 30 minutos antes de inocular os cartões.
10. Carregue o em sua posição na câmara de enchimento com o código de barras de amostra voltado para dentro.
11. Feche a porta e pressione Preencher na tela da interface do usuário. O enchimento é um ciclo de 70 s. Quando o ciclo estiver concluído, a luz indicadora azul no sistema piscará. A colocação dos cartões no sistema aMIAST distribui o inóculo dentro das pequenas câmaras dos cartões pela máquina.
12. Remova o da câmara de enchimento, feche a porta e coloque na câmara de carregamento. Os códigos de barras são digitalizados automaticamente e verificados em relação à lista de trabalho eletrônica de virtual. Os canudos são selados automaticamente e os cartões são carregados automaticamente no carrossel. A seta azul piscando no aMIAST indica que o carregamento foi concluído.
13. Remova os resíduos de quando terminar. Consulte o procedimento de descarte de resíduos na literatura do produto ou siga outras práticas padrão. Utilizar o resto da suspensão nos tubos para subcultura em ágar CLED para verificação da pureza dos isolados.
14. Leia os resultados depois que o instrumento concluir a análise.

2. Protocolo de inóculo direto (DIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

1. Use luvas estéreis e, dentro de um gabinete de biossegurança, limpe o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
2. Usando uma seringa estéril com uma agulha de 21 G, retire 5 mL de alíquota da mistura de caldo de sangue de +naBC e transfira-a para um tubo separador de soro (SST) após desinfetar o septo de borracha com álcool isopropílico a 70% (Figura 2A).
3. Centrifugue esta alíquota por 10 min a 160 x g para depositar as células sanguíneas na mistura de caldo de sangue. Após a primeira centrifugação, observe o sobrenadante no qual as células sanguíneas se estabelecerão.
4. Abra a tampa do frasco para injetáveis dentro de uma cabine de biossegurança e, usando uma ponta estéril e uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo frasco para injetáveis de coleta de sangue simples (tampa vermelha) removendo sua tampa.
5. Coloque a tampa no frasco para injetáveis e centrifugue novamente por 10 min a 2000 x g. Após a segunda centrifugação, um pellet bacteriano se formará no fundo.
6. Aspire o sobrenadante e descarte-o usando uma pipeta estéril e uma ponta. O pellet bacteriano permanecerá no fundo do tubo e será usado para inocular o cartão de identificação aMIAST.
   NOTA: Um tubo separador de soro foi usado na primeira centrifugação a 160 x g. Isso foi baseado em estudos feitos por Quesada et ^al.25 e Munoz-Davila et ^al.27_, onde a primeira etapa de centrifugação foi feita aproximadamente a 30 x g e 60 x g, respectivamente. A mistura de caldo de sangue de um + aBC foi primeiro centrifugada em baixa velocidade em um SST para expulsar as células sanguíneas.
7. Coloque um tubo de poliestireno aMIAST no suporte do tubo aMIAST e adicione 3 mL de solução salina estéril usando um dispensador conectado ao frasco de solução salina.
8. Usando uma alça de inoculação estéril, retire o pellet bacteriano do fundo do frasco e inocule-o no tubo aMIAST
9. Repita as etapas 1.7-1.14.

3. AST pelo protocolo EUCAST RAST⁴

1. Mantenha as placas de ágar Mueller-Hinton (MHA) circulares de 90 mm não inoculadas prontas no gabinete de biossegurança.
2. Use luvas estéreis e, dentro de um gabinete de biossegurança, limpe o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
3. Usando uma seringa estéril, aspire 125 μL ± 25 μL de mistura de caldo de sangue não diluído de + naBC e adicione a cada placa de MHA no centro.
4. Espalhe o caldo suavemente sobre os pratos usando um cotonete estéril em três direções e aplique ≤ 6 discos antimicrobianos em cada prato.
5. Incubar as placas numa incubadora aeróbica a 35 °C± 1 °C durante 8 h. Após a conclusão da incubação, observar a pureza do isolado.
6. Leia as zonas de inibição às 8 h ± 5 min. Interprete os resultados usando a tabela de pontos de interrupção RAST para incubação curta após verificar os resultados de identificação bacteriana no aMIAST.
7. Relate os resultados da AST somente se o isolado for identificado como um dos RR-GN e as placas MHA e CLED estiverem crescendo um único morfotipo.

4. Controle de qualidade

1. Realize o controle de qualidade interno para o protocolo SIP do aMIAST de acordo com as instruções do fabricante, usando as cepas de referência recomendadas.
2. Realizar o controlo interno da qualidade do método RAST semanalmente, utilizando a estirpe de referência recomendada de E. coli , conforme descrito abaixo.
   1. Disponha 4 tubos de vidro estéreis em um suporte para tubos. Dispense 3 mL de solução salina estéril no primeiro tubo e 990 μL de solução salina estéril em cada um dos segundo, terceiro e quarto tubos.
   2. Faça uma suspensão de 0,5 McFarland da cepa QC das colônias isoladas de uma cultura noturna em mídia revestida.
   3. Usando uma pipeta e ponta estéreis, transfira 10 μL de suspensão do primeiro tubo para o segundo tubo.
   4. Após a mistura, transferir 10 μL de suspensão do segundo para o terceiro tubo e, em seguida, para o último tubo.
   5. Do último tubo, pegue 1 mL do inóculo usando uma seringa estéril com uma agulha e adicione-o a um aBC não inoculado.
   6. Adicione simultaneamente 5 mL de sangue de ovelha estéril no aBC usando uma seringa estéril com uma agulha e incube-o no CBCMS até que dê positivo devido à mudança na cor do sensor de emulsão líquida na base do aBC.
   7. Repita as etapas conforme explicado nas etapas 1-3 para identificação por SIP, DIP e RAST, respectivamente. Os resultados esperados são que a deformação CQ deve ser identificada corretamente por ambos os protocolos de identificação do aMIAST e os diâmetros das zonas nas placas RAST devem estar dentro da faixa especificada²⁸.

5. Análise estatística

1. Considere a identificação microbiana usando SIP como padrão-ouro e se a mesma identificação for obtida por DIP, considere-a como concordante.
2. Se um RR-GN, ou seja, um complexo de E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii identificado usando SIP for discordante no DIP, considere isso como erro maior (EM), enquanto considere o inverso como erro muito grande (VME), pois tem o potencial de emitir um relatório com identificação errada.
3. Calcule a taxa de concordância para RR-GN como a razão entre o número total de RR-GN concordantes e o número total de RR-GN identificados pelo SIP multiplicado por 100.
4. Calcule a taxa de EM como a razão entre o número de +naBCs identificados como tendo um não-RR-GN e o número total de +naBCs com RR-GN identificados pelo SIP multiplicado por 100.
5. Calcule a taxa de VME como a razão entre o número de +naBCs identificados erroneamente como tendo um RR-GN em DIP e o número total. de +naBCs testados por DIP multiplicados por 100.
6. Calcule o tempo para identificação do isolamento (TTI) como o tempo necessário para identificar o isolado por ambos os protocolos a partir do momento da sinalização da hemocultura pelo CBCMS.
7. Calcule as diferenças entre o DIP e o SIP como uma redução no TTI. Calcule isso apenas para os +naBCs concordantes com um RR-GN. Observe os respectivos pontos de tempo dos relógios do CBCMS e do aMIAST.
8. Gerencie dados e analise usando uma planilha. Utilizar o teste U de Mann-Whitney para variáveis contínuas, considerando um valor de p bilateral de ≤ 0,05 como estatisticamente significativo.

Results

Resultados gerais
Durante o período do estudo, 240 +naBCs foram identificados por aMIAST usando DIP e SIP. Destes, 15% (36/240) +naBCs foram considerados polimicrobianos após incubação noturna no meio plaqueado. Dos 204 +naBCs, a proporção de NR-GN identificada pelo SIP foi de 51,5% (105/204). Dentre eles, 47,6% (50/105) eram E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa e 24,8% (26/105) complexo A. baumannii . Uma descrição detalhada de todos os resultados de identificação por SIP é fornecida na Tabela 1.

Precisão diagnóstica na identificação microbiana
Dos 105 NR-GN, 98 (93,3%) e 99 (94,2%) foram concordantes com o DIP, até a identificação em nível de espécie e gênero, respectivamente. As taxas de concordância por organismo foram de 94% (47/50) para E. coli, 90% (18/20) para K. pneumoniae, 100% (9/9) para P. aeruginosa e 92,3% (24/26) para o complexo A. baumannii , conforme mostrado na Tabela 1. Em 7 +naBCs, os resultados foram discordantes até a identificação em nível de espécie usando DIP, dos quais aMIAST deu não identificado (3) ou identificou um Não-RR-GN (4), conforme mostrado na Tabela 2. Como esses resultados não obrigarão o microbiologista clínico a relatar, eles foram considerados erros maiores (EM). A taxa de EM em nosso estudo foi de 6,7% (7/105) até a identificação em nível de espécie. A proporção de GN-RR em aMIAST por SIP foi de 48,5% (99/204). Dentre eles, 60 (60,6%) foram concordantes por DIP até a identificação em nível de espécie. Entre 99 não-NR-GNs, um RR-GN foi identificado usando DIP em 4 +naBCs, conforme mostrado na Tabela 2. Essa discordância poderia ter levado a um erro de relatório e foi considerada um erro muito grave (VME). A taxa geral de EMV usando DIP foi de 1,7% (4/240). Uma descrição completa dos resultados e erros de identificação de todos os gram-negativos é mostrada na Tabela Suplementar 1.

Redução no tempo de identificação de isolamento (TTI)
O ITT de +naBCs concordantes na DIP foi significativamente menor do que o ITT na SIP (mediana (IIQ): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (teste de Mann-Whitney)). A diferença mediana no ITT entre os dois protocolos foi de 1635 min (IQR: 1964-1299).

Figura 1: Fluxo de trabalho do estudo: descrevendo o fluxo de trabalho no estudo para frasco de hemocultura sinalizado positivamente com gram-negativos monomórficos sendo processados pelo protocolo de inóculo padrão e direto. Abreviaturas: +aBC = frasco de hemocultura sinalizado positivamente, +naBC = frasco de hemocultura sinalizado positivamente com gram-negativos monomórficos, DIP = protocolo de inóculo direto, SIP = protocolo de inóculo padrão, SBA = ágar sangue de ovelha, CA = ágar chocolate, MA = ágar MacConkey, RR-GN = gram-negativo reportável RAST, TAT = tempo de resposta Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Protocolo de inóculo direto para identificação bacteriana: mostrando imagens dos frascos durante a realização do protocolo de inóculo direto. Abreviaturas: + naBC = frasco de hemocultura sinalizado positivamente com gram-negativos Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gram-negativos reportáveis RAST	Isolados testados (n)	Concordante	Identificação incorreta	Sem identificação
		n (%)	n (%)	n (%)
Total	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Complexo Acinetobacter baumannii	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Um isolado corretamente identificado em nível de gênero, mas não em nível de espécie (complexo Acinetobacter baumannii identificado como A. haemolyticus)

Tabela 1: Resultados da identificação bacteriana no protocolo de inóculo direto. Os resultados são apenas para Gram-negativos reportáveis RAST. Abreviações: n = numerador, % = porcentagem.

Gram-negativos	Total de isolados testados	Erro grave			Erro muito grande, n (%)
		Número	Identificação incorreta	Sem identificação	(identificado como)
		n (%)	n	n
Escherichia coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Complexo Acinetobacter baumannii	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	NA			1 (10%)
					(E. coli)
Complexo Enterobacter cloacae	8	NA			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	NA			1 (7.1%)
					(Complexo A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis	9	NA			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Abreviaturas - n: numerador, %: percentual, ID: identificação, NA: não aplicável,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Tabela 2: Detalhes de erros maiores e muito importantes por protocolo de inóculo direto. Abreviaturas: n = numerador, % = percentual, ID = identificação, NA = não aplicável, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Tabela Suplementar 1: Resultados detalhados da identificação do organismo em ambos os protocolos, juntamente com os resultados dos erros no protocolo de inóculo direto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Usando o DIP, identificamos com sucesso os RR-GNs com considerável precisão diagnóstica. O TTI médio após sinalização positiva de aBC foi de apenas 507 min (~ 8,5 h). Assim, quando feito em conjunto com o método EUCAST RAST para determinação de AST, ele pode fornecer identificação isolada em 8 h de tempo de leitura de AST. Esta abordagem tem o potencial de implementar o método EUCAST RAST, evitando a necessidade de identificação baseada em espectrometria de massa. Isso é uma bênção para os ambientes de poucos recursos que desejam implementar o método EUCAST RAST em seu fluxo de trabalho de rotina para reduzir o tempo de relatórios clínicos e contornar os principais obstáculos à sua implementação.

Antes da introdução do método EUCAST RAST, vários autores avaliaram a precisão do teste direto de + aBC para vários sistemas aMIAST^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 29 , 30 , 31} . Nesses estudos, os protocolos de teste direto diferiram em seguir uma única etapa de centrífuga 29,30,31,32 ou uma etapa de centrífuga dupla 21,22,24,25,26,27 para fazer o pellet bacteriano. No método de etapa única, a mistura de caldo de sangue de um +aBC foi centrifugada em alta velocidade em um tubo separador de soro (SST) para pellet as bactérias acima da camada de gel de silicone. O pellet foi utilizado para preparar o inóculo para a inoculação dos cartões de identificação. No método de centrifugação dupla, a mistura de caldo de sangue de um +aBC foi primeiro centrifugada em baixa velocidade em um SST para expulsar as células sanguíneas. Deste tubo, o sobrenadante contendo bactérias foi removido e transferido para um novo tubo e submetido a centrifugação de alta velocidade. Desse tubo, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi usado para inocular os cartões de identificação apropriados. Nesses estudos, a taxa de concordância variou de 62% a 100%, mas, em geral, a acurácia foi maior com o método de centrifugação dupla.

Descobrimos que o método era simples de executar e foi realizado em um laboratório de diagnóstico de rotina com uma força de trabalho de >10 técnicos de laboratório em rodízio, comprovando a robustez do método. Em ~ 94% (98/105) + naBCs contendo um dos RR-GN, o DIP identificou corretamente o microrganismo. A taxa de concordância para as diferentes categorias de organismos também foi comparável entre si, pois foram de 94%, 90%, 100% e 92,3%, respectivamente, para o complexo E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii. Também descobrimos que a taxa de concordância geral para qualquer gram-negativo foi abaixo do ideal, ~ 77% (157/204). No entanto, a maioria dessas identificações incorretas ocorreu com gram-negativos não fermentativos, como Acinetobacter spp. diferente do complexo baumannii, Pseudomonas spp. diferente de aeruginosa, Moraxella spp. e Sphingomonas paucimobilis, que geralmente são considerados contaminantes comuns da pele. Erros de identificação com gram-negativos não fermentativos também foram observados por outros autores^21,23, o que provavelmente se deve à baixa reatividade dessas bactérias nos cartões de identificação aMIAST.

Encontramos uma redução significativa no TTI de bactérias dentro dos +naBCs usando DIP. O TTI mediano do DIP foi cerca de 4 vezes menor do que o TTI mediano do SIP (507 min vs 2171 min) quando feito em um laboratório de diagnóstico clínico de rotina. Este ITT de ~8,5 h também incluiu o intervalo entre a sinalização positiva de aBC e a realização da inoculação do cartão aMIAST, pois o tempo médio para isolar a análise por aMIAST foi de apenas 5,45 h ± 1,6 h. Adicionando o tempo médio à positividade de 728 min ± 301 min (~ 12 h) para +naBCs concordantes em nosso estudo, essa abordagem de identificação bacteriana tem o potencial de fornecer relatórios no mesmo dia após receber o aBC em um laboratório de diagnóstico de rotina.

Existem certas limitações também, com o DIP. Em primeiro lugar, como se trata de uma utilização off-label da preparação de inóculo, os resultados devem ser considerados preliminares, assim como os resultados da AST pelo EUCAST RAST. No entanto, serve ao propósito principal de identificar apenas os RR-GNs com considerável precisão diagnóstica em tempo hábil. Em segundo lugar, existe uma possibilidade prática de desperdício de recursos de teste, como em cerca de 60% +naBCs; não teríamos sido capazes de relatar devido a infecções polimicrobianas ou identificação de um não RRGN. Esse desperdício de recursos se aplica a qualquer um dos métodos AST diretos automatizados mais recentes para hemoculturas. Em terceiro lugar, a taxa de infecções polimicrobianas e a identificação de contaminantes cutâneos comuns foram maiores neste estudo devido a práticas inadequadas de coleta de amostras. Em quarto lugar, não confirmamos a identidade dos isolados testados com espectrometria de massas, que é o atual padrão-ouro para identificação bacteriana.

Este estudo estabelece com sucesso que, mesmo com testes fenotípicos, é possível fazer relatórios no mesmo dia de hemoculturas positivas, especialmente em bacteremia gram-negativa. Isso tem o potencial de reduzir consideravelmente a duração do início da terapia antimicrobiana apropriada nos países de baixa e média renda, onde os diagnósticos microbiológicos para identificação bacteriana e AST dependem fortemente de testes fenotípicos convencionais. Essa abordagem deve ser validada pela realização de um estudo multicêntrico e seu impacto potencial nos resultados dos pacientes, e como uma ferramenta de administração antimicrobiana deve ser o foco para futuros ensaios clínicos em LMICs.

Para concluir, o DIP para aMIAST complementa o método EUCAST RAST para permitir a identificação precoce de RR-GNs. Isso evita a necessidade de confiar em técnicas avançadas de identificação microbiana e AST, pois o tempo para relatar com essas abordagens é comparável a essa abordagem. Nos casos de bactérias Gram-negativas, o relatório no mesmo dia é possível por meio de métodos fenotípicos convencionais, se forem otimizados ao máximo. Isso tem o potencial de reduzir a duração do tratamento antimicrobiano de amplo espectro e facilitar a administração antimicrobiana em ambientes com recursos limitados.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
fortes
30 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD035-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco amoxiclav (20/10 µ g)	Himedia, Mumbai, Índia	SD063-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de cefotaxima 5 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD295E-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de ceftazidima 10 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD062A-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Ciprofloxacina disco (5 µ g)	Himedia, Mumbai, Índia	SD060-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de co-trimoxazol (23,75/1,25 µ g)	Himedia, Mumbai, Índia	SD010-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de gentamicina 10 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD016-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Imipenem disco 10 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD073-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Levofloxacina disco 5 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD216-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco Meropenem 10 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD727-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de piperacilina-tazobactam (30/6 µ g)	Himedia, Mumbai, Índia	SD292E-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
Disco de tobramicina 10 µ g	Himedia, Mumbai, Índia	SD044-1VL	Teste de suscetibilidade antimicrobiana
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota EUA	0335A	Cepa bacteriana Gram negativa recomendada para controle de qualidade em RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d' Etoille, França	412CM8423	Sistema de hemocultura automatizado contínuo
Gabinete de biossegurança II Tipo A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, Índia	DFP-2/21-22/149	Para proteção contra agentes perigosos e infecciosos e para manter o controle de qualidade
Base de ágar sangue nº 2	Himedia, Mumbai, Índia	M834-500G	Preparação de ágar sangue e ágar chocolate
Modelo de centrífuga clínica SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, Índia	HLL/2021-22/021	Centrifugação em baixa e alta velocidade para separação do sobrenadante
Dispensette S Dispensador analógico ajustável para garrafas	BrandTech, Essex CT, Inglaterra	V1200	Dispensando a quantidade exata de ágar Salino
MacConkey	Himedia, Mumbai, Índia	M008-500G	Meio diferencial para fermentadores de lactose/ não fermentadores Bacilos Gram negativos
Micropipeta (100-1000 µ L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, Índia	NJ478162	Transferência de sobrenadante após a primeira centrifugação, descartando o sobrenadante após a segunda centrifugação
Pontas de micropipeta (200-1000 µ L)	‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, Índia	521020	Transferência do sobrenadante após a primeira centrifugação, descarte do sobrenadante após a segunda centrifugação
Ágar Mueller-Hinton	Himedia, Mumbai, Índia	M173-500G	Teste de suscetibilidade antimicrobiana pelo método Kirby-Bauer de difusão em disco
Loop de nicromo D-4	Himedia, Mumbai, Índia	LA019	Para listras em meios de cultura
Fio reto de nicromo	Himedia, Mumbai, Índia	LA022	Para inoculação de facadas
Luvas estéreis Nulife	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, Índia		Por segurança precauções
Frasco simples (frasco com tampa vermelha), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, EUA	367815	Obtenção de pellet após segunda centrifugação
Sangue de ovelha	Labline Trading Co., Hyderabad, Índia	70014	Preparação de ágar sangue e tubo de ágar
chocolate SST II, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, EUA	367954	Separação sobrenadante na primeira centrifugação
Cotonete estéril (com vara de madeira)	Himedia, Mumbai, Índia	PW005-1X500NO	Cultura de grama de caldo de hemocultura para teste de suscetibilidade antimicrobiana
Seringa hipodérmica estéril de uso único 5ml / cc	Nihal Healthcare, Solan, Índia	2213805NB2	Preparando alíquotas de + aBC
VITEK DensiCHEK Kit de referência	McFarlandbioMérieux, Marcy d' Etoille, França	422219	Densitômetro para verificar a turbidez da
suspensão Solução salina VITEK (NaCl 0,45%)	bioMèrieux, Marcy d' Etoille, França	V1204	de turbidez padrão McFarland
	bioMérieux, Marcy d' Etoille, França	533306-4 REV	Suporte para a colocação adequada de tubos antes da inoculação do cartão de identificação
VITEK tubes	bioMèrieux, Marcy d' Etoille, França		Tubos para preparação de inóculo
VITEK-2 Compact 60	bioMèrieux, Marcy d' Etoille, França	VKC15144	Identificação automatizada e sistema AST
VITEK-2 GN card	bioMèrieux, Marcy d' Etoille, França	21341	Identificação de bacilos Gram negativos