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Aplicações da Espectrometria de Massa em Tandem por Cromatografia Líquida na Pesquisa de Produtos Naturais: Alcalóides Tropânicos como Estudo de Caso

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DOI:

10.3791/66620

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8 de março de 2024

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1Department of Chemistry, Northern Michigan University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método para anotação e classificação rápida baseada em espectrometria de massa (MS) / espectrometria de massa (MS) de alcalóides tropanos, útil tanto para a desreplicação preliminar de amostras contendo tropano quanto para a descoberta de novos alcalóides para isolamento.

Resumo

Embora muitos medicamentos utilizados hoje sejam de origem sintética, os produtos naturais ainda fornecem uma rica fonte de nova diversidade química e bioatividade e podem produzir pistas promissoras para doenças resistentes ou emergentes. O desafio, no entanto, é duplo: não apenas os pesquisadores devem encontrar produtos naturais e elucidar suas estruturas, mas também identificar o que vale a pena isolar e testar (e o que já é conhecido - um processo conhecido como desreplicação). Com o advento da instrumentação analítica moderna, o ritmo de descoberta e desreplicação de produtos naturais acelerou. A cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) tornou-se uma técnica especialmente valiosa para identificar e classificar estruturas químicas. Os alcalóides do tropano (TAs) são compostos derivados de plantas de grande importância medicinal e toxicológica. Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de triagem baseado em LC-MS/MS utilizando as múltiplas configurações de MS/MS disponíveis em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo (QQQ) para anotar e classificar estruturas de TA com base em seus padrões de fragmentação distintos. Usando uma combinação de varreduras de íons de produto dependentes de dados (DD), varreduras de íons precursores (PrIS) e varreduras de perda neutra (NLS), aplicamos esse método a extratos ricos em TA das solanáceas Datura stramonium e Datura metel. Este método é rápido, sensível e foi empregado com sucesso tanto para a desreplicação preliminar de amostras complexas contendo TA quanto para a descoberta de um novo candidato para isolamento, purificação (e eventual bioensaio).

Introdução

Embora as moléculas totalmente sintéticas tenham se tornado mais proeminentes na descoberta de medicamentos nas últimas décadas, quase dois terços de todos os medicamentos aprovados nos últimos 39 anos são produtos naturais ou inspirados em produtos naturais,1,2  ressaltando a importância contínua da pesquisa de produtos naturais. Os alcalóides, certos produtos naturais que contêm nitrogênio, são especialmente valorizados por suas propriedades medicinais. Os alcaloides do tropano (TA) que contêm o [3.2.1.]-sistema bicíclico contendo nitrogênio, são produzidos principalmente por plantas das famílias Solanaceae (beladona), Erythroxylaceae e Convolvulaceae. Exemplos incluem atropina, escopolamina e cocaína; Múltiplos tropanos semi-sintéticos ou sintéticos também são usados clinicamente3. Os ATs e seus derivados são usados para tratar muitas condições 3,4 e vários desses medicamentos aparecem na Lista de Medicamentos Essenciais de 2023 da OMS5. Devido às suas atividades potentes, os ATs também são usados para fins recreativos (como estimulantes ou delirantes) e podem causar intoxicação ao ingerir plantas (ou preparações) que os contenham 6,7. Os ATs são indesejáveis na alimentação humana e animal8 e podem contaminar chás, especiarias, grãos, mel e suplementos de ervas 9,10. Por causa de sua promessa medicinal e capacidade de envenenar, métodos analíticos que podem ajudar na descoberta de novos ATs (e identificação de ATs conhecidos) são úteis.

Na espectrometria de massa em tandem (MS/MS), "filtros de massa" (por exemplo, quadrupolos, tubos de tempo de voo) são acoplados fisicamente ("no espaço"), ou um instrumento emprega etapas adicionais de reação/separação "no tempo". O MS/MS no espaço usa modos diferentes para selecionar e fragmentar diferentes íons nos diferentes filtros de massa (por exemplo, os quadrupolos de um instrumento triplo-quadrupolo ou QQQ). Esses diferentes modos podem ser usados para determinar quais fragmentos específicos são feitos por um determinado íon (varredura de íons de produto), quais íons em uma amostra produzem certos fragmentos (varredura de íons precursores ou PrIS) ou sofrem perdas de uma massa característica (varredura de perda neutra ou NLS), ou quais compostos específicos possuem quais fragmentos específicos (monitoramento de reações múltiplas). MS/MS, portanto, fornece fragmentos que são úteis para propor estruturas para novos compostos ou confirmar a presença de um composto existente. MS / MS é cada vez mais usado nos campos de descoberta de medicamentos, química de produtos naturais e metabolômica11 , 12 , e tem sido usado para traçar perfis de espécies contendo alcalóides (para caracterização fitoquímica ou análise quimiotaxonômica) e para detectar e quantificar alcalóides específicos em alimentos ou plantas medicinais10 , 13 , 14 , 15 , 16 .

Apesar das muitas técnicas de espectrometria de massa disponíveis, existem desafios para encontrar novos alcalóides. Além de encontrar um organismo candidato para triagem, uma confirmação estrutural completa de um alcalóide é um processo árduo que pode incluir muitas técnicas analíticas diferentes. Além disso, os pesquisadores poderiam isolar um composto que já é conhecido, desperdiçando trabalho, tempo e recursos. Isso é especialmente difícil para os ATs, onde centenas, senão milhares de ATs, muitos dos quais são isoméricos entre si, são relatados. O processo de "identificar os conhecidos e distingui-los dos desconhecidos" é conhecido como desreplicação. Bancos de dados dos tempos de retenção (r.t.s) e fragmentos de massa de diferentes ATs e outros compostos são publicados para auxiliar nesse processo 17,18. No entanto, a desreplicação é trabalhosa; apenas anotar (ou seja, atribuir estruturas putativas) aos alcalóides em todo o cromatograma LC-MS/MS de uma amostra é demorado. Recentemente, tanto a rede molecular1 9,20 quanto a replicação manual18,21,22 foram usadas para alcalóides benzilisoquinolina, monoterpeno indol e tropano, e PrISs foram usados para "filtragem estrutural" de espectros para identificar alcalóides do tipo pirrolizidina e solanina23,24. No entanto, não há métodos ou fluxos de trabalho específicos disponíveis para a desreplicação rápida baseada em LC-MS/MS de amostras contendo TA, embora os TAs possuam fragmentos comuns e facilmente identificáveis (Figura 1). O método descrito aqui usa uma combinação de varreduras de íons de produto dependentes de dados (DD), PrISs e NLSs para anotar e classificar estruturas de TA em plantas com base nos padrões de fragmentação distintos para tropanos mono, di e trissubstituídos (Figura 1A) e nas perdas de grupos de ésteres comuns encontrados nesses alcalóides (Figura 1B). Os organismos de estudo são várias espécies do gênero Datura. Uma rica fonte de diversos ATs, Datura tem sido usado ao longo da história do mundo para fins medicinais e culturais17- e é uma matriz desafiadora para se replicar por causa de seus numerosos ATs estruturalmente semelhantes, fornecendo-nos amostras atraentes para testar nosso método.

Protocolo

CUIDADO: Consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar os produtos químicos listados.

1. Preparação da amostra

CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas. Use luvas criogênicas e proteção para os olhos em uma área bem ventilada. Amostras de plantas contendo alcalóides podem ser irritantes para a pele; Sempre manuseie-os com luvas. O metanol é tóxico e inflamável e deve ser manuseado em uma capela de exaustão longe de possíveis fontes de ignição.

NOTA: Em teoria, podem ser utilizados tecidos vegetais cultivados ou silvestres (secos ou moídos frescos); O procedimento abaixo é exatamente aquele utilizado durante o desenvolvimento do método.

  1. Se o tecido vegetal de interesse for fresco, congele-o colocando-o em um tubo cônico de polipropileno e imergindo-o em nitrogênio líquido por 2-3 min.
  2. Coloque o tecido vegetal congelado em um almofariz pré-resfriado (em um refrigerador de poliestireno com nitrogênio líquido) e, usando um pilão pré-resfriado, triture o tecido até obter um pó uniforme.
  3. Pese rapidamente a quantidade desejada de tecido em um tubo de microcentrífuga de polipropileno usando uma espátula pré-resfriada e adicione imediatamente 20% de metanol (à temperatura ambiente [RT]) a uma concentração de 1 mL por cada 100 mg de tecido.
    NOTA: O metanol (20%) é comumente usado para extrair TAs25. Ocasionalmente, é adicionado ácido fórmico a 0,1%, embora nenhuma diferença na eficiência de extração tenha sido observada durante o desenvolvimento deste método e de outros.
  4. Coloque os tubos tampados em um agitador de balanço (velocidade média) por um mínimo de 3 h em RT.
  5. Centrifugue os tubos a 9464 x g por 10 min. Pipetar o sobrenadante para um frasco para injetáveis de amostrador automático LC-MS ou, se ainda estiver turvo, filtrar primeiro através de um filtro de seringa de 0,45 μm.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, embora amostras e extratos de plantas frescas processadas devam ser armazenados em um freezer a -80 ° C antes da análise para evitar qualquer degradação potencial de alcalóides.

2. Configuração do instrumento LC-MS e coleta de dados

CUIDADO: A acetonitrila é tóxica e inflamável; Mantenha-se afastado de fontes de ignição e controle os vapores usando uma hotte. O ácido fórmico é corrosivo; Evite o contato com a pele e os olhos e use equipamento de proteção individual adequado.

  1. Use um instrumento LC-MS com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) e uma coluna de HPLC de fase reversa (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Para HPLC, use ácido fórmico a 0,1% em H2O como solvente A e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila como solvente B; equilibre a coluna com 99% A e 1% B. Configure um gradiente de 30 min de 1%-50% B ao longo de 26 min, retornando a 1% B em 26,01 min e mantendo em 1% B por 4 min. Use uma temperatura de forno de coluna de 45 °C e uma vazão de 0.5 mL/min.
  3. No método LC-MS, use os seguintes parâmetros operacionais para o espectrômetro de massa: tensão de interface: 4,0 kV, fluxo de gás de nebulização: 3 L/min, fluxo de gás de aquecimento: 10 L/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura do bloco de calor: 400 °C, temperatura de interface: 300 °C, fluxo de gás de secagem: 10 L/min e pressão de gás (argônio) de dissociação induzida por colisão (CID) de 17 kPa.
  4. Crie um método MS no modo positivo ESI que inclua uma varredura Q3 e uma varredura Q1 (100-1000 Da) que funcione como um evento de pesquisa (definido para o comprimento do método LC), com exclusão automática de isótopos habilitada. Inclua uma varredura de íons de produto como um evento dependente da varredura Q1 (análise DD), com uma janela de massa de 50-1000 Da, uma energia de célula de colisão de -20 V e um tempo de evento de <0,2 s.
    NOTA: O limite de contagem para acionar a varredura de íons do produto DD do Q1 pode ser variável, mas normalmente, um nível de 7.000 a 10.000 contagens é usado. Em alguns instrumentos, como o usado para desenvolver o método, a varredura Q3 fornece maior precisão e sensibilidade de massa do que Q1 e é incluída para confirmar os íons observados na varredura Q1, embora possa ser omitida da etapa 2.4 sem problemas.
  5. Ao método MS acima, adicione PrISs de modo positivo igual ao comprimento do método LC com energias de célula de colisão de -20 V e tempos de evento de 0,75 s. Certifique-se de que, em todos os casos, as funções de exclusão automática de isótopos ou desisótopos estejam ativadas. Assegurar que os valores m/z de interesse para os fragmentos de AT (em Da, ver figura 1A) são 124,1 (para os AT monossubstituídos, janela de massa de 125-1000 Da), 122,1 e 140,1 (para os AT dissubstituídos, janelas de massa com início em 123 e 141 Da, respectivamente) e 156,1 e 138,1 (para os ATs trissubstituídos, janelas de massa com início em 157 e 139 Da, respectivamente).
    NOTA: Durante o desenvolvimento do método, os PrIS foram divididos em dois métodos diferentes, um para ATs mono e dissubstituídos e outro para ATs trisubstituídos, embora possam ser divididos ou combinados de qualquer maneira.
  6. Crie um segundo método MS que inclua os parâmetros na etapa 2.4.
    1. A esse método MS / MS, adicione NLS de modo positivo igual ao comprimento do método LC, com energias de célula de colisão de -20 V e tempos de evento de 0,75 s. Certifique-se de que, em todos os casos, as funções de exclusão ou desisótopo automático de isótopos estejam ativadas.
    2. Certifique-se de que as massas de perda neutra de interesse para ésteres em TAs (em Da, ver Figura 1B) são 100,05 (para ésteres derivados de ácido tiglic, janela de massa de 110-1000 Da), 60,03 (para grupos acetil, janela de massa de 100-1000 Da) e 166,06 (ésteres fenillácticos ou de ácido trópico, janela de massa de 170-1000 Da).
  7. Baixe o método LC-MS e crie arquivos de dados para as amostras de interesse. Uma vez que a coluna de HPLC esteja equilibrada a 45 °C, executar as amostras de interesse num lote ou ficheiro de projecto com os brancos de solvente de extracção adequados entre diferentes espécies ou tipos de tecidos. Um volume de injeção típico é de 10-20 μL.
    NOTA: Em volumes especialmente altos, o detector do espectrômetro de massa pode estar saturado. Se estiver executando amostras muito concentradas, certifique-se de que a fonte ESI esteja limpa e o instrumento esteja afinado regularmente. O protocolo pode ser pausado aqui depois que todos os dados forem coletados.

3. Análise dos dados

  1. Examine o cromatograma de íons total das varreduras Q1 e Q3 (e a varredura de íons do produto DD) e observe a massa original de quaisquer íons abundantes que tenham características semelhantes a TA: a) massa <500 Da para o íon [M + H] + , geralmente uma massa par, b) rts típicos entre 2-22 min usando o método LC acima e c) fragmentos da seguinte lista: m / z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 ou 128 Da.
  2. Examine o cromatograma / canal PrIS para m / z 124 e observe quais picos / íons estão em que rts (registrados na etapa 3.1) produzem esse fragmento. Clique em varredura por varredura através do cromatograma, bem como examine os espectros completos de MS / MS obtidos na varredura de íons do produto DD, especialmente para espécies de menor abundância.
    NOTA: Uma espécie verdadeira contendo este fragmento existirá para várias varreduras e aparecerá nas varreduras Q1 e Q3 (se a última for usada). Uma planilha é anexada nas Informações de Suporte (Arquivo Suplementar 1) para auxiliar nas anotações.
  3. Repita a etapa 3.2 com os outros cromatogramas PrIS. Como m / z 122 e 140 são indicativos de TAs dissubstituídos e m / z 138 e 156 são indicativos de TAs trissubstituídos, examine esses cromatogramas / canais juntos.
  4. Examine o cromatograma / canais NLS para m / z 100, 60 e 166 e observe quais picos / íons nos quais rts (registrados na etapa 3.1) produzem essas perdas neutras. Tal como acontece com o PrIS, clique em varredura por varredura através do cromatograma e compare com a fragmentação obtida na varredura de íons do produto DD, especialmente para espécies de menor abundância.
  5. Usando a combinação de dados PrIS e NLS, apoiados pelos resultados da varredura de íons do produto DD, faça anotações putativas dos alcalóides observados adicionando a menor massa de tropano (por exemplo, 124, 122 ou 138) e a perda neutra e, em seguida, contabilizando a massa restante restante.
    NOTA: Os grupos típicos que substituem os ATs (e suas massas em Da) são hidroxila (18), acetil (60), propionil (74), isobutilil (88), tigloil (100), tigloil saturado / 2-metilbutiril (102) ou fenillactato / ácido trópico (166).
  6. Compare as anotações de alcalóides com as relatadas na literatura17 e bancos de dados (por exemplo, MoNA) 26 para determinar quais padrões de substituição de TA são relatados (e quais são potencialmente novos). Além disso, use padrões de alguns alcalóides tropanos comuns (por exemplo, atropina, littorina, escopolamina) que estão disponíveis comercialmente para confirmação.
  7. Para obter informações estruturais adicionais para amostras de baixa abundância (o PrIS e o NLS podem captar íons abaixo dos limites de eventos dependentes), colete uma varredura de íons de produto específico (utilizando a massa de interesse como o íon precursor) em uma amostra mais concentrada.
    NOTA: Este método foi desenvolvido em um instrumento QQQ de baixa resolução. Para todos os novos compostos putativos, um instrumento MS de alta resolução deve ser usado para obter espectros de massa precisos.

Resultados

Para demonstrar a eficácia do método, uma mistura padrão de ATs (10 μg / mL cada de uma mistura de acetiltropina / acetilpseudotropina [monossubstituída], 10 μg / mL cada de uma mistura de dois isômeros de anisodamina [dissubstituído], juntamente com hiosciamina [monossubstituída], littorina [monosubstituída] e escopolamina [trisubstituída]) foi analisada como controle positivo (Figura 2). Um cromatograma de varredura Q1 completo (exibido na visualização do cromatograma de pico de base) é mostrado na Figura 2A, com as estruturas padrão TA indicadas por seus picos correspondentes. O PrIS para m/z 124 (Figura 2B) exibe picos em seu cromatograma para os ATs monossubstituídos; portanto, a mistura de acetiltropina/pseudotropina, hiosciamina e littorina são exibidas. Os picos correspondentes à acetiltropina e pseudotropina no cromatograma m / z 124 são pequenos (possivelmente porque estão em uma concentração mais baixa do que os outros padrões e possivelmente porque podem produzir um fragmento m / z 124 menos abundante do que os outros TAs monossubstituídos). No entanto, eles ainda são detectáveis neste cromatograma e no canal PrIS correspondente. A Figura 2C e a Figura 2D são cromatogramas PrIS para m/z 122 e 140, respectivamente. Detectando fragmentos de TA dissubstituídos, ambos sinalizam os dois isômeros da anisodamina, com um sinal mais forte visível no canal m / z 140. Como diferentes ATs podem possuir fragmentos de intensidades diferentes, os canais m/z 122 e 140 devem ser examinados juntos. Finalmente, os canais m / z 156 (Figura 2E) e m / z 138 (Figura 2F), diagnósticos para ATs trissubstituídos, exibem um pico para escopolamina (o único TA trissubstituído na mistura padrão).

Os cromatogramas NLS foram então usados para atribuir os grupos éster presentes. A Figura 2G mostra o cromatograma NLS para 60 Da (perda de ácido acético dos ésteres de acetato): os dois isômeros TA monossubstituídos acetilados são visíveis. O cromatograma NLS para 166 Da (Figura 2I), destinado a identificar ésteres fenillácticos ou trópicos, identifica corretamente todos os alcalóides contendo qualquer um desses grupos (hiosciamina, littorina, os dois isômeros de anisodamina e escopolamina). Finalmente, como previsto, o cromatograma (Figura 2H) para a perda de 100 Da (diagnóstico de ésteres tigloyl) está em branco para a exceção de uma impureza menor em rt 1,75 min, já que nenhum dos alcalóides padrão contém esse grupo.

O método foi então testado para falsos positivos. Um extrato aquoso/metanólico da folha de tomate (Solanum lycopersicum) serviu como controle negativo. Apesar de serem solanáceas, os tomates não produzem TAs. Um cromatograma de pico de base de varredura Q1 completo é mostrado na Figura 3A. O PrIS para m / z 124 (Figura 3B) é principalmente em branco, com pequenas flutuações de linha de base que são provavelmente ruído do detector (nenhum sinal correspondeu a essas massas nas varreduras Q1 ou Q3). Duas características com rts de 2,6 e 3,4 min produzem um fragmento de 124, mas o exame da varredura de íons do produto DD revela que essas características não produzem nenhum outro fragmento de tropano monossubstituído (m / z 93 ou 142), sugerindo que eles não são TAs. Este exemplo também destaca a utilidade de incluir a varredura de íons do produto DD neste método para descartar falsos positivos. Da mesma forma, o canal m / z 122 para TAs dissubstituídos (Figura 3C) também mostra apenas ruído. Os cromatogramas PrIS para m/z 140, m/z 138 e m/z 156, e os três NLSs, que sugerem apenas características não TA nas varreduras DD, são mostrados na Figura Suplementar 1A-F.

Para demonstrar os usos deste método na desreplicação de uma amostra contendo TA, um extrato de D. metel var. raiz 'fastuosa' foi analisado. As raízes são o principal local de biossíntese de TA em beladonas, e muitos TAs diversos foram previstos para estarem presentes. O cromatograma de varredura Q1 completo é mostrado na Figura 4A. Como esperado, numerosas características de abundância variável foram detectadas nos PrISs para m / z 124 ( Figura 4B ), m / z 122 ( Figura 4C ), m / z 140 ( Figura 4D ), m / z 156 ( Figura 4E ) e m / z 138 ( Figura 4F ). Muitos desses TAs também foram acetilados ou tiglolados, ou derivados do ácido fenilláctico / trópico, como mostrado pelos numerosos sinais nos cromatogramas NLS na Figura 4G-I, respectivamente.

Uma planilha, fornecida como um arquivo .xls (uma folha vazia para uso do leitor é o Arquivo Suplementar 1, a raiz de D. metel está no Arquivo Suplementar 2), foi usada para documentar primeiro quais características (massas ou r.t.s) pareciam semelhantes a TA (usando critérios na etapa 3.1). Em seguida, foram observados fragmentos e perdas neutras pertencentes a essas feições. O método é extremamente sensível: os canais PrIS detectaram prontamente TAs de baixa abundância que não produziram picos visíveis nos cromatogramas correspondentes. Usando os fragmentos e perdas neutras, uma estrutura para o alcalóide poderia então ser proposta seguindo a etapa 3.5.

Um exemplo de uso dos dados espectrais para anotar alcalóides é fornecido na Figura 5. O cromatograma de varredura Q1 completo para raiz de D. metel está na Figura 5A. Um recurso em 14,4 min foi selecionado; o espectro de varredura Q1 (Figura 5B) mostra uma massa original de m / z 224 para este pico. O espectro de varredura de íons do produto DD é mostrado na Figura 5C. O canal PrIS para m / z 124 (Figura 5D) indica que o íon 224 produz esse fragmento (também visível na varredura de íons do produto DD). O canal NLS para 100 Da (para detectar TAs tigloilados) também sinaliza m / z 224 (também confirmado pela varredura de íons do produto DD). Somando a perda neutra e o fragmento TA de menor massa (100 + 124 Da) é igual à massa original, 224, confirmando que o grupo tigloyl é a única substituição; uma estrutura provável para este alcalóide é indicada na Figura 5C. Para ATs di e tri-substituídos, as massas de perda neutra observadas foram adicionadas à massa de TA mais baixa e, em seguida, outra substituição foi proposta para explicar a massa restante: por exemplo, m / z 222, com fragmentos de TA dissubstituídos de 140 e 122 e uma perda neutra de 100 Da, tem uma massa restante de 100 (222-122 = 100), provavelmente será um segundo grupo tigloyl. Este fluxo de trabalho pode ser usado intuitivamente para o processo de eliminação: é improvável que uma feição sem fragmentos de tropano (mesmo que possa perder 60, 100 ou 166 Da) seja um TA. Em um exemplo de desreplicação completa e rápida usando este fluxo de trabalho, 71 TAs distintos de abundância e polaridade variadas foram identificados na raiz de D. metel , incluindo vários compostos isoméricos (Arquivo Suplementar 2). Alguns desses compostos tinham grupos éster que não podiam ser prontamente atribuídos, e alguns compostos adicionais foram sinalizados como potenciais TAs, mas não puderam ser anotados com alta confiança.

Um extrato metanólico/aquoso de sementes moídas de D. stramonium também foi analisado. O cromatograma de pico de base de varredura Q1 completo para raiz de D. metel é mostrado na Figura 6A. O PrIS para m/z 124 é mostrado na Figura 6B e o PrIS para m/z 122 é mostrado na Figura 6C; os outros cromatogramas são mostrados na Figura Suplementar 2A-F. A Figura 6B indica um alcalóide tropano monossubstituído muito abundante a r.t. = 12,6 min, provavelmente hiosciamina. A planilha que mostra as anotações de TA inicial está incluída no Arquivo Suplementar 3. O desempenho do método parecia menor com esta amostra em particular: duas características muito abundantes com um m / z de 259 em rts de 8,5 e 10,2 minutos produziram picos nos cromatogramas NLS para 60 e 100 Da (Figura Suplementar 2 D, E) com uma massa de m / z 260 (um isótopo M + 1) indicado nos espectros correspondentes. Esses compostos não são TAs, mas sim fragmentos formados consistentes com alcalóides beta-carbolina27. Eles não são acetilados ou tigloyados, mas perdem 60 ou 100 de seu isótopo M + 1, tornando sua aparência nesses dois canais NLS incorreta. Além disso, a escopolamina (rt = 10,5 min) produziu um fragmento m / z 122 de seu pico de isótopo m / z 305 M + 1, um isótopo do fragmento m / z 121 esperado da escopolamina. Embora esses métodos empreguem funções de desisótopo, algum "vazamento" de isótopos é possível nessas altas concentrações de amostra. Embora esta possa ser uma ocorrência exclusiva do instrumento utilizado neste estudo ou nesta amostra, vale a pena notar.

Quarenta TAs foram anotados em sementes de D. stramonium usando este método, incluindo vários que parecem ser glicosilados, perdendo massas de 162 (hexose), 146 (desoxihexose) ou 132 Da (xilose ou um açúcar similar). Embora ATs contendo hexose tenham sido relatados em Merremia (Convolvulaceae) 28, Duboisia29 e Atropa25, este é o primeiro relato de ATs contendo desoxihexose ou xilose. Um TA tinha um r.t. de 13,8 min (Figura 7A) e uma massa de m/z 436 (Q1 scan na Figura 7B). Essa característica produziu um sinal no canal m / z 124, indicando um TA monossubstituído (Figura 7D), mas não produziu sinais em nenhum outro canal PrIS ou NLS. A varredura de íons do produto DD (Figura 7C) indicou o m / z 124 esperado, uma perda de 312 Da, possivelmente 166 + 146 Da, do íon pai. MS/MS de alta resolução foi obtido em um instrumento de tempo de voo quadrupolo (espectro na Figura 7E), que indicou um fragmento m/z 290, sugerindo hiosciamina ou littorina glicosilada na porção éster hidroxila com ramnose ou um açúcar similar; a massa precisa medida também estava muito próxima da massa exata calculada para ramnosil-hiosciamina ou littorina (estrutura na Figura 7E). Devido à sua estrutura e abundância sem precedentes, este alcalóide merece isolamento das sementes de D. stramonium , um exemplo que demonstra o uso deste método na descoberta de novos alcalóides.

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Figura 1: Fragmentos e perdas relevantes observados em MS de ATs. (A) Fragmentos característicos (e suas massas diagnósticas) formados a partir de ATs monossubstituídos, dissubstituídos e trissubsituados, bem como exemplos representativos de alcalóides em cada classe. (B) Perdas neutras comuns observadas de grupos éster em ATs (e suas massas diagnósticas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Varreduras de perda neutra e de íons precursores de controle positivo. Para todos os cromatogramas, o eixo X é o tempo de retenção e o eixo Y é a contagem (abundância de íons). (A) O cromatograma de íons totais, na visão do cromatograma de pico de base, da mistura padrão de alcalóides. As estruturas dos padrões são indicadas; Os picos correspondentes são indicados por setas vermelhas. (BF) são cromatogramas PrIS para (B) m / z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 e (F) 138. (G-I) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetil, G), 100 Da (tigloíla, H) e 166 Da (fenilláctico/ácido trópico, I). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Varreduras de íon precursor de controle negativo e perda neutra. Para todos os cromatogramas, o eixo X é o tempo de retenção e o eixo Y é a contagem (abundância de íons). (A) O cromatograma de íons totais, em vista de cromatograma de pico de base, de um extrato metanólico / aquoso da folha de S. lycopersicum . (B) O cromatograma PrIS para m / z 124 mostrando apenas duas características não tropônicas em rt 2,6 e 3,4 min. (C) O cromatograma PrIS para m / z 122, em branco, exceto para o ruído do detector. As escalas utilizadas são as mesmas da Figura 2; os cromatogramas restantes estão na Figura Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Aplicação do método MS/MS às raízes de D. metel var. Para todos os cromatogramas, o eixo X é o tempo de retenção e o eixo Y é a contagem (abundância de íons). (A) O cromatograma de íons totais, em vista de cromatograma de pico de base, de um extrato metanólico/aquoso de raízes de D. metel var. (BF) são cromatogramas PrIS para m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 e (F) 138. (GI) são cromatogramas NLS para 60 Da (acetil, G), 100 Da (tigloíla, H) e 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, I). Observe os sinais abundantes em cada cromatograma correspondentes a numerosos TAs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Aplicação do método combinado de varredura de íons de produto DD, varredura de íons precursores e varredura de perda neutra para propor a estrutura de um TA. (A) O cromatograma de íons totais, na visão do cromatograma de pico de base, de um extrato de metanol / água de D. metel var. Um pico em r.t. = 14,4 min é indicado por uma seta vermelha. (B) O Q1 (varredura de pesquisa), com uma massa abundante de m / z 224 para este pico. Para todos os espectros, o eixo X é a massa e o eixo Y é a intensidade. (C) A varredura de íons do produto DD, mostrando a fragmentação do íon m / z 224, indicando uma perda de 100 Da e um fragmento m / z 124 (setas vermelhas). Este composto aparece tanto no canal (D) m/z 124 PrIS quanto no canal 100 Da NLS, indicando que é monossubstituído e tigloilado (estrutura no painel C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Aplicação do método MS/MS a sementes de D. stramonium . Para todos os cromatogramas, o eixo X é o tempo de retenção e o eixo Y é a contagem (abundância de íons). (A) O cromatograma de íons totais, em vista de cromatograma de pico de base, de um extrato de metanol / água de sementes de D. stramonium. (B) O cromatograma PrIS para m / z 124; (C) descreve o cromatograma PrIS para m / z 140. Os cromatogramas restantes estão na Figura Suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Anotando um novo alcalóide em sementes de D. stramonium . Para todos os cromatogramas, o eixo X é o tempo de retenção e o eixo Y é a contagem (abundância de íons). (A) O cromatograma de íons totais, em vista de cromatograma de pico de base, de um extrato de metanol / água de sementes de D. stramonium. Uma característica em rt = 13,7 min é indicada. (B) O Q1 (varredura de pesquisa) mostrando uma massa de m / z 436 para este pico. Para todos os espectros, o eixo X é a massa e o eixo Y é a intensidade. (C) A varredura de íons do produto DD mostrando a fragmentação do íon m / z 436. (D) Este composto TA monossubstituído aparece no canal m / z 124 PrIS. (E) O espectro MS / MS de alta resolução para este novo TA, juntamente com as estruturas propostas e a massa exata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Varreduras adicionais de íons precursores de controle e perda neutra. (AC) Cromatogramas PrIS para m/z (A) 140, (B) 156 e (C) 138. (D-F) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetil, D), 100 Da (tigloíla, E) e 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, F). As escalas utilizadas são as mesmas da Figura 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Aplicação do método MS/MS a sementes de D. stramonium; cromatogramas adicionais. (AC) são cromatogramas PrIS para m / z (A) 140, (B) 156 e (C) 138. (D-F) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetil, D), 100 Da (tigloíla, E) e 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, F). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Planilha em branco usada para anotações de alcalóides. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Planilha de anotações e estruturas de alcalóides para raízes de D. metel var. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Planilha de anotações e estruturas de alcalóides para sementes de D. stramonium. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Embora os parâmetros do instrumento fornecidos no protocolo permitam um desempenho satisfatório, o uso bem-sucedido desse método pode exigir atenção cuidadosa ou otimização de várias etapas críticas. Embora o gradiente de solvente por HPLC fornecido na etapa 2.2 seja geralmente apropriado para alcaloides tropanos, pode ser necessário modificá-lo dependendo do perfil alcalóide tropano da amostra ou da espécie vegetal examinada. O volume de injeção da amostra também pode ser alterado dependendo da sensibilidade do instrumento e de como o método é usado. O perfil metabólico "profundo" ou a desreplicação devem usar um volume de injeção maior (15-20 μL foram usados neste estudo), enquanto a detecção simples de alcalóides pode usar volumes menores. Deve-se tomar cuidado ao usar grandes volumes de amostra para (a) manter a fonte de íons limpa regularmente, (b) monitorar a coluna de HPLC quanto a mudanças de pressão ou obstruções (uma coluna de proteção apropriada deve sempre ser usada), (c) evitar o transporte entre amostras e (d) examinar os cromatogramas quanto a possíveis "vazamentos de isótopos", conforme descrito acima. As temperaturas e tensões da interface não devem ser alteradas significativamente em relação às especificadas no método para evitar a fragmentação prematura na fonte. Além disso, embora uma tensão de célula de colisão de 20 V seja recomendada, ela pode não fornecer o sinal de cromatograma ideal (ou fragmentos de varredura de íons de produto DD de diagnóstico) para todos os TAs. Alguns instrumentos e funções de MS têm um recurso de "rampa de energia de colisão", ou a capacidade de coletar varreduras em energias de colisão múltiplas ou otimizadas, que também podem encontrar utilidade em um método como este30.

Este método de MS em si também é facilmente modificável: enquanto ésteres tiglic, acético e fenilláctico / ácido trópico são comuns em espécies de Datura , os padrões de substituição de éster TA podem ser diferentes em outras plantas ou amostras. As massas NLS podem ser alteradas para detectar outros grupos de ésteres (por exemplo, uma perda de 74 Da para ésteres propiônicos) ou potencialmente detectar glicosilações (por exemplo, uma perda de 162 Da para hexoses). As massas PrIS também podem ser alteradas. Por exemplo, um TA em ambas as amostras de Datura (rt = 12,5 min; ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) foi anotado como norhiosciamina ou norlittorina (hiosciamina / littorina menos o grupo N-metil do tropano) com base em seus fragmentos de varredura de íons do produto DD (m / z 110 e 93) e corresponde aos espectros da literatura31; este TA não apareceu em nenhum dos canais PrIS do fragmento de tropano. Um canal pode ser adicionado para essas duas massas para detectar nortropanos. O fragmento m/z 93 também está presente na maioria dos ATs monossubstituídos17; adicionar esse canal pode fornecer confirmação adicional para a presença de um TA monossubstituído e ajudar a reduzir falsos positivos.

Além de sua adaptabilidade para diferentes tipos de ATs, uma grande vantagem deste protocolo (sobre os métodos de anotação de alcalóides existentes) é sua velocidade. Dependendo de como o método MS está configurado (e do tempo de execução de HPLC usado), todos os dados MS/MS de uma amostra podem ser coletados dentro de 60-90 minutos. Por exemplo, durante nossos estudos, os TA PrISs mono e di-substituídos foram incorporados em um método, os TA PrISs trissubstituídos estavam em outro método e os NLSs estavam em um terceiro (todos os métodos continham a varredura de íons do produto DD), para um total de três injeções a trinta minutos cada. A anotação completa da amostra utilizando os dados combinados de MS/MS é muito mais rápida do que o exame manual de cada pico ou a coleta de varreduras de íons de produtos individuais para vários picos de interesse. Este método pode ser realizado em qualquer instrumento com os modos de varredura de íons de produto, PrIS e NLS e pode ser usado para avaliação qualitativa rápida (ou seja, os ATs estão presentes ou ausentes?), para distinguir ou "imprimir impressões digitais" de diferentes gêneros de plantas, espécies, variedades ou cultivares, órgãos ou estágios de crescimento e para comparar os ATs observados com os relatados (como parte de um fluxo de trabalho de desreplicação). Conforme demonstrado, o protocolo também pode ser usado para a descoberta de novos ATs como pistas para isolamento, purificação ou bioensaio, bem como identificação de espécies e tecidos candidatos para isolá-los. Este método pode ser usado nos campos de produtos naturais e metabolômica, inclusive para auxiliar na compreensão da bioquímica das plantas e na investigação da descoberta de medicamentos em estágio inicial. Aplicações adicionais podem ser encontradas em segurança alimentar ou forense (por exemplo, detecção de ATs em alimentos, suplementos ou biofluidos).

O método tem várias desvantagens que merecem discussão. Primeiro, dependendo do instrumento usado e da finalidade de empregar o protocolo, pode ser necessário um grande volume de injeção de amostra, o que pode causar problemas de desempenho do instrumento e o potencial de falsos positivos em alguns casos (conforme descrito acima). Em segundo lugar, este método foi desenvolvido em um instrumento QQQ de baixa resolução, e falsos positivos podem resultar da baixa resolução (por exemplo, o recurso contendo um fragmento m / z 124 no controle negativo que não é um TA). Um instrumento de alta resolução forneceria melhor capacidade diagnóstica, e espectros de MS/MS de massa precisa deveriam ser obtidos para qualquer novo alcalóide proposto. Desvantagens adicionais a este método são simplesmente as desvantagens da análise MS / MS como um todo. Embora o MS / MS seja útil para propor estruturas ("anotação" conforme designado pela Metabolomics Standards Initiative32), ele não fornece atribuições concretas de conectividade molecular ("identificação"). Por exemplo, em ambas as amostras de Datura, encontramos vários isômeros de um m / z 306 TA, que parecia ter fragmentos m / z 124 e m / z 140 (Arquivo Suplementar 2), dificultando assim a atribuição definitiva do padrão de substituição. Isso pode representar um mecanismo de fragmentação ainda não descoberto, e outra técnica (como espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode ser útil na resolução de ambiguidades. Os métodos baseados em MS / MS freqüentemente lutam com o isomerismo: o éster de ácido fenilláctico littorina (ou seus derivados) é difícil de distinguir da hiosciamina (éster de ácido trópico), e outras plantas Solanaceous contêm TAs substituídos pelos grupos isoméricos tigloíla, senecioíla e angeloila33,34; Na ausência de padrões, esses compostos podem ser difíceis, se não impossíveis, de distinguir. O método também não diferenciará enantiômeros (por exemplo, 3,6 vs. 3,7-di-hidroxitropano; veja a Figura 1 para numeração) ou regioisômeros (por exemplo, distinguindo 3-acetil de 7-acetil sem um padrão). Atribuímos a maioria dos tropanos monossubstituídos como 3-substituídos com base em padrões anteriores relatados no gênero Datura e outras plantas Solanaceous17,35. Portanto, qualquer conhecimento bioquímico ou literatura sobre o organismo estudado (se disponível) deve sempre ser consultado juntamente com qualquer análise instrumental.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa do corpo docente (Northern Michigan University, concedida ao MAC), uma bolsa de pesquisa de graduação (Northern Michigan University, concedida a JC) e o Departamento de Química. Os autores gostariam de agradecer a John Berger (NMU) pela assistência na preparação do tecido vegetal, Hannah Hawkins (NMU) pela manutenção de LC-MS e assistência na solução de problemas, e ao Dr. Ryan Fornwald e seus alunos do CH 495 (Síntese de Produtos Naturais) pela preparação da mistura de acetiltropina. Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Daniel Jones (Michigan State University) por adquirir espectros MS/MS de alta resolução.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetonitrila, Para UHPLC, adequado para espectrometria de massaSigma-Aldrich900667HPLC solvente
Gás argônioAirGasAR UHP300Gás CID
Ácido fórmico, 99% para análiseThermo ScientificAC270480010HPLC aditivo
Guarda suporte de colunaRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58Coluna HPLC
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Espectrômetro de massa; executamos o software LabSolutions, que é padrão para instrumentos Shimadzu
Nitrogênio líquidoAirGasNI 180LT22
Metanol, para HPLC/UHPLC/LCMSVWR BDH85800.400Para fazer solvente de extração
Microcentrífuga VWR2400-37
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Argamassa Fisher ScientificFB961CPara moer tecidos vegetais
PilãoFisher ScientificFB961MPara moer tecidos vegetais
Pipeta 1000 mLGilson 
Ponta de pipeta 1000 mLFisher scientific02-707-404
Tecidos vegetaisVárias fontesN/APode ser qualquer coisa selvagem ou cultivada
Tubos cônicos de polipropileno, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Resfriador de poliestirenoULINES-18312O tipo de resfriadores em que os reagentes para biologia molecular são enviados seria
apropriado Roc C18 3 µ m, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315coluna HPLC
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210coluna Guard
agitador de balançoThemo Scientific11-676-680
Kit de conveniência de frasco de rosca de parafuso (9 mm)Fisher scientific13-622-190Frascos de amostrador automático LCMS
Seringa, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Filtro de seringa 0,45 µ m Avantor/VWR76479-008
Água, para utilização em cromatografia líquida e espectrometria de massaJT Baker9831-03Para fazer solvente de extração
Solução aquosa, contém 0,1% v/v de ácido fórmico, Para UHPLC, adequado para espectrometria de massaSigma-Aldrich900687-1LSolvente HPLC
F144059M

Referências

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