Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Resumo

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Resumo

Várias técnicas para isolar a medula óssea de camundongos adultos foram bem estabelecidas. No entanto, isolar a medula óssea de camundongos neonatais é desafiador e demorado, mas para alguns modelos, é translacionalmente relevante e necessário. Este protocolo descreve um método eficiente e direto para preparar células da medula óssea de filhotes de 7 a 9 dias de idade. Essas células podem então ser isoladas ou diferenciadas em tipos específicos de células de interesse. Os macrófagos são células imunológicas cruciais que desempenham um papel importante na inflamação e infecção. Durante o desenvolvimento, os macrófagos neonatais contribuem significativamente para a remodelação tecidual. Além disso, o fenótipo e as funções dos macrófagos neonatais diferem daqueles de seus homólogos adultos. Este protocolo também descreve a diferenciação de macrófagos neonatais das células isoladas da medula óssea na presença de meio condicionado por L929. Marcadores de superfície para macrófagos neonatais diferenciados foram avaliados por meio de análise por citometria de fluxo. Para demonstrar a funcionalidade, a eficiência fagocítica também foi testada usando Escherichia coli conjugada com corante sensível ao pH.

Introdução

A medula óssea envolve populações de células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais que são auto-renováveis e podem ser diferenciadas em várias linhagens celulares. As células-tronco hematopoiéticas na medula óssea dão origem a linhagens mieloides e linfóides¹. As células-tronco mesenquimais produzem osteoblastos (osso), adipócitos (gordura) ou condrócitos (cartilagem)². Essas células têm múltiplas aplicações no campo da biologia celular e engenharia de tecidos, incluindo terapia gênica ^3,4. As células progenitoras presentes na medula óssea se diferenciam em tipos celulares específicos na presença de fatores de crescimento específicos da linhagem. A eritropoietina promove a proliferação de células progenitoras eritroides, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) estimula o crescimento de colônias de neutrófilos e a trombopoetina regula a produção de plaquetas como alguns exemplos de fatores de crescimento específicos da linhagem⁵. O FACS marcado com antígeno de superfície celular e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) são métodos bem estabelecidos para isolamento e purificação dos tipos específicos de células derivadas da medula óssea⁶.

Embora os estudos neonatais estejam avançando para encontrar as causas das mortes neonatais e abordar as complicações durante os partos prematuros, o desenvolvimento terapêutico direto continua sendo uma necessidade médica não atendida. Smith e Davis afirmaram: "Os pacientes pediátricos permanecem órfãos terapêuticos"⁷. Existem vários desafios, como amostras pequenas, efeitos do resultado ao longo da vida e questões éticas na obtenção de consentimento em estudos clínicos de neonatos⁸. Portanto, há uma alta demanda por modelos de estudo in vivo e in vitro específicos para neonatos para alcançar relevância translacional. Devido às semelhanças entre os níveis anatômicos e teciduais, períodos gestacionais curtos e tamanhos de ninhada, os roedores são o sistema modelo de mamíferos mais estudado.

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado, altamente viável e reprodutível para isolar a medula óssea de filhotes de camundongos de 7 a 9 dias de idade e sua capacidade de se diferenciar em macrófagos. No entanto, uma variedade de linhagens celulares pode ser alcançada com o uso de sinais de diferenciação distintos. Também demonstramos a presença de marcadores de superfície celular e a presença de atividade fagocítica in vitro esperada para macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs).

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Virgínia Ocidental e foram realizados seguindo as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa. Filhotes de camundongos C57BL/6J foram usados para este estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia

1. Prepare 3 mL de meio de cultura MEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL) em um tubo de centrifugação de 5 mL e mantenha-o no gelo.
2. Se necessário para armazenar progenitores da medula óssea em nitrogênio líquido, prepare meios de congelamento contendo 10% de DMEM, 80% de FBS e 10% de DMSO.
3. Para DMEM completo, prepare DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL).
4. Para diferenciação de macrófagos, prepare DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL) e 10% de sobrenadante de células L929 ^9,10,11.

2. Preparação do sobrenadante de células L929

1. Descongele as células L929 armazenadas em nitrogênio líquido e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de DMEM completo. Centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
2. Ressuspenda as células em 5 mL de meio DMEM completo e semeie-as em um frasco de cultura de tecidos T25 na densidade de 2×10⁵ células. Conte as células com um contador de células automatizado usando 0,4% de azul de tripano. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ até atingir 70% de confluência.
3. Para separar as células, primeiro lave-as com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Aspire o PBS e substitua-o por 2,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
4. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 5 min e adicionar 5 ml de DMEM completo.
5. Colete as células e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
6. Ressuspenda o pellet celular em 15 ml de meio DMEM completo e transfira-o para um balão T75.
7. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células atinjam 90% de confluência e, em seguida, recolher o meio e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Filtrar o meio contendo M-CSF através de um filtro de 0,45 μm e congelar a -80 °C em alíquotas de 5 ml.

3. Preparação do animal

1. Sob um gabinete de biossegurança, separe cuidadosamente os filhotes de camundongo C57BL / 6J de 7 a 9 dias (uma ninhada de 6 filhotes) da barragem e coloque-os em uma gaiola separada.
2. Mergulhe uma bola de algodão em 2 mL de isoflurano de grau veterinário em uma campânula ou outra câmara de contenção.
3. Coloque um filhote na câmara e feche a tampa. Monitore o recém-nascido por aproximadamente 90 s para garantir que ele fique imóvel e inconsciente.
4. Remova rapidamente o filhote e decapite-o com uma tesoura afiada (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) antes que ele possa recuperar a consciência.
   NOTA: Os neonatos não respiram suficientemente fundo para a eutanásia apenas por inalação de isoflurano.
5. Certifique-se de fechar a tampa do recipiente depois que cada filhote for removido. A mesma bola de algodão pode ser usada para 5-7 filhotes.

4. Isolamento da medula óssea neonatal

1. Esterilize o corpo do neonato com etanol a 70%.
2. "Usando fórceps e tesouras cirúrgicas de ponta fina, faça uma incisão entre os
   abdômen e patas traseiras. Remova a pele puxando em direção ao pé dos membros posteriores.
3. Raspe o tecido conjuntivo e o músculo preso aos ossos usando uma pinça afiada.
4. Corte a tíbia e o fêmur, conforme mostrado na Figura 1, com uma tesoura para destacá-la e removê-la. Usando uma pinça, coloque esses ossos no tubo de mídia no gelo. Repita o processo para cada filhote.
5. Transfira os ossos com a ajuda de uma pinça para um filtro de 40 μm com um tubo de coleta. Esmague os ossos e libere a medula pressionando com um êmbolo de seringa de 3 mL contra o filtro.
6. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
7. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células pipetando suavemente em NaCl a 0,2%, uma solução hipotônica para a lise dos eritrócitos. Adicione imediatamente um volume igual de NaCl a 1,6% para tornar a solução isotônica.
8. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C e retirar a solução de lise.
9. Ressuspenda em DMEM completo para uso imediato ou meio de congelamento para armazenamento e conte as células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.
   NOTA: Para o presente estudo, este método rendeu 6,55 (± 1,44) × 10⁶ células da medula óssea/filhote (Figura 1E).
10. Conservar as células a -80 °C em meios de congelação ou utilizá-las imediatamente conforme descrito abaixo.
    NOTA: Por causa da idade, os ossos são transparentes e claros o suficiente para visualizar a medula através deles. É importante ter cuidado ao puxar os ossos, pois a aplicação de uma leve pressão sobre eles pode ser suficiente para liberar a medula. A medula nos ossos neonatais está na forma de líquido, em vez de um fio intacto encontrado nos ossos adultos. É difícil coletar a medula se ela escapar durante a coleta dos ossos.

5. Diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea neonatal

1. Semear 2 × 10⁷ células da medula óssea por frasco T75 em 10 mL de DMEM completo que contém 10% de sobrenadante de células L929 (2,5 mL) como fonte de M-CSF. Incubar as placas de cultura a 37 °C com 5% de CO₂ durante 5 dias. Adicione 2 mL de meio condicionado a L929 no dia 3 de diferenciação.
2. Observe as células ao microscópio diariamente usando um microscópio invertido e um sistema de imagem com ampliação de 20x. Após a diferenciação, os macrófagos devem parecer aderentes, alongados e heterogêneos (Figura 2).
3. Para colher os macrófagos para ensaios a jusante, aspirar os meios de diferenciação.
4. Lave as células com 5 mL de PBS para remover as células não aderentes e as proteínas séricas que irão interferir no descolamento. Aspire o PBS.
5. Colha as células adicionando 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ao frasco. Colocar o balão de cultura a 37 °C com a incubadora de CO₂ a 5% durante 5 min e adicionar 5 ml de DMEM.
6. Pipete as células para se destacarem e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
7. Dissocie o pellet celular em 1 mL de DMEM completo e conte e verifique a viabilidade celular usando azul de tripano. Os BMDMs isolados usando este método são 7,05 (± 2,52) ×10⁵ células/filhote (Figura 1E).
   NOTA: Observe a presença de células fusiformes que começam a aparecer no segundo dia de diferenciação (Figura 1B, setas vermelhas). Se a cor da mídia ficar amarela, indicando que está gasta, adicione mais mídia condicionada por L929 no dia 4 de diferenciação; A substituição completa da mídia não é recomendada.

6. Imunomarcação e análise por citometria de fluxo

1. Bloqueie a marcação de anticorpos não específicos dos BMDMs (2x10⁵/marcador) tratando com 10 μL/10⁷ células de reagente bloqueador de FcR de acordo com as recomendações do fabricante em um volume de 100 μL/tampão de citometria de fluxo de marcação (PBS suplementado com 2 mM de EDTA e 0,5% de albumina de soro bovino). Mantenha no gelo por 10 min.
   NOTA: As células podem ser bloqueadas em massa ou em poços ou tubos individuais. Todas as etapas subsequentes indicam quantidades e volumes por marcador celular individual em um volume final de 100 μL.
2. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
3. Remover o sobrenadante e semear as células numa placa de 96 poços com fundo em U a uma densidade de 5 × 10⁵ células por alvéolo. Corar células adicionando corante FVS780-Vivo / Morto diluído a 3.000 vezes e 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4 / 80 e AlexaFluor488-CD206 em 100 μL de tampão de citometria de fluxo individualmente ou em combinação 12,13,14,15. Incube as células por 45 min em gelo coberto com papel alumínio.
4. Adicione 100 μL de tampão de citometria de fluxo e lave as células centrifugando a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
5. Aspirar o sobrenadante e vorticar suavemente o sedimento celular. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 0,4% em cada poço e incube durante a noite a 4 °C.
6. Lave as células adicionando 100 μL de tampão de citometria de fluxo e pellet por centrifugação a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
7. Ressuspenda as células em 400 μL de tampão de citometria de fluxo e analise usando um citômetro de fluxo.

7. Ensaio in vitro para avaliar a eficácia fagocítica de macrófagos derivados da medula óssea neonatal

1. Ressuspender os BMDMs em DMEM completo sem vermelho de fenol ou antibióticos e semeá-los a uma densidade de 2 × 10⁵ / quadrante em uma placa quádrupla de 35 mm a um volume de 500 μL.
2. Para preparar o inóculo bacteriano a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 25 ou outro MOI desejado, remova um estoque pré-calculado de Escherichia coli O1:K1:H7 armazenado a -80 °C.
3. Aliquota o volume desejado de bactérias em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Lave as bactérias adicionando PBS a um volume total de 1 mL. Pelotizar as bactérias por centrifugação a 2.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem.
4. Ressuspenda o pellet bacteriano em 50 μL de PBS e adicione corante verde fluorescente sensível ao pH até uma concentração final de 500 μM. Este é um corante sensível ao pH sem sinal fluorescente em pH neutro e fluoresce intensamente em ambientes ácidos, como fagossomos acidificados, durante o processo de fagocitose.
5. Incube as células bacterianas por 20 min no escuro para conjugação do corante.
6. Lave as bactérias quatro vezes com 1 mL de PBS por centrifugação a 1000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
7. Ressuspenda as bactérias em 500 μL de DMEM completo sem vermelho de fenol e adicione às culturas de BMDM.
8. Incubar os BMDMs a 37 °C em incubadora de CO₂ a 5% por 4 h e, em seguida, adicionar 200 ng de um corante fluorescente vermelho permeável às células que cora os lisossomos.
   NOTA: As bactérias fagocíticas podem ser visualizadas por microscopia fluorescente.

Resultados

Usando o método descrito neste estudo, 25 a 37 milhões de células da medula óssea podem ser isoladas com sucesso de uma ninhada de cinco filhotes de camundongos C57BL / 6. Este método foi validado com tamanhos de ninhada que variam de 5 a 7 filhotes. A idade mínima para isolamento em nossos experimentos foi de 7 dias. Dependendo do tamanho da ninhada e do número de células necessárias para o experimento ser inferior a um milhão, os pesquisadores podem tentar esse protocolo para camundongos com menos de 7 dias de idade. Na presença de sobrenadante de células L929 como fonte de M-CSF, as células da medula óssea foram diferenciadas em macrófagos em 5 dias (Figura 2). A formação de células fusiformes foi observada no segundo dia de diferenciação (Figura 2B), quase metade das células mostrou uma forma de fuso no terceiro dia (Figura 2C) e a maioria das células aderiu e formou formas fusiformes alongadas no quinto dia de diferenciação (Figura 2D). O rendimento de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) com este método foi de 2,5-5 milhões de células de 5 filhotes de 7 dias de idade.

Para caracterizar fenotipicamente os BMDMs diferenciados, as células das culturas de 5 dias foram imunomarcadas para CD11b, CD206 e F4/80. Os esquemas de dispersão para frente/lado e de passagem de marcador único podem ser vistos na Figura Suplementar 1. Os resultados da análise por citometria de fluxo demonstraram que 76,4% das BMDMs são positivas tanto para CD11b quanto para F4/80 (Figura 3A). A população F480-CD11b⁺ é consistente com o número aproximado de células positivas para CD206 (Figura 3B). Este último é geralmente considerado um marcador consistente com macrófagos semelhantes a M2 e, embora a abundância de marcação de CD206 possa variar até duas vezes mais, uma proporção maior de marcação F4 / 80 é consistente com a capacidade de M-CSF de promover a diferenciação para um fenótipo semelhante a M1^16,17 (Figura 3).

Avaliamos ainda a capacidade dos BMDMs neonatais diferenciados de fagocitar bactérias e trafegá-las para compartimentos acidificados como medida funcional. As bactérias marcadas com um corante sensível ao pH só devem fluorescer em verde quando fagocitadas e traficadas para compartimentos acidificados. Bactérias fluorescentes verdes abundantes fagocitadas dentro dos BMDMs foram detectadas após a infecção (Figura 4A). A fluorescência verde localiza-se ainda mais com fluorescência vermelha indicativa de lisossomos acidificados ( Figura 4B , C ). A fagocitose e o aparecimento de BMDMs neonatais positivos para corante sensível ao pH verde também foram observados durante a infecção de 4 h (Figura 4D e vídeo suplementar). A atividade funcional exibida aqui é consistente com a atividade inflamatória de macrófagos do tipo M1.

Figura 1: Isolamento da medula óssea de filhotes de camundongos C57BL/6J com 7 dias de idade. (A) Ossos dos membros posteriores de filhotes de 7 dias em um prato de 100 mm. (B) Membro posterior de um filhote de 7 dias após a remoção da pele e do tecido subcutâneo; linhas pontilhadas pretas indicam o local a ser cortado para a extração da medula óssea. (C) O membro posterior neonatal processou os ossos com medula antes do esmagamento. (D) O membro posterior neonatal processou os ossos após o esmagamento usando um êmbolo de seringa em um filtro. (E) O número médio ± erro padrão de células de macrófagos derivadas da medula óssea (MO) e da medula óssea obtidas de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diferenciação de BMDMs de células da medula óssea neonatal de 7 dias de idade. Células da medula óssea no dia 1 (A), dia 2 (B), dia 3 (C) e dia 5 de diferenciação (D). As setas vermelhas no painel B indicam células aderidas em forma de fuso no dia 2 de diferenciação. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Detecção de marcadores de macrófagos murinos usando análise de citometria de fluxo. Macrófagos neonatais diferenciados derivados da medula óssea mostrando a expressão de antígenos de superfície F4/80 e CD11b (A) ou CD206 e CD11b (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fagocitose de E. coli marcada com corante sensível ao pH por BMDMs neonatais. (A) Macrófagos derivados da medula óssea mostrando E. coli marcada com corante sensível ao pH (verde) fagocitada após 4 h de infecção. (B) BMDMs marcados com corante para lisossomos acidificados (vermelho). (C) Imagem mesclada dos painéis (A) e (B). Barras de escala: 20 μm. (D) Uma sobreposição de bactérias fluorescentes verdes em macrófagos mostradas em contraste de fase. A ampliação em (D) é a mesma que em (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar. Um vídeo de 4 h de imagens de células vivas de bactérias verdes fluorescentes por BMDMs neonatais, como na Figura 4, painel A. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar 1: Análise de citometria de fluxo de BMDMs. (A) Os BMDMs foram fechados pela primeira vez no FSC e SSC para remover detritos e gibões. Mostra-se uma única coloração de F4/80 (B), CD11b (C) e CD206 (D). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Pesquisas envolvendo modelos de camundongos neonatais podem apresentar uma série de desafios. Os neonatos têm um sistema imunológico em desenvolvimento que é único em comparação com os adultos⁸. Como tal, os dados gerados a partir de modelos animais adultos não devem ser considerados aplicáveis a recém-nascidos, e vários trabalhos publicados articularam bem essa ideia^18,19. Portanto, modelos específicos para neonatais e fontes de células são necessários para estudar os meandros da resposta imune no início da vida. No entanto, devido ao tamanho, sensibilidade e natureza delicada dos camundongos neonatais, a quantidade de amostras biológicas pode ser limitada e o processo de coleta pode ser demorado. Este protocolo estabelece um procedimento simples e eficiente em termos de tempo para a extração de medula óssea de camundongos neonatais.

Os ossos de camundongos adultos são grandes o suficiente para inserir uma agulha e liberar facilmente a medula. Por outro lado, acessar a medula óssea neonatal com uma agulha é um desafio devido ao seu tamanho e fragilidade. Alguns estudos empregaram digestão enzimática com colagenase tipo II e dispase²⁰. Aqui, devido à natureza macia e minúscula dos ossos neonatais, adotamos um método de esmagamento para liberar a medula óssea. Após a purificação, dependendo da aplicação de pesquisa de interesse, essas células podem ser diferenciadas em tipos específicos de células.

Os neonatos exibem populações fenotípicas distintas de macrófagos²¹. Este estudo elucidou a diferenciação de BMDMs de células da medula óssea de filhotes de 7 a 9 dias sem o uso de enzimas. As etapas críticas envolvidas na metodologia incluem a natureza delicada geral dos filhotes de camundongos neonatais, a coleta dos ossos pequenos de uma maneira que não permite a liberação da medula óssea e a localização do local adequado na tíbia e no fêmur para fazer cortes em tesoura. Observamos que as DMMOs neonatais são mais sensíveis do que as DMMs adultas em cultura, e um maior tempo de isolamento da medula óssea de neonatos proibiu sua capacidade de diferenciação. Portanto, a extração de mais de 7 filhotes por vez não é sugerida. Além disso, a adição de meios de diferenciação BMDM no segundo dia de diferenciação também resultou em resultados ruins, como má diferenciação e menor viabilidade.

Este protocolo usou o sobrenadante de células L929 como fonte de M-CSF para a diferenciação de células da medula óssea em macrófagos. As células L929 são fibroblastos murinos conhecidos por produzir grandes quantidades de M-CSF¹⁰. Espera-se que os macrófagos sejam expostos a outras substâncias secretadas no sobrenadante L929, juntamente com o M-CSF. O M-CSF purificado comercial também pode ser usado para diferenciação de macrófagos; no entanto, não o comparamos diretamente com o uso do sobrenadante de cultura L929. Também é importante notar que L de Brito Monteiro et al. observaram perfis metabólicos distintos entre macrófagos gerados usando L929 e M-CSF^{comercial 22}.

Este método estabeleceu uma abordagem econômica e que economiza tempo sem o uso de enzimas digestivas. A técnica produziu um isolamento confiável da medula óssea neonatal que resultou em uma clara diferenciação dos BMDMs neonatais. Os BMDMs neonatais isolados podem ser usados para estudar a dinâmica dos macrófagos neonatais durante várias infecções e a regulação da inflamação por essas células. As limitações do método incluem uma curva de aprendizado para o estabelecimento inicial e adaptação ao processo de tração dos pequenos ossos, que eventualmente melhora com a experiência e minimiza a duração do processo com aumento da viabilidade das células. O tamanho da ninhada dos filhotes é uma consideração adicional para o número de macrófagos que podem ser diferenciados dependendo da necessidade experimental.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
40 µ filtro m	Greiner	542040	Cultura de células
96 poços redondos (U) placa inferior	Thermo Scientific	12-565-65	Cultura de células
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	Análise FACS
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	Análise FACS
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	Análise FACS
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Contador de células automatizado
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cultura de células
DMSO	VWR	WN182	Cultura de células
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cultura de células
Escherichia coli O1:K1:H7	Infecção por ATCC	11775
EVOS FL	Sistema de Imagem Celular	Invitrogen	12-563-649
FBS	Avantor	76419-584	Cultura de células
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Meios de cultura sem corantes
Glutamina	Cytiva	SH30034.01	Cultura de células
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cultura de células
L-929	ATCC		Diferenciação
LSRFortessa	Becton Dickinson		Citômetro
de Fluxo Lysotracker vermelho DND 99	Invitrogen	L7528	Corante fluorescente
MEM	Corning	15-010-CV	Cultura de células
Penicilina /estreptomicina	Hyclone	SV30010	Cultura de células
pHrodo verde STP éster	Invitrogen	P35369	Corante fluorescente
T75 frasco	Cell star	658170	Cultura de células
Tripsina-EDTA	Gibco	25300120	Cultura de células
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal