Os modelos de pulmão em chip superam as culturas 2D tradicionais, imitando a interface ar-líquido e a perfusão de células endoteliais, simulando o fluxo sanguíneo e a troca de nutrientes cruciais para estudos de fisiologia pulmonar. Isso aumenta a relevância da pesquisa pulmonar, oferecendo um ambiente dinâmico e fisiologicamente preciso para avançar na compreensão e no tratamento de infecções respiratórias.
Artigo de método
Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos um modelo avançado de pulmão em chip imunocompetente projetado para replicar a estrutura e função alveolar humana. Este modelo inovador emprega um biochip perfundido microfluídico que suporta uma interface ar-líquido que imita o ambiente nos alvéolos humanos. A engenharia de tecidos é usada para integrar os principais componentes celulares, incluindo células endoteliais, macrófagos e células epiteliais, para criar um modelo de tecido representativo do alvéolo. O modelo facilita exames aprofundados das respostas imunes da mucosa a vários patógenos, incluindo vírus, bactérias e fungos, avançando assim nossa compreensão da imunidade pulmonar. O objetivo principal deste protocolo é fornecer detalhes para estabelecer este modelo de alvéolo em chip como uma plataforma in vitro robusta para estudos de infecção, permitindo que os pesquisadores observem e analisem de perto as complexas interações entre patógenos e o sistema imunológico do hospedeiro no ambiente pulmonar. Isso é alcançado por meio da aplicação de técnicas baseadas em microfluídica para simular as principais condições fisiológicas dos alvéolos humanos, incluindo fluxo sanguíneo e estimulação biomecânica das células endoteliais, além de manter uma interface ar-líquido crucial para a exposição realista das células epiteliais ao ar. O sistema modelo é compatível com uma variedade de ensaios padronizados, como coloração por imunofluorescência, perfil de citocinas e análise de unidade formadora de colônias (UFC)/placa, permitindo insights abrangentes sobre a dinâmica imunológica durante a infecção. O Alveolus-on-chip é composto por tipos de células essenciais, incluindo células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos estrategicamente posicionados entre as camadas epitelial e endotelial. O modelo de tecido aumenta a capacidade de dissecar e analisar os fatores diferenciados envolvidos nas respostas imunes pulmonares in vitro. Como uma ferramenta valiosa, deve contribuir para o avanço da pesquisa pulmonar, fornecendo um modelo in vitro mais preciso e dinâmico para estudar a patogênese das infecções respiratórias e testar possíveis intervenções terapêuticas.
Introdução
O pulmão humano tem um papel marcante na respiração e na defesa imunológica, com interações complexas entre as respostas imunes da mucosa alveolar1. A capacidade dos alvéolos de criar uma resposta imune eficiente é vital para prevenir infecções pulmonares e garantir a saúde pulmonar. Como os pulmões estão constantemente expostos a uma ampla gama de riscos potenciais, incluindo bactérias, vírus, fungos, alergias e material particulado, entender as complexidades das respostas imunes da mucosa alveolar é fundamental para descobrir os mecanismos por trás de infecções respiratórias, distúrbios inflamatórios e tratamento de doenças pulmonares1.
Para estudar os processos relacionados à infecção e inflamação do trato respiratório in vitro, são necessários modelos que possam imitar fielmente o meio alveolar e as respostas imunes. A cultura de células 2D e os módulos animais têm sido usados há décadas como ferramentas essenciais para a pesquisa biomédica sobre a resposta imune pulmonar. No entanto, muitas vezes eles têm limitações em seu potencial de tradução para situações humanas. Os modelos lung-on-chip podem contribuir para preencher a lacuna entre os modelos tradicionais in vitro e in vivo e fornecer uma nova abordagem para estudar as respostas imunes específicas do ser humano 2,3. Os modelos de pulmão em chip podem imitar a interface ar-líquido, que é necessária para que as células pulmonares recapitulem as condições fisiológicas do trato respiratório e desenvolvam um modelo de tecido mais preciso e robusto. Essa técnica de cultura permite um exame preciso da diferenciação, funcionamento e respostas celulares a drogas ou estímulos relacionados a doenças in vitro2.
Neste estudo, apresentamos um modelo baseado em microfluídica do alvéolo humano como uma ferramenta eficaz para recapitular o meio alveolar humano, aplicando perfusão para imitar o fluxo sanguíneo e a estimulação biomecânica das células endoteliais e incorporando uma interface ar-líquido com células epiteliais expostas a uma fase aérea4. Desenvolvemos um alvéolo perfundido microfluídico em chip que imita a estrutura física e as interações biológicas do alvéolo humano, com foco particular na interface ar-líquido. Essa interface desempenha um papel crucial na diferenciação das células epiteliais respiratórias, o que é essencial para modelar com precisão o ambiente pulmonar. O modelo usa células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos posicionados entre as camadas celulares. Essa configuração replica o intrincado arranjo celular do alvéolo e é fundamental para simular com precisão a interface ar-líquido, que é um fator significativo na função fisiológica do tecido pulmonar.
A lógica por trás do desenvolvimento do modelo se estende à integração de células imunes circulantes e residentes no tecido. Essa abordagem foi projetada para imitar com precisão a resposta inflamatória do hospedeiro a infecções respiratórias humanas, fornecendo um ambiente dinâmico para estudar as interações patógeno-hospedeiro. A presença de macrófagos permite o exame das respostas imunes imediatas e sua interação com patógenos, refletindo a primeira linha de defesa contra infecções respiratórias. Além disso, o design da plataforma do biochip facilita a manipulação conveniente e precisa de pistas biofísicas e bioquímicas, o que é crucial para replicar a função do alvéolo in vitro. Essa flexibilidade é fundamental para dissecar os fatores que contribuem para infecções humanas, permitindo que os pesquisadores ajustem as condições para refletir vários estados de doença ou testem possíveis intervenções terapêuticas. A compatibilidade da plataforma com várias tecnologias de leitura, incluindo microscopia avançada, análises microbiológicas e análise bioquímica de efluentes, aumenta sua utilidade. Esses recursos permitem uma avaliação abrangente da resposta tecidual a infecções, incluindo a avaliação do comportamento celular, proliferação de patógenos e a eficácia das respostas imunes.
Apresentamos um protocolo detalhado e técnicas para criar e utilizar um modelo de alvéolo humano em chip focado na replicação da interface ar-líquido e na integração de células imunes para estudar infecções humanas in vitro.
Protocolo
As células HUVEC são isoladas dos cordões umbilicais e usadas até a passagem 4. Os monócitos primários são isolados de doadores saudáveis de sangue total. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Jena, Jena, Alemanha (3939-12/13). De acordo com a Declaração de Helsinque, todos os indivíduos que doaram células para o estudo deram seu consentimento informado.
1. Dia 1: Preparação do biochip
- Os biochips estão disponíveis em diferentes tamanhos e modelos. Para experimentos aqui, use o modelo BC002. Coloque o biochip em uma placa de Petri de vidro, encha a placa e lave todas as cavidades com etanol estéril a 70% (EthOH). Incubar durante 45 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as cavidades 2x com ddH2O. Remova o ddH2O.
- Cubra a membrana do biochip de ambas as cavidades com solução estéril de colágeno IV (0,5 mg / mL em ácido acético 0,5 mM; use a concentração de 1:100 na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo magnésio e cálcio PBS (+/+)) lavando suavemente a solução de colágeno IV através de ambas as cavidades usando uma pipeta de 1.000 μL com pontas azuis. Incubar durante 15 min a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 1.000 μL com pontas de filtro azul (P1000) em todo o protocolo. O diâmetro da abertura da ponta do filtro cobre completamente a abertura das portas que conectam os canais, o que evita a inserção de bolhas de ar no chip. - Após 30 min de incubação, lave as câmaras inferior e superior 2x com PBS estéril (+/+) para eliminar o colágeno e o ácido acético restantes.
- Prepare o meio EC adicionando 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL). Encha a câmara superior de cada cavidade com 250 μL de meio EC e a câmara inferior com 150 μL de meio EC.
- Colha HUVEC de um frasco T25 confluente: Lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem PBS de magnésio e cálcio (-/-), adicione 1 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-) e incube por 3 min a 37 ° C. Interrompa a atividade da tripsina adicionando 5 mL de PBS (+/+) + 5% FCS e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) em um tubo cônico de 50 mL. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio EC.
- Use uma diluição serial de 1:10 ao realizar a contagem de células. Adicione 10 μL do pellet celular ressuspenso a 90 μL de meio celular. Combine as amostras com cuidado. Use um tubo de microcentrífuga com 10 μL de corante azul de tripano. Diluir a solução celular com azul de tripano (1:1) utilizando lâminas de câmara de contagem de células. Conte as células manualmente com uma Câmara de Neubauer ou com um contador de células automatizado. Determine a contagem de células e ajuste a concentração para 0,4 x 106 células por 200 μL.
- Substituir o meio de células endoteliais na câmara superior do biochip por 200 μL de meio EC contendo HUVECs suspensos. Pipete suavemente para evitar a formação de bolhas de ar nos canais ou câmaras. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips a 37 °C e 5% de CO2.
2. Dia 2: Verificação da camada celular
- No dia 2, verifique visualmente a confluência da camada de células HUVEC na câmara superior. Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC. Pipete suavemente para evitar o descolamento das células da membrana. Realizar troca de mídia diariamente após 24h. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips de volta a 37 °C e 5% de CO2.
3. Dia 3: Preparação da câmara inferior
- Verifique visualmente a confluência da camada de células endoteliais. Neste ponto, determine a presença de uma camada confluente e morfologia semelhante a paralelepípedos (Figura 1). Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC.
- Em seguida, prepare a câmara inferior para semear as células que formam a camada epitelial. Lave a câmara inferior suavemente com 150 μL do meio RPMI (adicione 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 5% de soro fetal de vaca, 1 μM de dexametasona).
- Para a câmara inferior, semeie 0,5 x 106 células H441 suspensas em 200 μL de meio RPMI (RPMI) por cavidade.
- Coleta de células H441
- Lave as células com 5 mL de PBS (-/-) uma vez. Adicione 2 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-).
- Incubar as células durante 5 min a 37 °C e 5% de CO2. O tempo de incubação varia de acordo com a confluência da camada. Dentro de 5-7 min, as células devem se desprender completamente.
- Pare a atividade da tripsina com 10 mL de PBS (+/+) + 5% de FBS, colete as células e centrifugue a 200 x g por 4 min.
- Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI e contar.
- Semeie 0,5 x 106 células por câmara, pipetando suavemente a solução celular para a câmara inferior. Feche todas as portas e vire o biochip de cabeça para baixo para que as células possam se conectar à membrana PET. Manter o biochip de cabeça para baixo e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de células a 37 °C e 5% de CO2.
4. Dias 4 - Dia 7: Manutenção das células e colheita de monócitos
- Realize a troca diária de meio na câmara superior e inferior. Para a câmara superior, realizar a troca do meio com 300 μL de meio EC.
- Use 200 μL de RPMI+ (meio RPMI mais 1:100 (v/v) Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% de soro humano autólogo, 1 μM de dexametasona) para a câmara inferior. No dia 7, lave a câmara inferior com RPMI+ para preparar a cavidade para a semeadura de monócitos.
- Semear 0,1 x 106 monócitos suspensos em 200 μL RPMI+ na câmara inferior.
- Colheita de monócitos
- Lave as células com 1 mL de PBS (-/-) e incube por 7 min a 37 ° C em PBS pré-aquecido (- / -) contendo 4 mg / mL de lidocaína + 5 mM de EDTA a 37 ° C e 5% de CO2.
- Colete as células e centrifugue a 350 x g por 7 min, ressuspenda as células em 1mL de RPMI+ e conte. Coloque as portas do biochip voltadas para baixo para que as células se prendam à membrana.
5. Dia 8: Perfusão do biochip
- Neste ponto, certifique-se de que os biochips estejam prontos para serem conectados ao fluxo e perfundidos. Antes de iniciar a perfusão, prepare uma incubadora vazia e coloque a bomba peristáltica dentro.
- Perfusão dos biochips
- Antes de conectar o tubo esterilizado ao biochip, lave o tubo com 200 μL de PBS (+/+), seguido por 200 μL de meio EC. A tubulação tem um diâmetro interno de 0,5 mm, consistindo em lados mais longos (20 cm) e mais curtos (12 cm) divididos por duas rolhas de bomba peristálticas. Coloque a tubulação de lado e prepare os reservatórios para o meio.
- Efectuar a troca do meio nas câmaras superior e inferior, lavando-as com o respectivo meio de cultura celular recém-preparado.
- Insira o reservatório no lado de saída do biochip e conecte o reservatório com a tubulação à entrada do biochip (Figura 2). Conecte a tubulação ao reservatório e ao biochip para que haja uma perfusão média circular entre o reservatório e o biochip.
- Assim que tudo estiver conectado às portas, encha o reservatório com 500 μL de meio EC. Conecte o biochip com a tubulação em uma perfusão com uma vazão de 21 μL / min (Figura 2). Observe atentamente durante os primeiros 15 minutos de perfusão para a inserção de bolhas. Realize a troca média diariamente em ambas as câmaras.
6. Dia 9 - Dia 11: Estabelecendo uma interface ar-líquido
- Pare a perfusão, esvazie os reservatórios e reabasteça com meio recém-preparado sob um gabinete de segurança estéril. Pipetar 500 μL de meio EC nos reservatórios e lavar suavemente a câmara inferior com 200 μL de RPMI+. Inicie a perfusão novamente com uma taxa de perfusão de 21 μL / min.
- Interface Ar-Líquido (ALI)
- Estabelecer o ALI desde o dia 12 até ao final da experiência (dia 14). Durante a cultura de LPA, exponha as células epiteliais ao ar.
- Para estabelecer a cultura ALI, prepare um novo meio vascular EC (adicionar 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 10 ng / ml GM-CSF, 20% de soro humano autólogo, 1μM de dexametasona) para manter todos os tipos de células no chip. Neste ponto, o meio contém uma concentração mais alta de AS (20%).
- Abra os plugues na câmara inferior sob um gabinete de segurança estéril e absorva cuidadosamente o meio até que uma bolha de ar seja visível, conforme mostrado na Figura 3. Certifique-se de que todo o líquido do canal e da câmara seja removido e feche as portas com cuidado.
- Encher os reservatórios com meio EC (-/-) e continuar a cultura de perfusão com um caudal de 21 μL/min. Troque o meio apenas na câmara superior até o dia 14 e mantenha as células epiteliais na câmara inferior apenas com ar.
7. Dia 14: Colheita e análise de tecidos
- Desconecte o biochip do fluxo. Desligue a tubulação e verifique no microscópio se há confluência celular. Devido ao ar na câmara inferior, as camadas celulares podem parecer confusas e difíceis de visualizar. Neste ponto, o modelo está pronto para mais experimentações.
- Fixação e coloração de tecido em biochip
- Lave as cavidades com PBS (+/+) para remover o meio de cultura celular. Pipetar 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em PBS (-/-) para a câmara superior e 200 μL na câmara inferior e incubar por 10 min em RT.
NOTA: Ao trabalhar com produtos químicos de fixação, como PFA, use uma capela de exaustão. Colete e descarte os resíduos de acordo. - Lave as câmaras 3x com PBS (+/+). Após a fixação, armazene os biochips a 4 °C ou use-os diretamente para coloração de imunofluorescência das células.
- Para permeabilização, pipetar 300 μL de Triton X-100 a 0,25% em PBS (+/+). Incubar por 30 min em RT.
- Após a incubação, lavar ambas as câmaras com PBS (+/+) e pipetar 300 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS (+/+) em ambas as câmaras. Incubar por 1 h em RT.
- Enquanto isso, prepare o painel de anticorpos para coloração por imunofluorescência. Para preparar o painel de anticorpos para a coloração por imunofluorescência, foi instalado um tubo com quantidade suficiente de 3% de BSA para diluir os anticorpos. Use 50 μL de diluições de anticorpos para cada membrana. Utilizar uma razão de diluição de 1:100 para os painéis de anticorpos primários e de 1:200 para os painéis de anticorpos secundários. Além disso, para o painel de anticorpos secundários, prepare DAPI em uma proporção de diluição de 1:2.000. Para anticorpos correspondentes, consulte (Tabela 1).
- Para acessar diretamente as células dentro do biochip, a folha de ligação deve ser removida. Para abrir as câmaras microfluídicas, faça um corte exato na parte externa da cavidade e remova a folha de ligação. Corte a membrana removendo as bordas seladas ao biochip com o bisturi.
NOTA: Trabalhe com precisão e precisão durante esta etapa para evitar danos à membrana e ferimentos devido à nitidez do bisturi. - Depois de separar a membrana do biochip, divida a membrana em duas partes. Recolha os pedaços de membrana com uma pinça e coloque-os em uma lâmina microscópica para coloração.
- Pipetar 50 μL de solução de anticorpos por peça de membrana. Incubar durante a noite a 4 °C, protegido da luz.
- Após a incubação, coloque a membrana em 500 μL de PBS (-/-) em uma placa de 24 poços e lave a membrana 3x por 5 min cada em PBS (+/+). Após a lavagem, pipetar 50 μL de solução de anticorpo secundário e incubar por 1 h em RT protegido da luz.
- Lave a membrana com PBS (+/+) 3x por 5 min cada. Enquanto isso, prepare e rotule as lâminas microscópicas para o experimento. Coloque uma gota do meio de montagem na corrediça e coloque a membrana correspondente. Repita esta etapa para todas as membranas. No final, coloque mais uma gota do meio de montagem na parte superior da membrana e use uma lamínula. Conservar a 4 °C.
- Lave as cavidades com PBS (+/+) para remover o meio de cultura celular. Pipetar 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em PBS (-/-) para a câmara superior e 200 μL na câmara inferior e incubar por 10 min em RT.
Resultados
Um exame das alterações morfológicas e da expressão de proteínas marcadoras pode ser realizado usando coloração de imunofluorescência. Após co-cultivo por 14 dias, os lados vascular e epitelial são analisados quanto à expressão dos respectivos marcadores celulares. Este método é útil para estudar as interações e integridade dos componentes vasculares e epiteliais, o que é essencial para a modelagem da doença como uma leitura biológica funcional relacionada à infecção. A coloração por imunofluorescência pode ser apoiada pela quantificação de análises, avaliação morfológica e ensaios funcionais, incluindo liberação de citocinas, análise de efluentes de marcadores de morte celular, como liberação de LDH, e alteração na morfometria das células5. No lado vascular, a integridade e a morfologia das proteínas da junção celular endotelial, como a VE-caderina, podem ser estudadas para avaliar a confluência e a formação da barreira endotelial6 (Figura 4A). Após a perfusão, a camada de células endoteliais deve ser confluente com uma expressão claramente estruturada de VE-caderina nas bordas das células endoteliais. A parte inferior da membrana pode ser imunomarcada para marcadores epiteliais, como E-caderina e Surfactante Proteína A (SP-A)7. A expressão de SP-A, um componente-chave do surfactante pulmonar e uma mistura complexa de lipídios e proteínas, reduz a tensão superficial na interface epitelial ar-líquido e, assim, evita in vivo o colapso dos alvéolos durante a expiração e a manutenção da função pulmonar e das trocas gasosas adequadas 6,8. Em nosso modelo, as células epiteliais expressam SP-A após o tratamento com LPA e podem ser visualizadas por coloração por imunofluorescência (Figura 4B). A confluência e integridade da camada de células epiteliais podem ser confirmadas pela coloração por imunofluorescência para E-caderina, um importante marcador juncional epitelial das células epiteliais alveolares (Figura 4C). A presença de macrófagos pode ser confirmada por coloração por imunofluorescência para a proteína criadora de macrófagos CD686 (Figura 4C). Para estudar infecções virais, bacterianas ou fúngicas, encontre detalhes sobre os modelos de infecção fornecidos em Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 e Hoang et al.9.
Figura 1: Imagem representativa de uma camada confluente de HUVECs no biochip no dia 3. A imagem mostra microscopia de campo claro com ampliação de 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração para a indução do alvéolo-em-chip e do LPA. (A) Imagem representativa da configuração de perfusão para o modelo alvéolo-em-chip e (B) uma imagem representativa da indução de um LPA na câmara absorvendo o meio e introduzindo ar nas células. A formação de uma bolha de ar dentro da câmara indica que as células estão expostas ao ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão geral esquemática do alvéolo no chip. Um protocolo detalhado para 14 dias de cultura indica etapas importantes para a semeadura e o crescimento das células dentro do biochip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração por imunofluorescência das camadas de células endoteliais e epiteliais. (A) Células endoteliais HUVEC expressando VE-caderina (laranja), (BC) células epiteliais H441 expressando (B) SP-A (vermelho) e (C) E-caderina (laranja), SP-A (vermelho) e CD68 (verde) expressão no lado epitelial. DAPI (azul) cora o DNA e indica os núcleos das células. A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cavidade | Células |
| Cavidade Superior | Endotelial (0,4 x 106) |
| Cavidade Inferior | Epitelial (0,5x106H441+ 1x105 monócitos) |
Tabela 1: Visão geral da semeadura celular no biochip.
Discussão
O modelo alvéolo-em-chip representa um modelo de tecido multicamadas do alvéolo humano, integrando tipos de células essenciais do trato respiratório inferior, incluindo células epiteliais pulmonares, células endoteliais e macrófagos, cultivadas em um arranjo organotípico em um ALI com perfusão média do revestimento endotelial. Células de diferentes camadas expressam proteínas marcadoras celulares específicas, como a E-caderina, uma molécula de adesão dependente de cálcio das células epiteliais pulmonares, que é central no estabelecimento de barreiras epiteliais intercelulares 5,10. A E-caderina forma um elemento de barreira física e controla a resposta imunológica a patógenos e substâncias nocivas no meio ambiente10,11. As células epiteliais H441 expressam ainda mais a proteína surfactante A, que também é crucial na primeira linha de defesa do hospedeiro contra a infecção, mediando a atividade imunomoduladora e antibacteriana8. A integração de células imunes no modelo alvéolo aumenta sua complexidade celular, replicando melhor a resposta imune aos gatilhos inflamatórios, ou seja, durante a infecção. Nesse contexto, o modelo foi utilizado para estudar a coinfecção do vírus influenza A e do patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus (S. aureus)5. No estudo, foi revelado um mecanismo de coinfecção na pneumonia em que a infecção viral das células epiteliais desencadeia uma resposta inflamatória significativa, o que causa danos consideráveis às células endoteliais, levando a uma perda da função de barreira. Em outro estudo, o modelo foi usado para demonstrar que a infecção por S. aureus reduz os níveis extracelulares de proteína surfactante-A (SP-A), um componente crucial da defesa imunológica nos pulmões, provavelmente devido a proteases bacterianas6. Embora a expressão de SP-A não seja diretamente afetada por S. aureus ou pelo vírus influenza A, ela é significativamente regulada negativamente pelo TNF-α, uma citocina altamente produzida em resposta a infecções bacterianas, especialmente na presença de macrófagos. Esses resultados sugerem que as mono e superinfecções bacterianas podem reduzir os níveis de SP-A no pulmão, potencialmente piorando o resultado da pneumonia bacteriana6. Além disso, o modelo de alvéolo tem sido usado para estudar a infecção fúngica do alvéolo por Aspergillus fumigatus e a eficácia de medicamentos antifúngicos, aproveitando a microscopia de alta resolução e a análise de imagem baseada em algoritmo em combinação com ensaios biológicos moleculares, incluindo coloração de imunofluorescência e perfil de citocinas7. A modelagem da aspergilose pulmonar invasiva no alvéolo no chip revelou funções-chave dos macrófagos humanos que poderiam inibir parcialmente o crescimento do fungo. Os macrófagos foram centrais na liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, que se correlacionaram com um aumento do número de hifas fúngicas invasivas. Além disso, o estudo confirmou que a droga fungistática caspofungina limita efetivamente o crescimento fúngico e induz mudanças morfológicas na estrutura fúngica, alinhando-se com os achados de outros estudos. Esses estudos confirmam o potencial da plataforma modelo para identificar alvos celulares de infecção e testar drogas em concentrações clinicamente relevantes.
Existem vários aspectos que precisam ser considerados durante o estabelecimento do alvéolo no chip. A semeadura precisa de células é fundamental para obter uma distribuição celular uniforme e a formação de camadas. Certifique-se de que as células sejam semeadas na densidade apropriada para alcançar a confluência sem crescer demais, o que pode comprometer a integridade e a funcionalidade das camadas celulares. Durante o processo de estabelecimento do ALI, remova cuidadosamente o meio do lado apical e feche as portas para evitar contaminação. Manter as condições ideais de co-cultura, como temperatura, níveis de CO2 e composição do meio, é fundamental para a sobrevivência e interação das células endoteliais e epiteliais. Sempre execute as trocas de meio com cuidado para evitar perturbar as camadas celulares ou introduzir bolhas de ar. Pipete suavemente e certifique-se de que todos os equipamentos usados sejam estéreis para minimizar o risco de contaminação. Para evitar bolhas de ar, pipete lentamente e incline o cavaco durante as trocas médias para permitir que as bolhas escapem. Trabalhe em um ambiente limpo, estéril e controlado para minimizar a contaminação. Considere a complexidade e a precisão necessárias para estabelecer e manter o modelo 3D para experimentos subsequentes com o modelo. Se as camadas celulares não estiverem se formando corretamente, considere otimizar a densidade celular e os lotes de células, pois podem ocorrer diferenças no crescimento celular dependendo do doador e do lote.
Embora o modelo ofereça melhorias significativas em relação aos métodos existentes, também é essencial reconhecer que algumas limitações devem ser consideradas. Uma dessas limitações é a complexidade e o custo associados à operação do dispositivo microfluídico. A execução de modelos organ-on-chip requer equipamentos especializados e experiência em microfluídica para adotar o modelo alveolus-on-chip. Além disso, embora este modelo possa replicar com sucesso muitas das principais características do ambiente alveolar, ele não pode replicar totalmente todas as interações celulares e forças mecânicas encontradas in vivo. Por exemplo, o modelo não possui um sistema imunológico abrangente ou toda a gama de tipos de células no pulmão humano, o que pode afetar a precisão dos estudos de interação patógeno-hospedeiro.
Apesar dessas limitações, o modelo lung-on-chip oferece avanços em comparação com as culturas de células 2D tradicionais, como os sistemas Transwell. Ao incorporar uma interface ar-líquido, células endoteliais e epiteliais e componentes imunes em um tecido multicamadas dentro de um ambiente dinâmico e perfundido, o modelo representa uma abordagem fisiologicamente mais relevante para estudar a fisiologia pulmonar, doenças e respostas ao tratamento in vitro. Isso é crucial para avançar nossa compreensão das infecções respiratórias humanas e desenvolver terapias mais eficazes. A capacidade do modelo de manipular com precisão pistas biofísicas e bioquímicas representa uma característica importante para dissecar os mecanismos de progressão da doença e ação do medicamento. O uso de material celular humano pode reduzir ainda mais as diferenças relacionadas entre espécies observadas em experimentos com animais. A integração de múltiplas análises de biomarcadores também aumenta ainda mais a profundidade e a amplitude dos dados obtidos a partir de um único experimento, o que contribui para reduzir os custos da experimentação in vitro. Embora reconheça suas limitações, o modelo lung-on-chip representa um avanço significativo na pesquisa de doenças respiratórias, oferecendo uma alternativa mais precisa, ética e eficiente aos métodos tradicionais.
Divulgações
K.R. é CEO da Dynamic42 GmbH e detém participação acionária na empresa. A.S.M. é consultor científico da Dynamic 42 GmbH e detém participação acionária na empresa. Todos os outros autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
H.K. e A.S.M. reconhecem o financiamento do Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financiado pela linha de financiamento Strategic Networking da Leibniz Association. A M.A. e a A.S.M. foram apoiadas pelo projeto IGF IMPROVE financiado pelo Ministério Federal de Assuntos Econômicos e Energia com base em uma resolução do Bundestag alemão. A A.S.M reconhece ainda o apoio financeiro do Cluster of Excellence Balance of the Microverse sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ConsumíveisLâminas de | |||
| câmara de contagem de células (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Placas multipoços para cultura de células, 24 poços, Greiner | Bio-One | 662 160 | |
| Placas multipoços para cultura de células estéreis, 6 poços, Greiner | Bio-One | 657 160 | |
| lamínulas (24x40mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Toalhetes ecológicos | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Gaze swab | Noba | PZN 2417767 | |
| Luvas Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Lâminas | de microscópio Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Placas Multipoços 24 Poços, estéreis | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| pipetas Pasteur (vidro) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| pipetas Pasteur (vidro) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Tubos de fundo redondo (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Bisturis | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Pipetas sorológicas 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Pipetas sorológicas 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Pipetas sorológicas 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Pipetas sorológicas 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Pipetas sorológicas 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| Frasco T25 | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Pontas estéreis 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Pontas estéreis 1250µ L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Pontas estéreis 300µ L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Pontas não esterilizadas 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Pontas não esterilizadas 1000µ L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Pontas não esterilizadas 200µ L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Pinças (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Etanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Meio de montagem fluorescente | Dako | S3023 | |
| Metanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponina | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Cultura de células | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| Solução EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais | Promocell | C-22020 | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais Mix de suplementos | Promocell | C-39225 | |
| Soro fetal bovino | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Recombinante humano GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocaína | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Coloração azul de tripano 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Tripsina | Gibco | 15090-046 | |
| < forte > Anticorpos primários < / forte > | |||
| Caderina-5 / VE-Caderina (cabra) | BD | 610252 | |
| CD68 (coelho) | Sinalização celular | 76437 | |
| E-caderina (cabra) | R& D | AF748 | |
| SP-A (camundongo) | Abcam | ab51891 | |
| Anticorpos secundários | |||
| AF488 (camundongo anti-burro) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (anti-rato burro) | Invitrogen | A31571 | |
| AF647 (anti-coelho burro) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (burro anti cabra) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluídico | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Macho Luer Lock (pequeno) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Macho mini luer plugs, fileira de quatro, PP, verde | Microfluídico chipshop | 09-0558-0336-11 | |
| Plugues luer mini macho, fileira de quatro, PP, opaco | Chipshop microfluídico | 09-0556-0336-09 | |
| Plugues luer mini macho, fileira de quatro, PP, vermelho | Plugues microfluídicos chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| Cole | Parmer | GZ-45555-56 | |
| Reservatório 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Tubulação | Dinâmica 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 Incubadora | Heracell | 150i | |
| Countess contador de células automatizado | Invitrogen | C10227 | |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
| Freezer (-20 ° C) | Freezer Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 ° C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Geladeira | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Microscópio | Leica | DM IL LED | |
| Agitador orbital | Heidolph | Reax2000 | |
| Bomba peristáltica | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipetas 10µ L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipetas 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipetas 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipetas 2.5µ L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipetas 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipetas 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| Bancada Estéril | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Banho de Água | Julabo | SW-20C | |
| Fluorescence Microscope Setup | |||
| Apotome.2 | Dispositivo de iluminação Zeiss | ||
| Microscópio | Zeiss | HXP 120 C | |
| Zeiss | Axio Observer 5 | ||
| Seccionamento óptico | Zeiss | ApoTome | |
| Fonte de alimentação Microscópio | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN | Zeiss |
Referências
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Reimpressões e permissões
