Detecção da interação proteína-umbeliferona CD40 por fluorescência de varredura diferencial

Resumo

Este protocolo descreve um método exclusivo para detectar a ligação entre compostos e moléculas de proteína, oferecendo as vantagens de perda mínima de amostra de proteína e alta precisão de dados.

Resumo

A investigação das interações entre diferentes moléculas é um aspecto crucial para a compreensão da patogênese da doença e a triagem de alvos de drogas. A umbeliferona, um ingrediente ativo da medicina tibetana Vicatia thibetica, exibe um efeito imunomodulador com um mecanismo desconhecido. A proteína CD40 é um alvo chave na resposta imune. Portanto, este estudo emprega o princípio da tecnologia de fluorescência de varredura diferencial para analisar as interações entre a proteína CD40 e a umbeliferona usando marcadores enzimáticos fluorescentes. Inicialmente, a estabilidade do corante laranja fluorescente proteico foi verificada experimentalmente e a razão de diluição ótima de 1:500 foi determinada. Posteriormente, observou-se que o valor de fusão da temperatura (Tm) da proteína CD40 tendeu a diminuir com o aumento da concentração. Curiosamente, descobriu-se que a interação entre a proteína CD40 e a umbeliferona aumenta a estabilidade térmica da proteína CD40. Este estudo representa a primeira tentativa de detectar o potencial de ligação de compostos e proteínas de moléculas pequenas usando microplacas de fluorescência e corantes fluorescentes. A técnica é caracterizada por alta sensibilidade e precisão, prometendo avanços nos campos de estabilidade de proteínas, estrutura de proteínas e interações proteína-ligante, facilitando assim pesquisas e explorações futuras.

Introdução

Vicatia thibetica H. Boissieu, uma planta da família das umbelíferas, é comumente usada na medicina tibetana e representa um dos componentes essenciais dos cinco ingredientes básicos (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. Distribuído principalmente no sudoeste da China, como noroeste de Yunnan, oeste de Sichuan, Tibete e outras áreas, sua raiz seca serve como um substituto local para Angelica¹. A raiz, conhecida por sua fragrância, é frequentemente utilizada como tempero de ensopado, e as folhas, conhecidas como aipo tibetano, contribuem para pratos deliciosos. Assim, Vicatia thibetica tem importância não apenas como uma planta medicinal única, mas também como fonte de alimento no Tibete.

Pesquisas nacionais e internacionais indicam que a Vicatia thibetica possui propriedades revigorantes de sangue e qi (poder ou energia), benéficas para regular a menstruação. É empregado para tratar sintomas de dismenorreia menstrual irregular causada por palpitações e deficiência sanguínea, exibindo efeitos farmacológicos, como regulação antioxidante da imunidade corporal². O extrato alcoólico de Vicatia thibetica demonstrou a capacidade de restaurar a massa corporal e o índice de órgãos em camundongos imunocomprometidos induzidos por ciclofosfamida. Além disso, aumenta a atividade da superóxido dismutase no soro e reduz o conteúdo de malondialdeído, sugerindo uma melhora na capacidade antioxidante e um efeito de equilíbrio na peroxidação lipídica ^2,3. Simultaneamente, aumenta o número de células sanguíneas e hemoglobina, o que não apenas reflete objetivamente a função hematopoiética do corpo, mas também desempenha um papel crucial no sistema imunológico ^2,3.

A umbeliferona, caracterizada por cristais aciculares e sabor amargo, possui um pequeno peso molecular, é volátil e pode ser destilada com vapor. Sublima facilmente, tem baixa solubilidade em água e alta solubilidade em matéria orgânica. Como um dos principais componentes químicos da Vicatia thibetica, a umbeliferona exibe efeitos imunomoduladores na imunidade celular, imunidade humoral e imunidade inespecífica em modelos de camundongos imunossupressores induzidos por hidrocortisona ^4,5.

A molécula de superfície celular CD40, membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral, é amplamente expressa em células imunes⁶. Seu ligante homólogo, CD154, também conhecido como CD40L, é uma proteína transmembrana do tipo II expressa por linfócitos T ativados. A ativação do CD40 tem a capacidade de regular positivamente a expressão de moléculas co-estimulatórias na superfície das células dendríticas (DC) e monócitos. Esse processo promove a função de apresentação de antígenos das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e ativa ainda mais as células T CD8+⁷.

Os macrófagos desempenham um papel crucial na formação e regulação do microambiente tumoral, e a ativação do CD40 pode aumentar a remodelação do microambiente tumoral pelos macrófagos⁸. A ativação do sinal CD40 influencia significativamente a proliferação e ativação das células B. As células B, quando ativadas pelo CD40, podem funcionar como células apresentadoras de antígenos eficazes. Eles apresentam antígenos, geram atividade de células T efetoras e, assim, contribuem para efeitos antitumorais⁹. Além disso, a ativação de CD40 em células tumorais pode induzir apoptose e inibir o crescimento tumoral¹⁰. O CD40 transduz principalmente sinais controlando a atividade de proteínas quinases de tirosina não receptoras, incluindo Lyn, Fyn, Syk e outras. Além disso, tem a capacidade de estimular as proteínas Bcl-xL, Cdk4 e Cdk6, ativar fatores de transcrição Rel/NF-kB e fosforilar CG-2 e PI3K¹⁰.

O método de Fluorescência de Varredura Diferencial (DSF) é amplamente empregado para avaliar o impacto de várias condições ambientais, como composição do tampão, temperatura e ligantes de moléculas pequenas, na estabilidade térmica das estruturas proteicas. O corante comumente utilizado para DSF é um corante laranja, ambientalmente sensível e hidrofóbico. Em condições normais, a estrutura da proteína é dobrada, ocultando seu segmento hidrofóbico internamente. À medida que a temperatura aumenta, a região hidrofóbica da proteína fica mais exposta, resultando em uma quebra gradual da estrutura natural da proteína. O corante se liga seletivamente a essa porção proteica exposta, amplificando sua fluorescência. Os valores de Tm são então calculados monitorando as mudanças na detecção do sinal de fluorescência¹¹. Até certo ponto, variações nos valores de Tm podem medir mudanças na estabilidade da proteína devido a mutações, mudanças nos tampões ou ligação do ligante. Além disso, pode indicar alterações estruturais durante o processo de enovelamento proteico¹². Essa abordagem oferece dados precisos, uma ampla faixa de temperatura, alta sensibilidade e perda mínima de amostra de proteína¹³.

Neste estudo, a determinação da fluorescência foi realizada usando um leitor de microplacas fluorescentes em vez de um aparelho de reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) de fluorescência. Essa modificação permite a detecção de DSF em laboratórios que não possuem um instrumento de PCR quantitativo fluorescente, tornando o método menos complexo e reduzindo as etapas necessárias para a configuração do instrumento, simplificando assim o processo experimental. No entanto, existem certas desvantagens nessa abordagem. Enquanto a complexidade é reduzida, o procedimento se torna mais complicado. A detecção manual de fluorescência em diferentes temperaturas é necessária, e a coleta automática e contínua de fluorescência do sistema não pode ser alcançada. Assim, este estudo utilizou a técnica DSF para explorar a interação entre a proteína CD40 e a umbeliferona, fornecendo novos insights sobre os mecanismos moleculares da medicina tibetana.

Protocolo

A solução composta, a solução proteica e o corante foram introduzidos em uma solução de PBS. Posteriormente, as amostras foram submetidas a aquecimento gradual usando um banho seco de aquecimento digital, e a estabilidade térmica das proteínas foi avaliada medindo a mudança na intensidade de fluorescência dentro do sistema complexo. As etapas detalhadas são descritas abaixo e a Figura 1 ilustra uma visão geral do protocolo.

1. Preparação da solução

1. Prepare uma solução de umbeliferona 1 mM adicionando 0,1 mg de umbeliferona a 616,75 μL de solução de DMSO (ver Tabela de Materiais).
2. Prepare uma solução de proteína CD40 a 200 μg / mL adicionando 0,1 mg de CD40 a 500 μL de solução de ddH₂O (consulte a Tabela de Materiais).
3. Prepare uma solução de corante laranja 500x adicionando 1 μL de corante laranja 5000x a 9 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Realize as operações acima no gelo e, como a pipeta tem uma faixa mínima de 0.1 μL, dilua inicialmente o corante de proteína laranja por um fator de 10 para facilitar o uso subsequente.

2. Teste de desempenho do corante

1. Adicione o corante laranja 500x a uma solução de PBS e dilua-o para obter corante: proporções de PBS de 1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000.
   NOTA: Certifique-se de que a concentração final de DMSO não exceda 2% (v/v).
2. Ligue o leitor de microplacas fluorescentes e pré-aqueça-o por 10 min.
3. Abra o computador e o software de aquisição de dados em sequência (consulte Tabela de Materiais).
4. Clique em Instrumento, escolha o modelo de microplaca de fluorescência correspondente e selecione OK no software de aquisição de dados.
   NOTA: Aguarde até que a microplaca de fluorescência termine o pré-aquecimento e exiba a temperatura no painel antes de abrir o software de aquisição de dados para garantir uma conexão bem-sucedida entre o instrumento e o software.
5. Clique em Configurações de aquisição e selecione Fluorescência no software de aquisição de dados.
6. Edite o programa na interface Comprimentos de onda: Lm1 = 470 nm, 570 nm e selecione OK.
   NOTA: O corante laranja pode ser excitado com luz UV a 300 nm ou luz visível a 470 nm, e a emissão pode ser medida a 570 nm.
7. Adicione diferentes concentrações de corante laranja (1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000) e PBS a placas de 96 poços a 100 μL/poço.
   NOTA: Dissolva a solução em DMSO antes de adicioná-la ao PBS e vortexe-a a 2000 x g completamente durante o processo de preparação para garantir a dissolução completa devido à tendência do corante a precipitar.
8. Coloque a placa de 96 poços no estágio de detecção do instrumento, clique no botão Ler no software de aquisição de dados e meça a fluorescência de cada concentração de corante 13 vezes à temperatura ambiente, com um intervalo de 2 min de cada vez.
9. Clique no botão Exportar após cada determinação, selecione Exportar para XML XLS TXT, escolha Todas as placas, selecione Placa no formato de saída e, finalmente, clique em OK para salvar os dados em uma pasta no formato "XLS" para análise posterior.
   NOTA: Essas etapas ajudam a determinar o impacto da medição contínua na autofluorescência do corante laranja à temperatura ambiente e identificar a concentração ideal de coloração.
10. Ligue o banho seco de agitação de aquecimento digital, ajuste a temperatura de aquecimento para 35 °C e o tempo de aquecimento para 2 min.
11. Preparar a taxa de diluição ideal do corante num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e colocá-lo no banho de aquecimento digital por 2 min.
12. Adicionar a solução de PBS e a solução de coloração, aquecida a 35 °C, à placa de 96 poços a um volume de 100 μl por alvéolo.
13. Coloque a placa de 96 poços no estágio de detecção do instrumento e clique no botão Ler no software de aquisição de dados.
14. Defina a temperatura de aquecimento para 40 °C e o tempo de aquecimento para 2 min.
15. Pipete a solução de corante na placa de 96 poços de volta para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e aqueça-a no instrumento por 2 min.
16. Repita as operações das etapas 2.12-2.15 e 2.9 para testar a absorbância da solução de corante a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C, respectivamente.
    NOTA: Essas etapas ajudam a determinar a estabilidade da autofluorescência do corante laranja sob aquecimento contínuo em um gradiente de 35 ° C a 95 ° C. É crucial trabalhar rapidamente para evitar quedas rápidas de temperatura ou adicionar o líquido errado, o que pode levar a erros experimentais.

3. Detecção da temperatura de fusão (Tm) da proteína

1. Combine a proteína CD40 e o corante laranja com a solução de PBS para atingir concentrações finais de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL e 1:500, respectivamente.
2. Repita as operações descritas nas etapas 2.2-2.6 e nas etapas 2.10-2.16 para avaliar a absorbância da solução de proteína CD40 em temperaturas de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C, respectivamente.
3. Reitere a etapa 2.9 para salvar e analisar os dados e, posteriormente, calcule o valor de Tm usando um software de análise de dados (consulte a Tabela de Materiais).
4. Adicione proteína CD40, umbeliferona e corante laranja à solução de PBS para obter concentrações finais de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM e 1:500, respectivamente.
   NOTA: O vórtice vigoroso durante a preparação da solução é essencial para garantir a distribuição uniforme do corante, proteína CD40 e umbeliferona na PBS.
5. Repita as operações das etapas 3.2-3.3 para medir a absorbância da solução de complexos CD40-umbeliferona em temperaturas de 35 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C, 75 ° C, 80 ° C, 85 ° C, 90 ° C e 95 ° C, respectivamente.
   NOTA: Essas etapas foram conduzidas para determinar os valores de Tm da proteína CD40 e dos complexos CD40-umbeliferona, com o objetivo de identificar a concentração ideal de ligação da proteína CD40 à umbeliferona.

Resultados

O corante laranja exibiu consistentemente excitação de fluorescência estável em E_x = 470 nm e E_m = 570 nm, tanto à temperatura ambiente quanto a temperaturas elevadas. Determinou-se uma razão de diluição ótima de 1:500 (Figura 2A,B). A detecção do valor de Tm mostrou-se desafiadora quando a concentração da proteína CD40 estava abaixo de 15 μg/mL (Figura 3A,B). No entanto, na concentração de 15 μg/mL, foi detectado um valor estável de Tm de 51,82 °C, que diminuiu para 45,79 °C com o aumento da concentração da proteína CD40 (Figura 3C,D).

Conforme ilustrado na Figura 3, é evidente que a ligação da proteína CD40 à umbeliferona influencia o valor de Tm da proteína CD40. Especificamente, os valores de Tm da proteína CD40 nas concentrações de 15 μg/mL e 20 μg/mL, bem como 10 μM de umbeliferona, aumentaram para 62,08 °C e 65,27 °C, respectivamente.

Figura 1: Visão geral do protocolo. Fluxograma do processo de registro da capacidade de ligação da proteína CD40 à umbeliferona com base no princípio DSF usando um leitor de microplacas fluorescentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Triagem das taxas de diluição do corante laranja e testes de estabilidade. (A) Estabilidade de fluorescência de corantes com diferentes taxas de diluição à temperatura ambiente. (B) Estabilidade à fluorescência de corantes com uma razão de diluição de 1:500 a 35-95 °C. As barras de erro denotam ± média SEM, n = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Gráficos de resultados do uso de um leitor de microplacas fluorescentes para registrar a capacidade de ligação da proteína CD40 à umbeliferona de acordo com o princípio DSF. (AD) Perfis de Tm de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL de proteína CD40 e CD40 + 10 μM de umbeliferona, respectivamente. As barras de erro denotam ± média SEM, n = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

DSF, também conhecido como ensaio de deslocamento térmico ou ensaio de fluorescência térmica, é uma técnica empregada para detectar o processo de desnaturação térmica de proteínas em amostras, monitorando mudanças no sinal de fluorescência da amostra de teste ou corante durante um aumento lento e programado de temperatura. Inicialmente estabelecido por Pantoliano¹⁴, o DSF serve como um método de alto rendimento. O procedimento principal envolve elevar a temperatura em uma placa aquecida controlada por computador, emitir luz de excitação usando uma lâmpada ultravioleta de comprimento de onda longo e capturar mudanças na intensidade do sinal fluorescente resultante da ligação de corantes fluorescentes a proteínas por meio de uma câmera formadora de fase de dispositivo de carga acoplada.

O valor de Tm, um indicador crucial que caracteriza a estrutura de nível superior das proteínas, representa a temperatura correspondente à metade da desnaturação do medicamento proteico durante um aumento de temperatura. Valores mais altos de Tm sugerem uma maior necessidade de temperatura para a desnaturação da proteína, indicando uma estrutura proteica mais estável. O método atualmente reconhecido para detecção de valores de Tm é a calorimetria exploratória diferencial (DSC), iniciada na década de 1960¹⁵. O DSC mede a diferença de potência fornecida ao objeto que está sendo testado e a um objeto de referência em função da temperatura sob controle de temperatura programado para obter a quantidade de calor absorvida e descarregada. Apresenta-se como padrão-ouro para análise de estabilidade térmica^16,17.

O DSF ganhou amplo uso devido a três vantagens sobre o DSC: (1) Menor consumo de amostra: O DSC normalmente requer um volume de amostra de 400 μL, enquanto o DSF requer apenas 20-25 μL. (2) Faixa de concentração maior: O DSC geralmente requer concentrações de proteína de 0,2-2 mg/mL para obter um pico de desnaturação significativo, enquanto o DSF pode analisar amostras na faixa de 0,005-200 mg/mL. (3) Maior rendimento de amostras: o DSC pode analisar apenas uma amostra por vez, enquanto o DSF pode escanear simultaneamente até 96 ou mais amostras¹⁸. Devido a essas vantagens, o DSF é amplamente utilizado no estudo da estabilidade da proteína, estrutura e conformação da proteína, interações proteína-ligante e os efeitos de estabilizadores de proteínas, inibidores, cofatores e muito mais.

Além de DSF e DSC, existem várias outras técnicas de interação molecular. A ressonância plasmônica de superfície (SPR) é um fenômeno óptico que ocorre na interface de dois meios e pode ser induzida por fótons ou elétrons. Envolve reflexão total quando a luz é emitida de um meio opticamente denso para um meio opticamente esparso. O ângulo no qual ocorre a ressonância plasmônica de superfície é conhecido como ângulo SPR. Os biossensores SPR utilizam mudanças nos ângulos SPR para monitorar interações intermoleculares em tempo real^19,20. A termoforese em microescala (MST) é uma técnica para analisar interações biomoleculares detectando mudanças no tamanho, carga e camada de hidratação de biomoléculas causadas pela ligação. Ele registra as mudanças de fluorescência na região irradiada por um laser infravermelho dentro da amostra antes, durante e depois que o laser é ligado, permitindo determinações relativamente rápidas²¹. A interferometria de biocamada (BLI) mede as reações da superfície do sensor rastreando as mudanças de deslocamento no espectro de interferometria. Nos experimentos BLI, uma molécula é imobilizada na superfície de um sensor submersível para detectar outra molécula que pode se ligar a ela. A interação de ligação induz o deslocamento de interferência, e o monitoramento em tempo real dessa mudança de deslocamento produz a curva de ligação²². A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) quantifica as interações biomoleculares medindo diretamente o calor liberado ou absorvido durante a ligação biomolecular. Ele fornece informações termodinâmicas abrangentes sobre interações moleculares²³. Em comparação com essas tecnologias de interação molecular, o DSF tem requisitos mais baixos para instrumentos, consumíveis e técnicas operacionais. Ele pode detectar com eficiência interações entre compostos e proteínas na maioria dos laboratórios.

O procedimento operacional da tecnologia DSF é relativamente simples. Inicialmente, amostras de substância branca, tampões de reação, corantes fluorescentes e ligantes candidatos são combinados em um sistema de reação. Este sistema é então transferido para um instrumento de PCR de fluorescência, onde são estabelecidas condições de aquecimento e detecção para determinação de fluorescência^24,25. O corante proteico mais comumente usado para DSF é atualmente o corante laranja, e o instrumento de detecção é tipicamente um instrumento de PCR quantitativo de fluorescência²⁶. No entanto, devido ao comprimento de onda de excitação do corante laranja ser de 470 nm e o comprimento de onda de emissão ser de 570 nm, nem todos os instrumentos de PCR quantitativos de fluorescência no mercado são uma combinação perfeita. Portanto, este estudo adota um leitor de microplacas fluorescentes como um novo instrumento de detecção para explorar as interações proteína-ligante.

Essa abordagem oferece duas vantagens principais sobre o DSF usando um instrumento de PCR quantitativo fluorescente. Em primeiro lugar, a faixa de comprimento de onda do marcador enzimático fluorescente pode ser personalizada, tornando-a mais compatível com a faixa de comprimento de onda do corante e garantindo uma detecção de fluorescência mais precisa. Em segundo lugar, o programa de um instrumento de PCR quantitativo de fluorescência não pode ser interrompido uma vez iniciado, tornando difícil solucionar quaisquer problemas durante o processo de aquecimento. Em contraste, um leitor de microplacas fluorescente permite a eliminação de interferências modificando iterativamente a proporção do sistema e as condições de detecção ao longo do processo de detecção. No entanto, o uso de um leitor de microplacas fluorescentes para DSF também apresenta certas desvantagens, principalmente a quantidade relativamente grande de amostra necessária, normalmente variando de 50 a 200 μL, enquanto o DSF tradicional normalmente utiliza 20 a 25 μL de amostra.

Neste artigo, foi realizada a validação do DSF baseado em um leitor de microplacas fluorescentes para detecção de Tm usando proteína CD40 e umbeliferona dentro da faixa de concentração de 5-20 μg/mL. Os resultados demonstraram a alta especificidade e acurácia do método, afirmando sua adequação para a detecção de Tm. A comparação subsequente dos resultados de detecção de Tm em diferentes concentrações de amostra revelou uma tendência decrescente no valor de Tm da proteína CD40 à medida que a concentração aumentava, sugerindo um potencial efeito de concentração na detecção de Tm (Figura 3). Além disso, o estudo detectou um aumento no valor de Tm da proteína CD40 após a adição de umbeliferona ao sistema em comparação com antes da adição. Isso indica que a umbeliferona possui a capacidade de se ligar à proteína CD40, levando a um aumento na estabilidade térmica da proteína CD40 após sua combinação (Figura 3).

As etapas críticas do protocolo foram identificadas como etapas 2.7 a 2.16, cuja conclusão bem-sucedida influencia diretamente a detecção subsequente de fluorescência de proteínas. Em resumo, este estudo estabeleceu um novo método de detecção de DSF baseado nos princípios da tecnologia DSF, utilizando a proteína CD40 e a umbeliferona como exemplo. O método analisou efetivamente a força de ligação entre proteínas e ligantes usando um leitor de microplacas fluorescente. Além disso, esta técnica pode ser estendida para a análise da estabilidade de proteínas e pesquisa sobre a estrutura de proteínas, aprofundando a aplicação da tecnologia DSF no estudo de vias de sinalização celular e explorando a patogênese de doenças.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Proteína CD40	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 leitor de microplacas multifuncional	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724 (B724)
salina tamponada com fosfato ( 1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO corante laranja	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854