Aprimorando os mapas de densidade removendo a maioria das partículas em pilhas finais de microscopia eletrônica criogênica de partícula única

Summary

Um método avançado de seleção de partículas para crio-EM, ou seja, CryoSieve, melhora a resolução do mapa de densidade removendo a maioria das partículas nas pilhas finais, conforme demonstrado por meio de sua aplicação em um conjunto de dados do mundo real.

Abstract

Na última década, os avanços na tecnologia e na metodologia no campo da análise de partícula única (SPA) de microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM) melhoraram substancialmente nossa capacidade de exame estrutural de alta resolução de macromoléculas biológicas. Esse avanço inaugurou uma nova era de insights moleculares, substituindo a cristalografia de raios-X como o método dominante e fornecendo respostas a questões de longa data na biologia. Como o crio-EM não depende da cristalização, que é uma limitação significativa da cristalografia de raios-X, ele captura partículas de qualidade variável. Consequentemente, a seleção de partículas é crucial, pois a qualidade das partículas selecionadas influencia diretamente na resolução do mapa de densidade reconstruído. Uma abordagem iterativa inovadora para seleção de partículas, denominada CryoSieve, melhora significativamente a qualidade dos mapas de densidade reconstruídos, reduzindo efetivamente o número de partículas na pilha final. Evidências experimentais mostram que este método pode eliminar a maioria das partículas nas pilhas finais, resultando em um aumento notável na qualidade dos mapas de densidade. Este artigo descreve o fluxo de trabalho detalhado dessa abordagem e mostra sua aplicação em um conjunto de dados do mundo real.

Introduction

A análise de partícula única (SPA) por microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM) tornou-se um método dominante para determinar mapas de densidade tridimensional de alta resolução de macromoléculas biológicas. Devido a uma série de inovações tecnológicas 1,2,3,4,5,6, denominada revolução de resolução 7, o crio-EM tem a capacidade de determinar as estruturas de macromoléculas biológicas com resolução atômica a uma taxa sem precedentes. Essa descoberta marca o início de uma nova era nos insights moleculares, ultrapassando a cristalografia de raios-X como a técnica predominante e respondendo a questões biológicas de longa data.

O Cryo-EM SPA diverge da cristalografia de raios-X por não exigir a cristalização de macromoléculas biológicas. Em vez disso, uma solução contendo as macromoléculas biológicas alvo é rapidamente congelada em gelo vítreo. Em seguida, é fotografado com um feixe de elétrons para produzir uma série de micrografias, ignorando a necessidade de cristalização⁸. Posteriormente, algoritmos de seleção de partículas são utilizados para extrair partículas brutas individuais dessas micrografias 4,9,10,11,12. Como o crio-EM não depende da cristalização, é natural que as partículas extraídas sejam predominantemente danificadas ou em estados conformacionais indesejados, necessitando de várias rodadas de seleção de partículas para obter um mapa de densidade de alta resolução. No processamento de imagens crio-EM SPA, a seleção de partículas é, portanto, crucial para a obtenção de mapas de densidade de alta resolução¹³.

No SPA crio-EM, os métodos padrão de seleção de partículas incluem classificação bidimensional (2D) e tridimensional (3D)¹⁴. A classificação 2D categoriza as partículas em um número predefinido de grupos, produzindo uma imagem média e uma resolução 2D estimada para cada classe. Os pesquisadores podem então inspecionar visualmente essas classes, removendo partículas de grupos de resolução mais baixa para usar as restantes em reconstruções destinadas a alcançar uma resolução mais alta. Uma vez que as poses das partículas são estabelecidas usando algoritmos de refinamento, os pesquisadores prosseguirão com a classificação 3D, agrupando as partículas em várias classes. Isso permite a inspeção visual do mapa de densidade reconstruído para cada classe, permitindo a exclusão de partículas indesejáveis, como aquelas de conformações indesejadas. Após várias rodadas de classificação, uma pilha final composta por partículas de qualidade relativamente alta é obtida. Essas pilhas finais são fundamentais na produção de mapas de densidade de resolução atômica ou quase atômica.

Zhu e seus colegas demonstraram que uma seleção adicional de partículas pode ser realizada nessas pilhas finais¹⁵. O CryoSieve¹⁵, um método iterativo inovador para seleção de partículas, pode ser aplicado para melhorar a qualidade do mapa de densidade final, reduzindo significativamente o número de partículas. Embora outros critérios e softwares de classificação de partículas, como o método de correlação cruzada normalizada (NCC)¹⁶, a abordagem de consistência de gráfico angular (AGC)¹⁷ e a classificação de não alinhamento⁵, estejam atualmente em uso no campo, esse método demonstrou superar esses algoritmos em termos de eficácia.

Neste estudo, apresentamos um guia detalhado de todo o processo. Como estudo de caso, aplicamos esse novo método ao conjunto de dados do trímero de hemaglutinina da influenza (entrada EMPIAR: 10097)¹⁸, que inclui 130.000 partículas em sua pilha final. Nosso procedimento descartou com sucesso cerca de 73,8% das partículas da pilha final deste conjunto de dados, melhorando a resolução do mapa de densidade reconstruído de 4,11 Å para 3,62 Å. Além do trímero de hemaglutinina da gripe, os resultados de vários conjuntos de dados são apresentados em publicações anteriores¹⁵, mostrando uma variedade de resoluções e pesos moleculares de biomoléculas.

Protocol

1. Instalação

1. Verificar e configurar o ambiente de aceleração de GPU
   1. Abra o terminal e digite o comando: nvidia-smi. Certifique-se de que o comando exiba com êxito todas as informações sobre a(s) placa(s) GPU(s) e que a versão CUDA seja superior a 10.2. Execute o comando: conda -V para verificar se o Conda está instalado (Figura Suplementar 1).
2. Configurar ambiente virtual
   1. Insira o seguinte comando para configurar o ambiente virtual, substituindo CRYOSIEVE_ENV pelo nome do ambiente desejado: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Aguarde alguns minutos até que o ambiente seja configurado com êxito (Figura Suplementar 2).
      NOTA: Os usuários têm a flexibilidade de modificar o nome do ambiente conforme necessário. O comando fornecido é específico para CUDA 10.2. Se uma versão diferente do CUDA for desejada, ajuste o número da versão do cudatoolkit.
3. Instale o CryoSieve
   1. Ative o ambiente executando o comando: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Instale o software executando: pip install cryosieve ou conda install -c mxhulab cryosieve (Figura Suplementar 3). Digite cryosieve -h e certifique-se de que as informações de ajuda sejam exibidas corretamente (Figura Suplementar 4).

2. Peneiramento de partículas

1. Recuperar os dados
   1. Faça o download do conjunto de dados da pilha final do EMPIAR-10097 do EMPIAR (consulte a Tabela de Materiais). Baixe o arquivo em estrela, o arquivo de máscara (mask.mrc) e o modelo inicial (para a etapa de reestimativa; initial.mrc) do Github (consulte Tabela de materiais). Coloque todos esses arquivos em uma pasta juntos (Figura Suplementar 5).
      NOTA: O repositório em https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos utiliza o Git Large File Storage (Git LFS). A instalação do Git LFS é essencial para clonar todo o repositório. Como alternativa, acesse o arquivo por meio do link do GitHub e clique no botão Baixar arquivo bruto para baixar um arquivo individual.
2. Peneiramento de partículas de processo
   1. Abra o terminal e use o comando: cd FILEPATH para navegar até a pasta onde o conjunto de dados está localizado. Ative o ambiente Conda por: conda ative CRYOSIEVE_ENV.
   2. Digite o seguinte comando para iniciar nosso experimento de peneiramento de partículas: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (Figura Suplementar 5). Durante a execução, o terminal exibirá os logs de saída para cada iteração.
      NOTA: Instruções detalhadas para cada opção podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1. O tempo de processamento e os requisitos mínimos para execução são detalhados no Arquivo Suplementar 2. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star foi refinado pelo CryoSPARC a partir do T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (baixado do EMPIAR) para mitigar os efeitos provocados pelos avanços nas técnicas de estimativa de orientação.

3. Encontrando a iteração ideal

1. Verifique as resoluções
   1. Use o comando: grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt para imprimir os resultados da resolução para as 10 iterações de peneiramento (Figura 1). Como a pilha de partículas filtrada na^7ª iteração tem a resolução mais alta com o menor número de partículas, é provável que forneça o resultado ideal.
      NOTA: Para evitar a transferência não intencional de informações de partículas descartadas para retidas¹⁵ e para garantir que a pilha de partículas posta a 7ª iteração seja realmente ideal, os usuários devem executar uma etapa de reestimativa para iterações próximas. Neste protocolo, as iterações 4, 5, 6, 7 e 8 estão sujeitas a verificação.
2. Importar partículas peneiradas
   1. Abra o CryoSPARC web interface e siga estas etapas: Entre em um espaço de trabalho e clique no botão Construtor no canto superior direito do painel. No painel, selecione e clique na opção Importar pilha de partículas . Na seção Parâmetros do painel Importação de pilha de partículas, especifique o metacaminho de partícula como o arquivo _iter{n}.star localizado na pasta de saída dos resultados concluídos e o caminho de dados de partícula para a pasta onde o arquivo mrcs está armazenado. Clique no botão Queue Job e, em seguida, clique no botão Queue para iniciar o processo. Use a mesma maneira para importar as iterações restantes que precisam de reestimativa (Figura Suplementar 6A).
3. Importar modelo inicial
   1. Clique no botão Construtor no canto superior direito do painel. No painel, selecione e clique na opção Importar volumes 3D .
   2. Especifique o caminho de dados do Volume como o arquivo initial.mrc. Clique no botão Queue Job e, em seguida, clique no botão Queue para iniciar o processo (Figura Suplementar 6B).
      NOTA: O modelo inicial também pode ser gerado por meio de reconstrução ab initio (Arquivo Suplementar 3).
4. Refinamento homogêneo (trabalho de compilação)
   1. Clique no botão Construtor no canto superior direito do painel. No painel, selecione e clique na opção Refinamento homogêneo .
      NOTA: O refinamento não uniforme também é aplicável.
5. Refinamento homogêneo (partículas de importação)
   1. No painel principal à esquerda, abra o trabalho para importar a pilha de partículas da^5ª iteração (ou a iteração desejada). Arraste o módulo de partículas importadas do lado direito do painel principal e solte-o na seção Pilhas de partículas do Construtor à direita. Feche o trabalho Importar pilha de partículas clicando no X vermelho no canto superior direito do painel principal.
   2. Abra o trabalho para importar volumes 3D. Arraste o módulo de volumes importados do lado direito do painel principal e solte-o na seção Volume inicial do Builder à direita.
6. Refinamento homogêneo (modifique os parâmetros)
   1. Na dobra Parâmetros, localize a opção Simetria e defina-a como C3. Encontre a opção Forçar refazer a divisão GS e desative-a. Clique no botão Trabalho de Fila e, em seguida, clique no botão Fila para iniciar o Refinamento Homogêneo. Execute o Refinamento Homogêneo para as iterações restantes usando o mesmo método (Figura Suplementar 6C-D).
      NOTA: A opção Forçar refazer a divisão GS é crítica. Desativar esta opção garante que o CryoSPARC retenha a divisão padrão-ouro fornecida pelo arquivo em estrela, evitando o sobreajuste. Uma justificativa detalhada para desabilitar o Force Re-do GS Split pode ser encontrada no Arquivo Suplementar 4.
7. Aguarde até que todos os trabalhos terminem de ser executados para obter os resultados. Com base nos resultados, confirma-se que a pilha de partículas filtrada na^6ª iteração é o resultado ideal real.
   NOTA: É normal que os resultados obtidos tenham pequenos desvios aleatórios em relação aos resultados fornecidos neste protocolo. Esses desvios não afetam a conclusão geral.

Results

Neste protocolo, utilizamos o conjunto de dados do trímero de hemaglutinina da influenza (entrada EMPIAR: 10097) como demonstração da eficácia desse processo. Devido à orientação preferida da amostra, a aquisição de dados exigiu inclinação a 40°. A proteína exibe simetria C3 e tem um peso molecular de 150 kDa.

Implementamos o protocolo descrito anteriormente para processar a pilha de partículas final. Ele removeu progressivamente 20% das partículas em cada iteração, resultando em uma taxa de retenção de 80,0%, 64,0%, 51,2% e assim por diante. Conforme ilustrado na Figura 1 e na Figura 2, a resolução das partículas retidas inicialmente melhorou, mas acabou diminuindo. Entre as iterações, a^6ª iteração foi identificada como o subconjunto mais ideal, contendo o menor número de partículas, mas alcançando a resolução mais alta. Nosso algoritmo identificou com sucesso um subconjunto de partículas compreendendo apenas 26,2% da pilha original, resultando em uma resolução aprimorada de 4,19 Å para 3,62 Å (reestimada pelo CryoSPARC), mostrada na Figura 2. Além disso, os mapas de densidade antes e depois do uso do CryoSieve foram comparados na Figura 3. A curva de correlação de Fourier Shell (FSC) do modelo para o mapa e a curva FSC de meio mapa dos mapas de densidade reconstruídos antes e depois do método também são mostradas (Figura 3A-B). Mapas de densidade bruta e mapas de densidade nítida obtidos também foram comparados, com o nível de contorno equivalente aplicado (Figura 3C). As cadeias laterais dos mapas de densidade nítida foram comparadas, mostrando o aprimoramento dos mapas de densidade reconstruídos. O fator B de Rosenthal-Henderson estimado também foi adotado para os critérios de qualidade de partícula¹⁹. Depois de remover a maioria das partículas na pilha final, o fator B de Rosenthal-Henderson aumentou de 226,9 Ų para 146,2 Ų (Figura 3D). Resolução local, fator B local²⁰ e ResLog²¹ também foram utilizados para comparação, indicando que o CryoSieve realmente melhora a qualidade dos mapas de densidade e das partículas (Figura 4). 

Figura 1: Resoluções de cada iteração. As resoluções que foram relatadas são destacadas em caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resoluções de cada iteração. As resoluções identificadas por trabalhos de refinamento homogêneos são destacadas em caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Mapas de densidade. (A) Comparação da curva FSC modelo para mapa de mapas de densidade reconstruídos antes e depois de usar o CryoSieve. O eixo y representa o FSC, enquanto o eixo x representa a resolução. A linha tracejada vermelha marca o limite de 0,5 para o FSC. A linha tracejada vertical ilustra a resolução dos mapas de densidade obtidos abaixo de um limite de 0,5. (B) A curva FSC de semimapas foi obtida a partir de mapas de densidade reconstruídos antes e depois do uso do CryoSieve via CryoSPARC. O eixo y representa o FSC, enquanto o eixo x representa a resolução. (C) Mapas de densidade bruta e mapas de densidade nítida foram mostrados tanto para as partículas retidas no CryoSieve quanto para o conjunto completo de partículas nas pilhas finais. O nível de contorno equivalente de 0,65 foi aplicado para mapas de densidade bruta. O nível de contorno equivalente de 0,84 foi aplicado para mapas de densidade nítida. Mapas de densidade nítida foram obtidos diretamente pelo CryoSPARC. Os mapas de densidade nítida foram pós-processados automaticamente, primeiro ponderados pelo FSC (com base nos FSCs fornecidos pelo CryoSPARC). Em seguida, o fator B foi afiado usando os fatores B autodeterminados (232,0 Ų para todas as partículas na pilha final e 160,8 Ų para CryoSieve). As cadeias laterais nos mapas de densidade nítida foram comparadas, incorporando modelos atômicos como referência. As setas vermelhas destacam as regiões melhoradas. (D) O fator B de Rosenthal-Henderson estimado foi mostrado tanto para as partículas retidas em CryoSieve quanto para o conjunto completo de partículas nas pilhas finais. O eixo y representa o número de partículas usadas e o eixo x representa o recíproco do quadrado da resolução. Movendo-se de cima para baixo, cada ponto representa metade das partículas do anterior. As resoluções foram determinadas pelo refinamento. Os fatores B foram determinados usando uma aproximação de mínimos quadrados dos pontos medidos, conforme mostrado pelas curvas de ajuste. Os fatores B estimados de Rosenthal e Henderson são indicados nas legendas: laranja representa partículas retidas por CryoSieve, enquanto azul denota todas as partículas na pilha final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de várias métricas de mapas de densidade. (A) Comparação de mapas de resolução local antes e depois de usar o CryoSieve obtido pelo CryoSPARC. A resolução local varia entre 7 Å (vermelho) e 3,5 Å (azul). (B) Comparação de mapas de densidade antes e depois de usar o CryoSieve, colorido com o mapa de fator B local obtido pelo LocBFactor usando uma faixa de resolução de [20-3,5] Å. (C), Comparação de gráficos ResLog antes e depois de usar o CryoSieve obtido pelo CryoSPARC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Usando os comandos nvidia-smi e conda -V para verificar os pré-requisitos. Se os pré-requisitos forem atendidos, digitar o comando nvidia-smi exibirá a versão do driver da GPU, a versão do CUDA e o status das placas de GPU. Da mesma forma, inserir o comando conda -V deve exibir corretamente a versão instalada do Conda. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: O processo de criação de novos ambientes de aceleração de GPU. A tela exibe a saída gerada pelo comando usado para criar o ambiente Conda. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Instalação do CryoSieve no ambiente de aceleração da GPU. Após ativar o ambiente Conda recém-criado, a tela exibe a saída resultante da execução do comando para instalar o CryoSieve usando o Pip. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: Informações de ajuda. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Processo em execução. Ao executar o CryoSieve através da linha de comando, a tela exibe informações sobre o processo em execução. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 6: A configuração dos trabalhos do CryoSPARC. (A) Importar pilha de partículas. (B) Importar volumes 3D. (CD) Refinamento homogêneo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Opções de CryoSieve. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Tempo de processamento e requisito mínimo para executar o Cryosieve. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Geração do modelo inicial pelo CryoSPARC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Justificativa para desabilitar a divisão GS forçada de refazer. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Opções de criosieve-csrefine. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Opções de criosieve-csrhbfactor. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Cryo-EM é uma técnica fundamental para elucidar as estruturas de moléculas biológicas. Nesse processo, após a coleta de dados via microscopia, a extração de partículas das micrografias é essencial, seguida de sua classificação em várias etapas para compilar a pilha final. Um desafio comum é a predominância de partículas danificadas ou indesejavelmente conformadas, ressaltando a necessidade de seleção repetida de partículas para obter mapas de densidade de alta resolução. Isso torna a seleção de partículas uma etapa crítica no SPA crio-EM para obter mapas de densidade de alta qualidade. As técnicas de seleção de partículas existentes incluem o algoritmo de validação estatística sem inclinação²², a abordagem baseada em pontuação z²³ e o método de estimativa de precisão angular²⁴.

O CryoSieve surge como uma ferramenta valiosa neste contexto, adepta da eliminação de um número significativo de partículas estranhas da pilha final. Essa redução não apenas aumenta a eficiência computacional da reconstrução, mas também agiliza o processo. Ele oferece um conjunto abrangente para seleção de partículas, onde a extensão do descarte de partículas e a consequente melhoria na resolução dependem em grande parte da qualidade inicial dos dados e das metodologias empregadas no processamento de dados.

Neste manuscrito, apresentamos um fluxo de trabalho completo de peneiramento de partículas usando o conjunto de dados de casos reais de trímero de hemaglutinina influenza (entrada EMPIAR: 10097). As etapas abordadas e discutidas aqui podem ser resumidas como peneiramento de partículas e reestimativa de pose. O volume final reconstruído em 3D alcançou uma resolução de 3,62 Å, e as cadeias laterais em alfa-hélices foram mais claras no volume pós-processado em comparação com o mapa de densidade publicado.

CryoSieve é um método de código aberto que está disponível no GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve). Um tutorial detalhado também pode ser encontrado em sua página inicial. Os usuários podem instalá-lo e usá-lo seguindo o tutorial. Além disso, dois módulos, cryosieve-csrefine e cryosieve-csrhbfactor, são fornecidos. O módulo cryosieve-csrefine foi criado especificamente para automatizar a execução sequencial de várias operações no CryoSPARC (Arquivo Suplementar 5). Essas operações incluem a importação de pilhas de partículas e a realização de trabalhos de refinamento ab initio, homogêneo ou não uniforme. Por outro lado, o módulo cryosieve-csrhbfactor foi projetado para automatizar a determinação do fator B de Rosenthal-Henderson, aproveitando os recursos do cryosieve-csrefine (Arquivo Suplementar 6).

Atualmente, a aplicação deste método está confinada a cenários de conformação única. Consequentemente, nos casos em que as partículas representam múltiplas conformações, suas capacidades são limitadas. Os usuários são aconselhados a se envolver inicialmente na classificação 3D para segregar partículas de conformações díspares antes de empregá-la para seleção de partículas refinadas. Além disso, embora o método demonstre proficiência na filtragem de mais de 50% das partículas da pilha final, as origens dessas partículas descartadas e as razões subjacentes para sua contribuição insignificante para a qualidade da reconstrução permanecem obscuras. Essa lacuna na compreensão requer pesquisas adicionais para abordar de forma abrangente e potencialmente corrigir essa limitação.

Existem três métodos possíveis de classificação de partículas ou peneiramento de partículas. Em primeiro lugar, o cisTEM⁴ pode relatar uma pontuação para cada imagem de partícula após o refinamento 3D. Os usuários podem classificar as partículas usando a pontuação cisTEM para descartar partículas. A abordagem de consistência de grafo angular (AGC)¹⁷ também é um método para descartar partículas desalinhadas. Além disso, a classificação de não alinhamento⁵ é uma maneira tradicional de descartar partículas usando a classificação 3D. Comparamos a qualidade das partículas retidas por esses métodos com o CryoSieve e descobrimos que as partículas retidas do CryoSieve são de maior qualidade¹⁵. O método apresentado aqui supera significativamente os métodos alternativos e atinge o menor número de partículas na mesma resolução.

Conforme demonstrado no resultado, a maioria das partículas em uma pilha final de crio-EM não contribui para a reconstrução do mapa de densidade. Em outras palavras, entre todas as partículas coletadas durante a aquisição da imagem, apenas algumas poucas, ou seja, o subconjunto mais fino, realmente contribuem para a reconstrução final. Consequentemente, a razão entre esse subconjunto final e o número total de partículas coletadas pode servir como uma métrica quantitativa para avaliar a qualidade da amostra. Quanto maior essa proporção, melhor a qualidade da amostra. Apesar dos avanços técnicos que tornaram o cryo-EM mais acessível aos biólogos estruturais, a preparação de amostras continua sendo um grande gargalo no fluxo de trabalho. Cientistas e engenheiros estão, portanto, concentrando seus esforços nesse desafio²⁵. Na análise de partícula única (SPA), a preparação da amostra consiste em duas etapas cruciais: otimização da amostra e preparação da grade. O primeiro envolve a purificação do espécime, mantendo seu estado bioquímico ideal. Este último envolve a preparação da amostra para análise no microscópio, incluindo tratamento químico ou de plasma da grade, deposição de amostras e vitrificação. Inúmeras técnicas foram propostas para lidar com a instabilidade macromolecular, mas a eficácia de uma abordagem em relação a outra depende das características da amostra^25,26. Atualmente, os resultados da preparação da grade são fortemente influenciados pelo conhecimento e experiência do usuário, o que pode tornar o processo demorado e desafiador^27,28. As inúmeras variáveis encontradas na preparação da amostra e da grade representam desafios no estabelecimento de relações de causa e efeito, pois os pesquisadores só podem avaliar a amostra em nível molecular usando o microscópio. Como resultado, ainda faltam estatísticas quantitativas a partir de comparações de diferentes protocolos de preparação de amostras e grades, sendo necessária uma abordagem sistemática para investigar tendências e compreender os mecanismos fundamentais do comportamento da amostra²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc. Toronto, Canadá		CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) é uma solução de software HPC de última geração para processamento completo de dados de microscopia crioeletrônica de partícula única (cryo-EM). O CryoSPARC é útil para resolver estruturas crio-EM de proteínas de membrana, vírus, complexos, moléculas flexíveis, pequenas partículas, dados de placa de fase e dados de coloração negativa.
Conjunto de dados EMPIAR-10097	https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs	Este conjunto de dados compreende dados crio-EM de partícula única do trímero de hemaglutinina Influenza, caracterizado por sua orientação altamente preferida, coletados usando uma estratégia de coleta inclinada a 40 graus.
initial.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION		4.0-beta-2	RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN) é um software de código aberto para processamento de dados de microscopia crioeletrônica (cryo-EM), particularmente para refinar macromoleculares Estruturas. Utilizando uma abordagem bayesiana, ele se destaca na separação do sinal do ruído, permitindo a determinação da estrutura de alta resolução. O RELION suporta análise de partícula única, tomografia e média de subtomograma e tornou-se amplamente utilizado em biologia estrutural devido à sua eficácia e interface amigável.
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097	Arquivo de metadados para a pilha final de partículas do EMPIAR-10097