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Preparação de amostras de retina para microscopia eletrônica de volume

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DOI:

10.3791/66589

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24 de maio de 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve as etapas detalhadas para preparar amostras de retina para microscopia eletrônica de volume, com foco nas características estruturais dos terminais fotorreceptores da retina.

Resumo

A microscopia eletrônica de volume (Volume EM) surgiu como uma ferramenta poderosa para visualizar a estrutura 3D de células e tecidos com precisão em nível nanométrico. Dentro da retina, vários tipos de neurônios estabelecem conexões sinápticas nas camadas plexiformes interna e externa. Embora as técnicas convencionais de EM tenham produzido informações valiosas sobre as organelas subcelulares da retina, sua limitação está em fornecer dados de imagem 2D, o que pode dificultar medições precisas. Por exemplo, quantificar o tamanho de três pools de vesículas sinápticas distintas, cruciais para a transmissão sináptica, é um desafio em 2D. O Volume EM oferece uma solução fornecendo dados 3D em grande escala e alta resolução. Vale a pena notar que a preparação da amostra é uma etapa crítica no Volume EM, impactando significativamente a clareza e o contraste da imagem. Nesse contexto, delineamos um protocolo de preparação de amostras para a reconstrução 3D de terminais axônicos fotorreceptores na retina. Este protocolo inclui três etapas principais: dissecção e fixação da retina, processos de incorporação de amostras e seleção da área de interesse.

Introdução

A retina é densamente repleta de axônios neuronais entrelaçados e dendritos que formam sinapses entre eles1. A microscopia é uma ferramenta indispensável para estudar a anatomia da retina, pois possui estruturas finas, intrincadas e pequenas. Embora a microscopia eletrônica (EM) forneça um poder incomparável para investigar a ultraestrutura de organelas subcelulares e a localização precisa de proteínas específicas no nível nanométrico2, ela produz imagens limitadas ao plano bidimensional (2D), levando à perda potencial de informações importantes.

O desenvolvimento de técnicas emergentes de microscopia eletrônica de volume de alta resolução (Volume EM) suporta o fornecimento de informações estruturais tridimensionais (3D) mais abrangentes e em maior escala. Alguns métodos de EM 3D foram recentemente revisados por outros 3,4,5. O 3D EM permite a reconstrução da forma neuronal e detalhes de conectividade, permitindo uma análise quantitativa precisa das estruturas de interesse. Isso demonstra que os dados obtidos pelo EM de volume são mais sistemáticos, completos e precisos.

Os fotorreceptores da retina, constituindo os neurônios iniciais na sinalização visual 6,7, estabelecem sinapses com dendritos de células bipolares e horizontais de segunda ordem no terminal do fotorreceptor para facilitar os sinais excitatórios 8,9. Esses terminais, chamados de pedículos de cone e esférulas de bastonetes, abrangem três componentes cruciais: mitocôndrias, fitas sinápticas e vesículas sinápticas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado predominantemente na estrutura geral das sinapses em fita, houve uma notável ausência de investigação sobre a estrutura fina dos principais componentes, incluindo mitocôndrias, fitas, pools de vesículas e sua organização espacial em terminais 10,11,12,13. Uma análise precisa e sistemática de cada componente, juntamente com uma compreensão de sua interassociação dentro dos terminais fotorreceptores, é vital para desvendar a organização espacial e compreender de forma abrangente as funções de processamento visual. Nos fotorreceptores, as mitocôndrias estão presentes principalmente no segmento interno, corpo celular e terminal. Nós nos concentramos aqui nas mitocôndrias nos fotorreceptores terminais. A microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM), um tipo de EM de volume com alta resolução (resolução x, y e z < 5 nm) e um fluxo de volume relativamente grande 4,14, é uma ferramenta potente para visualizar com precisão a estrutura 3D dos terminais fotorreceptores.

Tanto o FIB-SEM quanto o Microscópio Eletrônico de Varredura de Face de Bloco Serial (SBF-SEM) são Volume EM baseado em SEM para obter a imagem de tecidos por varredura da superfície da amostra. As características ultraestruturais da superfície de um espécime são reveladas através do contraste criado pela intensidade dos elétrons secundários ou retroespalhados (BSE) quando o feixe de elétrons varre a amostra15. Essencialmente, a detecção de BSE ou elétrons secundários da superfície da seção transversal de uma amostra de tecido embebido em resina em MEV permite a obtenção de imagens da amostra incorporada16,17. Quando a BSE ou os elétrons secundários são menos gerados, as informações sobre a superfície da amostra só podem ser obtidas. A obtenção de contraste consistente e imagens seriais de alta qualidade requer deposição suficiente de metais pesados na amostra. Portanto, protocolos específicos de preparação de amostras são cruciais para segmentação subsequente, reconstrução 3D e análise ao utilizar SEM para imagens seriadas. O método ósmio-tiocarbohidrazida-ósmio (OTO) é um esquema típico de preparo de amostras para microscopia eletrônica 3D de amostras biológicas, preservando a estrutura das membranas contendo lipídios e mantendo bom contraste18,19.

Aqui, desenvolvemos o método OTO para a preparação de amostras de retina para o uso do Volume EM. Este processo se concentra particularmente na dissecação da retina, determinando o tempo ideal de fixação para o tecido da retina e detalhando os procedimentos e precauções específicos na preparação de amostras 3D. Além disso, a segmentação e a reconstrução 3D da estrutura alvo são etapas integrais nesta aplicação estendida. A retina, sendo uma estrutura pequena e desafiadora para a obtenção de materiais, requer operações rápidas e precisas para EM, com tempos fixos e reagentes frescos preparados para uso imediato.

Protocolo

Os protocolos de cuidados e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Todos os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão e fornecidos com uma dieta padrão de ração.

1. Dissecção e fixação da retina

  1. Anestesiar os camundongos (C57BL / 6J, macho, 8 semanas de idade, 20-25 g) injetando 2,2,2-tribromoetanol (0,25 mg / g de peso corporal) por via intraperitoneal. Confirme a profundidade da anestesia sem retração da pata traseira após beliscar o dedo do pé ou sem reflexo de piscar. Em seguida, desloque a vértebra cervical ainda sob anestesia para sacrificar o animal.
    NOTA: O tribromoetanol foi escolhido por sua eficácia bem documentada na indução de anestesia rápida e confiável em modelos de pequenos animais, particularmente para procedimentos de curto prazo. Embora os anestésicos de grau farmacêutico sejam preferidos, o tribromoetanol oferece vantagens específicas em certos protocolos, tornando-o uma alternativa adequada quando preparado e administrado adequadamente. Todas as precauções foram tomadas para garantir seu uso seguro e eficaz. Este estudo segue as considerações éticas, garantindo preparação, administração e monitoramento adequados para mitigar os riscos potenciais associados ao seu uso.
  2. Remova os olhos com uma tesoura curva e mergulhe os olhos em uma solução mista contendo 2% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4).
  3. Remova o segmento anterior e vítreo dos olhos com uma pinça sob o microscópio de dissecação.
  4. Descasque a esclera com as duas pinças até que a retina esteja completamente isolada da ocular.
  5. Corte a retina rapidamente em tiras de 100 a 200 μm de espessura com uma navalha e manuseie as tiras de retina com uma pipeta Pasteur em um novo tubo de microcentrífuga (EP) contendo 2% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4) por 2 h à temperatura ambiente (RT) no rotador. Após a conclusão, coloque os tubos a fixar a 4 °C durante 24 h.

2. Processo de incorporação de amostras

  1. Após lavar em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) 5 vezes por 15 min cada, incube as tiras de retina com uma solução contendo ferrocianeto de potássio a 1,5% e OsO4 a 1% (em PB, pH 7,4) em cacodilato de sódio 0,1 M com CaCl 4 mM2 por 1,5 h no escuro no gelo.
    NOTA: A incubação escura e a falta de fosfato podem evitar a precipitação e artefatos na amostra.
  2. Lave as tiras de retina 3 vezes em ddH2O por 10 min cada e, em seguida, trate com tiocarbohidrazida a 1% em ddH2O por 30 min no escuro em RT.
  3. Depois de enxaguar em ddH2O 3 vezes por 15 min cada, incubar as tiras de retina em 2% OsO4 (em PB, PH 7,4) por 45 min no escuro em RT.
  4. Depois de lavar em ddH2O 3 vezes por 15 min cada, mergulhe as tiras de retina em acetato de uranilo aquoso a 1% no escuro a 4 ° C durante a noite.
  5. No dia seguinte, após lavar em ddH2O 3 vezes por 15 min cada, trate as tiras de retina com nitrato de chumbo a 0,66% em ácido L-aspártico (0,03 M, pH 5,5) por 40 min a 65 °C.
  6. Após lavar em ddH2O 3 vezes por 15 min cada, desidrate as tiras de retina com concentração ascendente de etanol de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% por 20 min em cada solução.
  7. Trate as tiras de retina com uma solução mista contendo etanol e acetona iguais por 20 min, seguida de uma lavagem com acetona 2 vezes por 20 min cada.
  8. Infiltre as tiras de retina em acetona/resina misturada na proporção de 7:3 no escuro em RT durante a noite e, em seguida, acetona/resina em 3:7 no escuro por 24 h em RT.
    NOTA: A composição precisa da resina é a seguinte: Epon812 10.06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5.94 mL e DMP-30 0.2 mL.
  9. Troque os tubos no dia seguinte e infiltre as tiras de retina com resina pura por 24 h a 45 °C. Troque a resina novamente no dia seguinte e incorpore as tiras de retina por 48 h a 60 °C.
    NOTA: O objetivo de aumentar a temperatura é melhorar a penetração.

3. Seleção da área de interesse

  1. Corte os blocos de resina em seções de 1 μm de espessura, core as seções com 1% de azul de toluidina, e observe a estrutura geral da retina sob microscopia de luz para selecionar as regiões ásperas de interesse.
  2. Revestir os blocos de resina com platina usando um revestidor por pulverização catódica, seguido de fresagem com seção de 70 nm de espessura usando uma microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizado sob uma corrente de 0,23 nA e tensão de aceleração de 30 kV.
  3. Faça uma pré-triagem da seção usando FIB-SEM com ampliação de 2000x para identificar as regiões de interesse precisas.
  4. Colete os dados usando FIB-SEM com uma corrente de feixe de 0,69 nA e tensão de aceleração de 2 kV. Os outros parâmetros são os seguintes: tempo de permanência = 2 μs, tamanho do voxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Resultados

A Figura 1A mostra a imagem dos terminais fotorreceptores retinianos preparados usando o método tradicional de dupla fixação química, e a Figura 1B mostra a imagem dos terminais fotorreceptores retinianos preparados usando o método OTO. Ambos foram amostrados por FIB-SEM. Pode-se ver claramente que a estrutura da membrana celular pode ser retida o máximo possível usando o método OTO, e até mesmo o contorno das vesículas pode ser visto claramente. Além disso, o contraste das imagens obtidas pelo método OTO também é mais claro.

A Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho experimental empregado para reconstruir as características ultraestruturais dos terminais fotorreceptores. A reconstrução se concentrou em quatro tipos de terminais fotorreceptores, incluindo pedículos do cone M, pedículos do cone S, esférulas bastonete1 e esférulas bastonetes2. A ênfase principal estava em componentes essenciais, como mitocôndrias, fitas sinápticas e pools de vesículas sinápticas dentro dos terminais fotorreceptores.

A Figura 3 exibe as mitocôndrias reconstruídas e as fitas sinápticas nos terminais fotorreceptores dos bastonetes. Notavelmente, as fitas sinápticas das esférulas da haste2 exibem uma forma distinta de ferradura, normalmente apresentando uma única fita por esférula. Além disso, a Figura 2 destaca a presença de duas mitocôndrias nas esférulas dos bastonetes, com uma posição consistente dentro do espaço central dos terminais, localizadas acima das fitas sinápticas. Todas as estruturas foram traçadas manualmente, página por página.

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Figura 1: Exemplos de imagens amostradas usando FIB-SEM para o método tradicional de dupla fixação química e método OTO. (A) Método tradicional de dupla fixação química. (B) Método OTO. Barra de escala: 1000 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Fluxo de trabalho de reconstrução 3D para terminais fotorreceptores usando FIB-SEM. Após o alinhamento usando o software de visualização de dados 3D, as imagens seriais foram segmentadas manualmente e renderizadas para análise posterior. (A) Imagens seriais originais. (B) Imagens alinhadas. (C) Imagens segmentadas. (D) Imagens reconstruídas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Reconstrução 3D. As imagens representativas da reconstrução 3D retratam terminais fotorreceptores em branco, mitocôndrias em laranja e fitas sinápticas em azul. Barra de escala: 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Implementamos o protocolo de preparação de amostras Volume EM da OTO para analisar a estrutura terminal dos fotorreceptores no tecido retiniano. O foco foi detalhar todo o procedimento, desde o descolamento e fixação da retina até a apresentação dos resultados da reconstrução 3D dos terminais axônicos fotorreceptores.

A característica distintiva do tecido retiniano, ao contrário do tecido cerebral, reside na falta de diferenças regionais. Composta por três camadas de corpos celulares neuronais e duas camadas de conexões sinápticas, a retina exibe uma estrutura regular e hierárquica, apesar da complexidade de seus componentes neuronais e sinápticos20. Ao dissecar a retina, torna-se imperativo garantir que as tiras finas sejam minimizadas para garantir um contraste uniforme nos estágios subsequentes de preparação da amostra. Os terminais axônicos fotorreceptores, estruturas críticas de interesse, estão situados na camada plexiforme externa (OPL) da retina. A natureza hierárquica e organizada da retina permite a localização eficiente das estruturas-alvo, facilitando a amostragem precisa durante o EM e garantindo a precisão dos resultados da reconstrução 3D subsequente.

O volume EM facilita a visualização tridimensional de circuitos neurais locais e conexões sinápticas dentro da retina em nanoescala, utilizando seções seriais21,22. Essa técnica permite a geração automática de imagens 3D de alta resolução, e o FIB-SEM tem o potencial de revelar detalhes intrincados de atividades fisiológicas e patológicas. Portanto, manter o contraste estável da imagem em todo o bloco é crucial durante o processo de preparação da amostra. Para obter condutividade uniforme, empregamos o método OTO pré-incorporado, uma abordagem clássica amplamente reconhecida por sua eficácia em aumentar o contraste na microscopia eletrônica de varredura (MEV) 18 , 23 , 24 . Este método envolve um revestimento duplo de ósmio combinado com tiocarbohidrazida, garantindo a condutividade ideal para amostras grandes. Além disso, o tratamento com duplo ósmio contribui para a preservação superior das estruturas da membrana lipídica, adicionando uma camada de precisão às nossas investigações. As amostras de retina são hierárquicas, os blocos de tecido são pequenos e fáceis de penetrar, e o método OTO pode manter melhor contorno da membrana celular e contraste uniforme da imagem.

Vários fatores críticos contribuem para o sucesso deste protocolo. Em primeiro lugar, a coleta rápida da retina e os tempos de fixação precisos são fundamentais para manter a estrutura subcelular ideal. Em segundo lugar, garantir concentrações adequadas de ósmio e tiocarbohidrazida é essencial para preservar o contraste na estrutura da membrana das imagens da série. O ósmio, em particular, desempenha um papel crucial ao se ligar às moléculas lipídicas, aumentando o sinal da BSE.

Nosso protocolo de preparação de amostras de retina é fácil de usar, não requer equipamento adicional e minimiza o tempo de processamento. Essa característica destaca sua potencial aplicabilidade a outras técnicas de Volume EM, sugerindo versatilidade e facilidade de adoção em diversas configurações experimentais. O método da OTO aumenta notavelmente o contraste das imagens FIB-SEM. No entanto, os detalhes sobre a membrana celular, especialmente a estrutura da bicamada, ainda podem parecer um pouco borrados. Nosso atual esquema de preparação de amostras envolve algum sacrifício de pequenos detalhes na estrutura celular até certo ponto. Nosso objetivo é desenvolver métodos otimizados no futuro para abordar e melhorar essa limitação.

Divulgações

Os autores não têm divulgações.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103), Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
AcetonaMicroscopia Eletrônica Ciência10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
Incorporando o moldeBeijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon ciênciamicroscopia eletrônica14900
Sigma64-17-5
GlutaraldeídoCiência da microscopia eletrônica16020
Helios NanoLab 600i SEM do duplo-feixeFEI
ácido L-aspárticoSigma56-84-8
Nitrato de chumboSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Um componente do tampão fosfato
NaH2PO4. H2OSigma71507Um componente do tampão fosfato
OsO4TED PELLA4008-160501
Ciência da Microscopia Eletrônicade Paraformaldeído157-8
Ferrocianeto de potássioSigma14459-95-1
Cacodilato de sódioSigma6131-99-3
Revestidor de pulverização catódicaLeicaACE200
TiocarbohidrazidaSigma2231-57-4
Acetato de uraniloTED PELLACA96049
da da resina

Referências

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