Artigo de método

Técnica de Implante Ósseo Cirúrgico para Modelos de Diabetes e Osteoporose na Tíbia de Ratos

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DOI:

10.3791/66591

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5 de julho de 2024

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1Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona, 2Department of Oral Surgery, Davallmed Clinic. Porto, 3Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Barcelona Research Centre in Multiscale Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 5Department of Periodontology, Davallmed Clinic. Porto, 6Department of Odontostomatology, University of Barcelona, 7Oral Health and Masticatory System Research Group at the Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 8Preclinical imaging platform, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 9Preclinical Therapeutics Core, Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Animal facility, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 11UCSF Gnotobiotics Core Facility, University of California, San Francisco, 12Human Anatomy and Embryology Unit, Experimental Pathology and Therapeutics Department, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona

Neste artigo

Resumo

A colocação de implantes em um modelo de rato é um procedimento experimental essencial para a pesquisa clínica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico abrangente para implante de implantes de titânio na tíbia de modelos de ratos com diabetes e osteoporose.

Resumo

O rato há muito serve como um modelo animal valioso em implantodontia e ortopedia, particularmente no estudo das interações entre biomateriais e tecido ósseo. A tíbia do rato é frequentemente escolhida devido ao seu fácil acesso cirúrgico através de finas camadas de tecido (pele e músculo) e ao formato achatado de sua face medial, facilitando a inserção cirúrgica de dispositivos intraósseos. Além disso, este modelo permite a indução de doenças específicas, imitando várias condições clínicas para avaliar as respostas biológicas a diferentes condições de implante, como geometria, textura da superfície ou pistas biológicas. No entanto, apesar de sua estrutura cortical robusta, certos dispositivos intraósseos podem exigir adaptações no design e no tamanho para uma implantação bem-sucedida. Portanto, estabelecer métodos cirúrgicos padronizados para manipular tecidos moles e duros na região de implantação é essencial para garantir a colocação adequada do implante ou dispositivo de parafuso, particularmente em áreas como implantodontia e ortopedia. Este estudo incluiu oitenta ratos Sprague Dawley divididos em dois grupos com base em suas respectivas doenças: Grupo 1 com osteoporose e Grupo 2 com Diabetes Tipo 2. Os implantes foram realizados em 4 semanas e 12 semanas, com o mesmo cirurgião seguindo uma técnica cirúrgica consistente. Foi observada uma resposta biológica positiva, indicando osseointegração completa de todos os implantes colocados. Esses resultados validam o sucesso do protocolo cirúrgico, que pode ser replicado para outros estudos e servir de referência para a comunidade de biomateriais. Notavelmente, os valores de osseointegração permaneceram estáveis em 4 semanas e 12 semanas para ambos os modelos de doença, demonstrando uma integração durável do implante ao longo do tempo e enfatizando o estabelecimento de uma conexão óssea íntima já em 4 semanas.

Introdução

A escolha comum de ratos como sujeitos experimentais se deve ao fato de serem fáceis de reproduzir e relativamente baratos em comparação com modelos animais maiores. O surgimento de novos procedimentos, como a reprodução confiável de um distúrbio, por exemplo, osteoporose ou diabetes, torna esse modelo especialmente útil para analisar o uso potencial de tratamentos e/ou a influência da doença na resposta biológica a drogas e dispositivos ou procedimentos cirúrgicos 1,2.

O ganho de massa óssea do rato ocorre principalmente durante os primeiros 6 meses de vida, embora alguns pesquisadores acreditem que o osso longo cresça constantemente por pelo menos um ano com um aumento progressivo no comprimento1. Com o envelhecimento, há uma transição da modelagem para a remodelação, que não ocorre em todos os casos igualmente em todos os ossos2. As ratas Sprague Dawley fêmeas crescem mais lentamente do que os ratos machos e atingem um pico de peso mais baixo do que os ratos machos1. O alongamento ósseo contínuo e a dinâmica variada da remodelação óssea em ratos são fatores que devem ser levados em consideração ao abordar questões de saúde humana; No entanto, ainda não foi possível encontrar nenhuma pesquisa experimental que mostre o desenvolvimento ósseo de rato ao longo da vida ou a incapacidade da espécie de remodelar o osso1. Se a experimentação começar por volta dos 10 meses de idade, uma margem de pelo menos 1 mm da placa de crescimento da tíbia deve ser deixada intacta devido a esse crescimento ósseo longitudinal, uma questão a ser considerada em estudos com implantes dentários2. Os hormônios também são um parâmetro chave na pesquisa óssea, pois aos 8 meses de idade, os ratos machos apresentaram largura óssea 22% maior e resistência à ruptura 33% maior do que as fêmeas na tíbia3.

A reprodução confiável de um distúrbio é, portanto, muito importante na ortopedia e na implantodontia, uma vez que a osseointegração de um parafuso ortopédico ou implante dentário é um processo complexo que depende de vários fatores que influenciam a resposta sistêmica ao implante do dispositivo no osso. Sabe-se que distúrbios sistêmicos como osteoporose e diabetes afetam a taxa de sucesso em ortopedia e implantodontia, portanto, a reprodução confiável desses distúrbios em modelos de ratos pode ser aplicada para explorar maneiras de superar essas limitações.

A tíbia de ratos, devido ao fácil acesso cirúrgico, volume ósseo moderado e formato achatado na placa medial, a torna adequada para experimentos cirúrgicos de implante ósseo 4,5, e tem sido utilizada em inúmeras pesquisas que exploram os efeitos da superfície do implante na osseointegração 4,5,6. Um número crescente de estudos avalia os efeitos na osseointegração de revestimentos e substâncias adicionadas à superfície do implante em animais saudáveis7 e em animais comprometidos afetados por diabetes ou osteoporose 8,9,10,11,12,13,14.

O número de dispositivos de implante colocados na tíbia de um rato é limitado e pode diferir dependendo do tipo de estudo. Dependendo do número de implantes ou condições de estudo, as dimensões dos dispositivos devem ser adaptadas para minimizar o trauma cirúrgico. Em estudos com um implante, um implante de tamanho quase humano pode ser colocado (2,0 mm de diâmetro e 4 a 5 mm de comprimento), e a ancoragem bicortical pode ser alcançada 6,7,15,16. As dimensões dos implantes em protocolos multiimplantares devem adotar um tamanho de implante adequado (1,5 mm de diâmetro e 2,5 mm de comprimento)4,17.

O presente estudo tem como objetivo descrever um protocolo cirúrgico padronizado para colocação de implante de titânio na tíbia de dois modelos de ratos: o modelo de osteoporose e o modelo de rato com diabetes. Além disso, este estudo permite testar o protocolo cirúrgico para avaliar diferentes tipos de biofuncionalização da superfície do implante e seu efeito na osseointegração.

Uma amostra de 80 ratos foi dividida em dois grupos. No grupo 1, foram selecionadas 40 fêmeas de Sprague Dawley ovariectomizadas e 5 animais sham, com peso médio de 484 g e idade média de 12 semanas. Com base nas recomendações do fornecedor (consulte a Tabela de Materiais), três meses após a castração, o experimento começou. Esse período de espera garantiu o desaparecimento dos hormônios sexuais. A osteoporose foi confirmada no momento da cirurgia com base na análise óssea da microtomografia computadorizada (micro-CT), que refletiu uma média de 20% de perda óssea em comparação com o grupo simulado. O grupo 2 consistiu em 40 ratos Sprague Dawley geneticamente modificados BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) com diabetes tipo II. O peso médio foi de 730 g e a idade média foi de 12 semanas. Antes da cirurgia, o estado diabético foi confirmado com três dias consecutivos de medidas de glicose com resultados superiores a 200 mg/dL. A glicose foi medida com glicosímetro em 6 h de jejum, e uma gota de sangue foi coletada por punção da cauda.

Foram utilizados implantes de titânio grau 3 medindo 2 mm de comprimento e 1,8 mm de diâmetro. Todos os implantes foram esterilizados em sala limpa, sendo limpos por ultrassom em ciclohexano (3 vezes por 2 min), acetona (uma vez por 1 min), água deionizada (3 vezes por 2 min), etanol (3 vezes por 2 min) e acetona (3 vezes por 2 min) usando um banho de ultrassom (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W). Em seguida, as amostras foram secas com gás nitrogênio e um feixe de nitrogênio a 0,5 bar foi aplicado diretamente sobre as amostras. Antes do implante, os implantes foram primeiro embebidos em água deionizada e, em seguida, imersos em etanol a 70% (v/v) por 10 min. Em seguida, os implantes foram transferidos para tubos de microcentrífuga estéreis e mantidos em condições estéreis até a cirurgia.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes da Comunidade Europeia para a proteção de animais utilizados para fins científicos (Diretiva 2010/63/UE) conforme implementadas na legislação espanhola (Real Decreto 53/2013) e nos regulamentos da Generalitat de Catalunya (Decreto 214/97). A aprovação ética para todos os procedimentos e manuseamento animal foi obtida do Comitê de Ética em Experimentação Animal do Vall D'Hebron Institut de Recerca (número de registro 72/18 CEEA). Para o modelo osteoporótico, foram utilizadas ratas Sprague Dawley com peso médio de 484 g e idade média de 12 semanas. Quanto ao modelo diabético, foram empregadas ratas geneticamente modificadas BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) com peso médio de 730 g e idade média de 12 semanas. Todos os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial. Os detalhes específicos dos animais, reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Anestesia/farmacologia e preparação de animais

  1. Administrar analgesia pré-cirúrgica com buprenorfina a 0,05 mg/kg e meloxicam a 2 mg/kg por meio de injeções subcutâneas 10-15 min antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
  2. Realize anestesia intracirúrgica com isoflurano inalatório: iniciar a 5% em ar fresco durante a indução e manter a 3%. Induza a anestesia em uma câmara de rato e mantenha o suprimento de isoflurano com uma adaptação cônica do nariz durante a cirurgia.

2. Preparação para a cirurgia

  1. Meça a temperatura corporal do animal anestesiado com uma sonda retal e use uma almofada de aquecimento controlada eletronicamente para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. A pomada ocular deve ser aplicada antes do início da cirurgia para evitar o ressecamento da córnea.
    NOTA: Se necessário, a pomada deve ser reaplicada após verificar o ressecamento dos olhos.
  2. Apare o cabelo com um barbeador elétrico e aplique creme depilatório para eliminar qualquer pelo restante.
  3. Obtenha um campo cirúrgico asséptico limpando a pele do joelho em um padrão de iodo e etanol 70% (v/v) usando swabs estéreis, começando de dentro e movendo-se para fora da linha de incisão sem refazer. Realize um mínimo de três rotações de limpeza consecutivas (iodo-etanol-iodo).
  4. Isole o campo operatório posicionando um campo cirúrgico fenestrado estéril sobre o animal, expondo a perna através da abertura central (Figura 1).

3. Cirurgia

  1. Exposição cirúrgica
    1. Faça uma incisão cutânea de espessura total de aproximadamente 1 cm de comprimento verticalmente ao longo da borda proximal da face anteromedial da tíbia, na região da metáfise para expor o osso (Figura 2).
    2. Estabilize a perna e puxe a pele esticada contra o osso subjacente enquanto faz a incisão, garantindo que uma incisão limpa permaneça no local correto. Gerencie limpando o sangramento leve esperado com uma compressa embebida em solução salina (Figura 2).
      NOTA: A pele do rato é fina e flácida ou solta. A estabilização da pele é crucial e necessária.
    3. Descole totalmente o tecido do osso usando pequenos elevadores periosteal (Figura 3).
    4. Expor o osso até a identificação da inserção do músculo tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça na borda posterior da face medial da tíbia, como um tecido branco fibroso firmemente aderido ao osso (Figura 3).
      NOTA: É importante identificar esse grupo de inserções musculares para permitir que o implante seja colocado em uma região óssea com características e estímulos semelhantes em toda a amostra, independentemente do tamanho do rato.
  2. Processo de perfuração
    1. Iniciar o processo de perfuração na região correta entre a crista tibial proximal e o limite posterior da face medial do osso tíbia, contígua à inserção do músculo tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça, evitando qualquer lesão muscular.1
      NOTA: A localização correta deve ser de 5 mm ± 2 mm do platô tibial.
    2. Broca com um máximo de 150 rpm (rotações/min) sob irrigação com solução salina a uma temperatura próxima de 20 °C com um motor elétrico cirúrgico com um contra-ângulo de redução de 20:1.
      NOTA: Apenas dois exercícios foram necessários.
    3. Comece com uma broca piloto de lança (Figura 4) a uma profundidade de 2,4 mm sob irrigação com solução salina.
      NOTA: Cada broca teve no máximo 10 usos.
    4. Como segunda broca, use (Figura 4) uma broca helicoidal a uma profundidade de 2.4 mm com um diâmetro de 1.6 mm sob solução salina.
      NOTA: Cada broca teve no máximo 10 usos.
  3. Colocação de implantes
    1. Insira o implante com uma peça intermediária (Figura 5) presa ao contra-ângulo de redução 20:1.
    2. Antes de colocar o implante, limpe-o de qualquer esterilizante químico residual, girando-o no contra-ângulo com irrigação salina simultânea por 10 s (Figura 5).
    3. Colocar o implante de titânio (2 mm longitudinalmente e 1,8 mm de diâmetro) utilizando a peça intermédia a 20 rpm enquanto monitoriza o valor do binário em tempo real, registando o binário máximo de inserção.
      NOTA: Espera-se uma dificuldade inicial na inserção do implante devido à diferença entre a broca final e o implante, bem como o perfil cilíndrico do implante; No entanto, essa dificuldade inicial é rapidamente normalizada assim que o implante penetra na cortical inicial.
    4. Termine a inserção do implante antes que ele passe completamente pela cortical onde está inserido, ou seja, a face medial plana da tíbia.
      NOTA: No momento final da inserção do implante, é importante deixar o implante ligeiramente fora da cortical ou nivelado com a cortical onde está inserido, ou seja, a face medial plana da tíbia, para garantir a estabilidade primária (Figura 6).
  4. Fechamento da ferida
    1. Suturar as bordas do tecido muscular com suturas internas simples usando uma sutura reabsorvível sintética monofilamentar 4/0 (Gliconato) (Figura 7).
    2. Realize o fechamento da pele com uma sutura intradérmica usando uma sutura reabsorvível sintética monofilamentar 4/0 (gliconato) (Figura 7).

4. Micro-tomografia computadorizada

  1. Depois de concluir a cirurgia e ainda sob anestesia geral, faça uma microtomografia computadorizada para confirmar a colocação adequada do implante.
  2. Remova o rato da cama de cirurgia e coloque-o na cama de digitalização. Localize a perna operada usando o modo de varredura ao vivo micro-CT e centralize o campo de visão no implante.
    NOTA: Os parâmetros de aquisição recomendados são Campo de visão de 5 mm, resolução espacial de 0,0001 mm3, 50 kV, 200 μA e tempo de aquisição de 3 min.
  3. Uma vez adquirida a varredura, confirme a distância correta entre a face proximal do implante e a superfície do platô tibial, de acordo com o passo 5.2.1.
    NOTA: Este valor será útil para a padronização da técnica (Figura 8).

5. Cuidados pós-operatórios

  1. Após a aquisição da imagem, retorne o rato à gaiola e monitore até a recuperação total.
    NOTA: Isso leva aproximadamente 5-10 min, dependendo do modelo animal. Espera-se que os ratos diabéticos permaneçam anestesiados por mais tempo e tenham um tempo de recuperação mais longo devido às alterações metabólicas associadas ao diabetes.
  2. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 6-8 h e meloxicam (5 mg/kg) a cada 24 h, por via subcutânea, até 72 h.
  3. Tempo de remoção da sutura
    1. Examine a ferida cirúrgica diariamente quanto a infecção, integridade da sutura ou outros problemas e remova os restos da sutura, se necessário, 15 dias após a cirurgia.

6. Eutanásia

  1. Eutanasiar os animais usando uma câmara de CO2 , de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH), com uma taxa de preenchimento de CO2 de 30% a 70% do volume da câmara/min após o tempo de implantação (4 semanas ou 12 semanas).

7. Análise pós-cirúrgica

  1. Para ambos os modelos (osteoporose e diabetes), remova a tíbia por desarticulação após a eutanásia para análise posterior.
    NOTA: Em relação à análise de micro-TC, os dados permitiram calcular o contato osso-implante (BIC). A aquisição da TC foi realizada utilizando os parâmetros descritos anteriormente, e a análise do BIC foi realizada dividindo-se a área óssea (mm2) pela área do implante (mm2) calculada na região cortical, adaptando-se a um protocolo já descrito na literatura18. Imagens representativas são mostradas para cada modelo, osteoporose (Figura 9) e diabetes (Figura 10).

Resultados

Fase cirúrgica
É importante mencionar que ambos os modelos animais utilizados neste estudo apresentam certas restrições devido às doenças induzidas. Essas restrições quanto à manipulação de tecidos duros e moles são refletidas durante o procedimento cirúrgico.

No modelo diabético, o rato é maior, dificultando a estabilização das pernas durante os procedimentos cirúrgicos. Isso aumenta o tempo cirúrgico e, consequentemente, o tempo de anestesia, o que exige um tempo de recuperação maior e, portanto, requer maior vigilância no pós-operatório.

Quanto ao modelo osteoporótico, os requisitos eram muito diferentes, sendo mais concentrados no momento da manipulação óssea. Nesse caso, é possível observar maior sangramento durante o procedimento de perfuração. Além disso, o processo de colocação do implante torna-se mais difícil. Algumas complicações podem ocorrer, como pequenas fissuras no osso, alterando a progressão do implante durante a sua entrada e tornando-o mais instável devido à falta de resistência óssea nas paredes laterais do implante. Essa limitação requer mais pressão manual e estabilização durante a colocação, dificultando o controle até que o posicionamento correto do implante seja alcançado.

Em relação ao torque máximo de inserção do implante, foram observados valores relativamente diferentes para as duas doenças (Tabela 1). Em geral, o torque médio máximo de inserção observado para o modelo osteoporótico foi maior do que para o modelo diabético. Com esses resultados, é interessante entender o efeito que o diabetes tem na densidade óssea e na resistência óssea à inserção do implante, pois essa condição parece ter um efeito mais severo nas propriedades mecânicas do osso em comparação com a osteoporose.

Análise pós-cirúrgica
A colocação adequada dos implantes de titânio após 4 semanas e 12 semanas de implantação foi analisada por micro-TC. Imagens representativas são fornecidas para ratos osteoporóticos (Figura 9) e diabéticos (Figura 10). De modo geral, os implantes foram implantados corretamente através das tíbias corticais e trabeculares, apresentando contato íntimo e contínuo com a parte cortical, e sem sinais de inflamação ou reações adversas, comprovando assim o sucesso do protocolo cirúrgico para ambos os modelos de patologia.

Coletivamente, a análise das imagens também permitiu calcular a razão entre a área óssea (mm2) versus a área do implante (mm2), denominada V(BIC), na região cortical, e comparar o desempenho do procedimento cirúrgico ao longo do tempo e dentro dos modelos. Conforme mostrado na Figura 11, os valores de V(BIC) permaneceram constantes para o modelo osteoporótico em 4 semanas e 12 semanas, indicando uma integração estável do implante ao longo do tempo e destacando que uma conexão íntima com o osso é garantida já em 4 semanas. Digno de nota, valores muito semelhantes foram obtidos para o modelo diabético, mostrando assim a adequação do protocolo de estudo para ambos os modelos de patologia.

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Figura 1: Campo cirúrgico. O campo cirúrgico mostrando a posição correta do rato e exposição da área a ser intervencionada, adaptação do adaptador cônico às vias aéreas para manutenção da anestesia durante o procedimento, bem como os instrumentos necessários para a intervenção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Incisão cirúrgica. Estabilização correta da pata do rato e, ao mesmo tempo, fixação da pele fina e móvel para obter uma incisão correta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exposição óssea e inserção muscular Identificação. Lado esquerdo: descolamento total dos tecidos com a conseqüente exposição óssea. Para preservar e evitar danos à inserção do músculo tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça , é importante identificar corretamente o tecido branco fibroso firmemente aderido ao osso, visível na figura do lado direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Sequência de perfuração. A sequência do processo de perfuração começa com a broca piloto de lança à esquerda, seguida pela broca helicoidal à direita. Para garantir um procedimento de perfuração estável e seguro, é importante manter a estabilização da perna e dos tecidos moles durante a perfuração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Preparação para a inserção do implante. O implante é inserido em uma peça intermediária para ser submetido ao processo de limpeza com soro fisiológico enquanto o implante gira a 20 rpm. Esta peça intermediária permite a inserção do implante no osso com um dispositivo eletrônico. Este dispositivo garante o controle da velocidade de inserção do implante e registra o torque de inserção em tempo real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Colocação do implante de titânio. A colocação do implante dentro do osso requer sua colocação na face plana do osso medial, longe da borda proximal da face ântero-medial do osso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Fechamento da ferida. As etapas para fechar a ferida são observadas em 2 planos diferentes. Esquerda: o primeiro plano mais profundo é feito com pontos simples para aproximar as bordas do tecido muscular. Direita: o segundo plano, mais superficial, é realizado com uma sutura intradérmica para aproximar a pele, evitando que o nó fique em uma posição exteriorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Microtomografia computadorizada da colocação do implante após o procedimento cirúrgico. A figura ilustra o posicionamento do rato no scanner de micro-CT, e as imagens da posição do implante são divididas em três seções, correspondendo às vistas x, y e z, respectivamente. O implante é apontado com uma seta vermelha nas diferentes vistas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Microtomografia computadorizada de um implante colocado na tíbia de um rato osteoporótico. Imagens representativas de micro-TC pós-cirúrgica de implantes de titânio colocados nas tíbias de ratos osteoporóticos após (A) 4 semanas e (B) 12 semanas de implantação. Cada imagem é dividida em três seções, correspondendo às visualizações x, y e z, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Microtomografia computadorizada de um implante colocado na tíbia de um rato diabético. Imagens representativas de micro-TC pós-cirúrgica de implantes de titânio colocados nas tíbias de ratos osteoporóticos após (A) 4 semanas e (B) 12 semanas de implantação. Cada imagem é dividida em três seções, correspondendo às visualizações x, y e z, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11: Análise de contato osso-implante (BIC). Valores de V (BIC) calculados como área óssea (mm2) * 100 / área do implante (mm2) a partir de imagens de micro-CT para os modelos osteoporótico (Osteo) e diabético (Diab) após 4 semanas (4 w) e 12 semanas (12 w) após o implante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Torque máximo de inserção do implante [N·cm]
ModeloPerna direitaPerna esquerda
Osteoporose6,11 ± 0,966,49 ± 1,34
Diabetes4,79 ± 1,704,90 ± 1,76

Tabela 1: Torque máximo de inserção. Diferenças nos valores máximos de torque obtidos durante a inserção do implante entre ratos diabéticos e ratos osteoporóticos. Ratos diabéticos apresentam valores de torque máximo mais baixos do que ratos osteoporóticos.

Discussão

Embora o rato seja um modelo amplamente utilizado para o estudo da osseointegração, é importante definir e descrever uma técnica cirúrgica reprodutível para a colocação adequada de implantes. Tal técnica poderia servir de guia para a comunidade científica. Além disso, o fato de certas doenças, como osteoporose e diabetes, alterarem o metabolismo ósseo implica em demandas mais fortes para o planejamento correto de procedimentos cirúrgicos. O rato se compara favoravelmente com outros modelos animais, pois apresenta as principais características tanto da osteoporose (fraturas espontâneas e de baixo impacto) quanto do diabetes e da obesidade induzida por dieta, sem a necessidade de instalações especializadas caras e experimentos longos e caros, além de controle e manutenção pós-operatória19. O tamanho pequeno, a alta fecundidade e a vida curta do rato facilitam experimentos em larga escala e eficientes em termos de tempo, ao mesmo tempo em que atendem aos três requisitos de R dos experimentos com animais (substituição, redução e refinamento) 20 .

Apesar da considerável quantidade de literatura científica na área, existem poucos artigos científicos descrevendo técnicas cirúrgicas detalhadas. No entanto, a grande maioria omite informações cirúrgicas cruciais, impedindo assim a possibilidade de replicar as técnicas descritas.

Neste protocolo cirúrgico, várias etapas críticas precisam ser consideradas ao longo do procedimento cirúrgico, como a localização da incisão, a localização precisa para perfuração e colocação do implante, a técnica de perfuração, as dimensões exatas do implante e a broca final usada para a inserção do implante.

Na literatura, a localização exata da incisão é muitas vezes imprecisa, carecendo de embasamento científico para sua colocação. A incisão deve ser feita em uma região diferente daquela da colocação do implante. É importante evitar colocar a incisão e consequente sutura diretamente acima da área implantada para manter a integridade do periósteo descolado acima do implante. A incisão e o descolamento inicial do retalho de espessura total podem interromper o suprimento sanguíneo e danificar o periósteo, podendo levar a um distúrbio na atividade das células periosteais durante a formação de novo osso, como observado em outros estudos21. Essa abordagem visa otimizar a formação óssea peri-implantar e minimizar traumas, má cicatrização, fibrose ou o risco de colonização bacteriana na área de sutura. Nesse método, a incisão é detalhada e feita na crista tibial proximal, garantindo que ela não fique diretamente acima do local de colocação do implante.

Ao determinar a região para a colocação do implante, é crucial garantir uma densidade óssea uniforme em toda a amostra. Normalmente, as medições são referenciadas ao platô tibial. Dada a variação longitudinal de tamanho entre os ratos, é necessária uma referência anatômica para colocar implantes de forma consistente na mesma região. Nesse método, a área adjacente à inserção dos músculos tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça serve como uma referência anatômica confiável. Espera-se que essa região, caracterizada por inserções musculares, exiba densidade óssea homogênea em toda a amostra.

Ao discutir o método de perfuração, é crucial fornecer detalhes precisos sobre o tipo/dimensões da(s) broca(s), a velocidade de perfuração (geralmente medida em rpm) e a temperatura da solução salina. Esses fatores são essenciais na prevenção de uma extensa área necrótica e subsequente formação de tecido fibroso22,23, conforme destacado em vários estudos focados em reações necróticas induzidas por perfuração. No entanto, alguns artigos excedem esses limites biológicos24 em seus métodos de perfuração, enquanto outros omitem totalmente essas informações cruciais 4,25,26,27,28. Este estudo enfatiza os cuidados meticulosos tomados durante os procedimentos de perfuração para reduzir o trauma cirúrgico e a necrose tecidual. Optou-se por um procedimento de perfuração de segurança com velocidade limitada a 150 rpm, nível considerado seguro em termos de temperatura óssea mesmo sem solução salina. Essa abordagem é eficaz em termos de velocidade de perfuração e permite um bom controle da broca durante o procedimento29,30. Além disso, mantivemos a irrigação e o resfriamento usando uma solução salina a aproximadamente 20 °C para mitigar ainda mais quaisquer possíveis efeitos térmicos.

Outra informação relevante que é frequentemente omitida é o tamanho do implante utilizado. Essa omissão impossibilita a interpretação da relação entre o tamanho da broca final e o tamanho do implante. Essa discrepância é crucial na avaliação da estabilidade do implante, que em um déficit pode levar à instabilidade, enquanto em excesso, pode causar excesso de pressão e uma reação isquêmico-necrótica.

É crucial observar que, para que a estabilidade primária seja alcançada, deve haver uma pequena diferença de diâmetro entre a broca final e o implante, com o implante sendo um pouco maior em diâmetro. Esse parâmetro cirúrgico crítico para a obtenção da estabilidade primária nem sempre é consistente na literatura, pois algumas metodologias apresentam uma broca final com diâmetro maior do que o implantecolocado4. Como essa região é caracterizada por inserções musculares, espera-se uma densidade óssea homogênea e robusta em toda a amostra. Essa característica ajuda a evitar a principal limitação relatada para intervenções tibiais em ratos, ou seja, o crescimento longitudinal da tíbia ao longo do tempo31. Além disso, esse método permite o controle da temperatura, abordando uma das causas de complicações e subsequente morbidade23. No entanto, assim como outros estudos, este estudo também enfrenta uma limitação quanto à necessidade de adaptação do dispositivo devido às variações no tamanho datíbia4,17.

Outra preocupação relacionada ao número de animais utilizados é a importância de selecionar um tamanho de amostra adequado. Isso é crucial para maximizar o impacto dos resultados da pesquisa e, ao mesmo tempo, minimizar o uso de animais. Tal estratégia não apenas melhora a eficiência e a confiabilidade dos estudos, mas também enfatiza as considerações éticas na pesquisa científica. Esforços contínuos devem ser feitos para otimizar essa eficiência.

Em resumo, o presente método fornece uma descrição detalhada de todos os procedimentos cirúrgicos e permite a observação de vários desafios cirúrgicos em ambas as doenças. Além disso, este protocolo se destaca como um método válido, pois todas as amostras com contato direto com o osso alcançaram valores estáveis de V(BIC). No entanto, difere da maioria dos estudos experimentais na literatura por apresentar uma técnica detalhada e justificada, permitindo assim uma reprodução exata. Consequentemente, pode ser usado para estudar o efeito de diferentes superfícies de implantes em várias doenças, incluindo aquelas que afetam a densidade óssea.

Divulgações

Declaramos que não há conflito de interesses em relação a este artigo científico.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Agência Estatal de Pesquisa Espanhola pelo apoio financeiro através dos projetos PID2020-114019RBI00 e PID2021-125150OB-I00.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
22 G agulhas+A2:C30TerumoNN-2238R
4/0 monofilamento sintético sutura reabsorvívelBraun ( MonoSyn)
5 mL, seringas de 10 mLBraun4617100V-02 4606051V
Adson fórcepsAntã o Ref Médico: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley RatsJanvier Labs
BetadineMylan
BuprecareAnimalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm anguladoUL AMIN Industries
Castroviejo Porta-agulhasAntã o Ref. Médica: AM1702
Tesoura de cirurgia dentária curva e retaAntã o MédicoAMA603 / AMA600
Barbeador elétricoOster Pro 3000i34264482227
Pinça Graefe Extra FinaF.S.TRef: 11150-10
Compressas de gazeCOVIDIEN441001
GlicosímetroMenarini (Itália)
Broca helicoidal / OSTEO-PIN DRILL ø 1,6 mmsoadcoRef. OS-8001
Implantes / SCREW OSTEO-PIN ø 1,8 x 2,0 mmsoadcoRef. OS-3
IsofloLe Vet Pharma (Holanda)
Broca piloto de lança / Broca lanceolada (DS)soadcoRef. 10 02 01 T
Luvas de látex - Luvas cirúrgicas estéreisHartmannRef: 9426495
Lucas Cureta cirúrgicaAntã o Ref. Médico: AMA940-3
MetacamBoehringer Ingelheim(Alemanha)
Micro fórceps retonopaRef: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )Perkin Elmer (EUA)
Osteoporotic Sprague Dawley fêmeas RatosJanvier Labs
Elevador periosteal -  Muda 2-4Formiga oRef. Médica: A1564
Solução fisiológica para irrigaçãoHygitechRef:10238
Lâmina de bisturi Aço carbono 15CNavalha Med Ref: 02846
Cotonetes de gazeestéril AlledentalRef: 270712
Sistema de irrigação estérilHygitechRef:HY1-110001D
Toalhas estéreis (1 peça por animal)Dinarex4410
Contra-ângulo cirúrgicoW& HRef: WS-75 LED G
Contra-ângulo cirúrgicoW& HSN 08877
Contra-ângulo cirúrgico Peça de mãoW& HSN 01309
Motor Elétrico CirúrgicoWH Implantmed Tipo: SI-1023  Ref: 30288000
Cabo de bisturi cirúrgicoAsaDentalRef: 0350-3
Pinçasde toalha Xelpov cirúrgicoAF-773-11
Dispositivo ultrassônicoJ.P. Selecta, Abrera, Espanha

Referências

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