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Artigo de método

Moxabustão Particionada por Ervas no Umbigo em Modelo de Rato de Dismenorreia Primária com Coagulação a Frio e Estase Sanguínea

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DOI:

10.3791/66622

⸱

4 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1The Third Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, 2The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Neurobiology and Acupuncture Research, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos em detalhes os procedimentos operacionais e as precauções a serem tomadas durante a moxabustão particionada por ervas no umbigo no tratamento da dismenorreia primária em ratos com coagulação fria e estase sanguínea, o que pode melhorar significativamente a reação de contorção de ratos com dismenorreia e aliviar a dor.

Resumo

A dismenorreia primária (PDM) refere-se à ocorrência de cólica espasmódica no abdômen inferior sem qualquer patologia pélvica óbvia, muitas vezes acompanhada de outros sintomas sistêmicos, o que reduz significativamente a qualidade de vida das mulheres com PDM, 45%-95% das mulheres menstruadas são afetadas por ela. Apesar da alta incidência de MDP, muitas vezes não é bem tratada e é ignorada por pesquisadores relevantes e pelas próprias mulheres. A moxabustão particionada por ervas (HPM) é uma terapia externa característica da medicina tradicional chinesa (MTC), amplamente utilizada para tratar doenças na China; ele trata doenças aplicando uma fórmula de ervas chinesas nos pontos de acupuntura do paciente e, em seguida, acendendo bastões de moxa na fórmula de ervas para terapia de moxabustão. A principal eficácia das ervas utilizadas neste estudo é a ativação e o calor dos meridianos, que estimulam a circulação do qi para aliviar a dor. A estimulação do calor da moxabustão pode acelerar a infusão das ervas no corpo humano. Consequentemente, o HPM, que combina acupontos, ervas e estímulos de calor, é apropriado para o tratamento de distúrbios ginecológicos, particularmente doenças funcionais, como o PDM. Este artigo fornece uma descrição detalhada dos procedimentos e precauções para HPM no ponto de acupuntura Shenque (CV8) em ratas experimentais, que 0fornece uma base experimental para melhor promover a aplicação e desenvolvimento de HPM no umbigo em PDM.

Introdução

A dismenorreia primária (MPD), também conhecida como dismenorreia funcional, é uma das doenças ginecológicas mais prevalentes que afetam meninas adolescentes e mulheres jovens menstruadas1. É caracterizada por efeitos colaterais como angústia e compressões uterinas (espasmos), juntamente com problemas inflamatórios no abdome antes e após a menstruação, sem qualquer evidência de patologia pélvica2. Cólicas abdominais inferiores que começam 8-72 h após o início da menstruação, atingem o pico nos primeiros dias de aumento do fluxo menstrual 3,4 e às vezes se espalham para as costas e coxas são os sintomas característicos da PDM policística. Devido às diferentes definições da condição e à falta de formas padronizadas de avaliar a intensidade da dor menstrual, a prevalência estimada de dismenorreia em mulheres varia de 45% a 95%3,4,5. Acredita-se que cerca de 10% a 25% das mulheres em idade reprodutiva sofram de PDM6 realmente grave. A prevalência de MDP é maior na faixa etária de 20 a 24 anos e diminui progressivamente a partir de então2. A PDM é caracterizada por dor abdominal inferior periódica, que é frequentemente acompanhada por outros sintomas sistêmicos, como lombalgia, náuseas, vômitos, dores de cabeça, anorexia, diarreia7 e até sintomas mentais como depressão e ansiedade 8,9. Durante a menstruação, as mulheres com dismenorreia experimentam um declínio na qualidade de vida geral 4,8,10.

Além disso, estudos descobriram que a dor menstrual repetida pode afetar a função do sistema nervoso central, levando a uma percepção alterada da dor em estágios dolorosos ou sem dor11. Devido à etiologia da PDM ser baseada em prostaglandinas (PGs), o tratamento medicamentoso mais comum para a PDM são os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs)12,13, seguidos pelos contraceptivos orais14. Além dos efeitos colaterais dos medicamentos, 10% a 20% das pessoas não respondem aos AINEs e contraceptivos3. A maioria das pesquisas atuais está preocupada com os efeitos da dismenorreia na anatomia e fisiologia do cérebro, com pouca atenção às abordagens terapêuticas. Consequentemente, há uma necessidade urgente de encontrar uma estratégia de tratamento que possa ser amplamente aplicada na prática clínica, com eficácia estabelecida e prontamente aceita pelos pacientes.

A moxabustão particionada por ervas (HPM) é uma terapia externa característica da medicina tradicional chinesa (MTC), amplamente utilizada para tratar doenças na China. Seus benefícios incluem custo mínimo, sem efeitos colaterais, bons efeitos a longo prazo, fácil operação e fácil aceitação pelos pacientes. Verificou-se que o efeito do HPM no umbigo sobre a PDM é significativo15, o que pode estar intimamente relacionado à regulação da deficiência de frio e calor e excesso do útero, bem como dos mastócitos e receptores relacionados16. A equipe de pesquisa provou que o HPM pode aliviar imediatamente a dor menstrual17.

Zhang Zhong-jing inicialmente registrou o conceito de dismenorreia nas Doenças Diversas da Mulher e Tratamento da Câmara Dourada, escrevendo que o fluxo menstrual é desfavorável sob o cinto e o abdômen está cheio de dor18. De acordo com seus principais sintomas, a dismenorreia pode ser atribuída à categoria de dor menstrual e dor abdominal menstrual na medicina tradicional chinesa. As síndromes da dismenorreia podem ser divididas em cinco: deficiência de qi e sangue; coagulação fria e estase sanguínea; acúmulo de calor úmido; estagnação de qi e estase de sangue; e deficiência hepática e renal16. De acordo com estudos relevantes, a síndrome de coagulação fria e estase sanguínea é a síndrome mais comum da MDP19,20. A MTC sustenta que o PDM e os patógenos do frio estão intimamente conectados21. Durante ou ao redor da menstruação, há um fluxo excessivo de sangue em Xuehai, levando a um rápido esgotamento do sangue qi devido à sua natureza energética. Consequentemente, as mulheres são vulneráveis a causas causadoras de doenças devido à falta de energia saudável suficiente e às rápidas flutuações de qi e sangue no útero e nos meridianos de Chong e Ren22. As mulheres que têm um físico bem desenvolvido devem tomar precauções para evitar o consumo de alimentos crus ou frios e para evitar pegar um resfriado durante a menstruação. Não fazer isso pode resultar na intrusão de patógenos frios no útero, levando à coagulação e estagnação do sangue no útero e nos meridianos de Chong e Ren. Consequentemente, os indivíduos sentem dor como resultado da estagnação do fluxo sanguíneo. Tanto a intrusão de patógenos frios de fora quanto a presença de frio yin dentro do corpo podem causar bloqueio e coagulação dos meridianos.

A localização da dismenorreia é nos meridianos Chong e Ren, e o início está relacionado a mudanças no qi e no sangue. Na teoria da MTC, a moxabustão funciona estimulando o Yang Qi, aquecendo os meridianos, dispersando o frio e aumentando o fluxo sanguíneo para aliviar a dor. De acordo com Jinfu de Lingshu23, se o pulso e o coágulo sanguíneo estiverem no meio, e houver sangue congelado e sangue frio, então é apropriado para moxabustão; É um tratamento típico da dismenorreia externa. Em um trabalho publicado anteriormente,24 folhas de artemisia argyi são descritas como amargas e pungentes, capazes de restaurar o Yang original quase esgotado, conectando os doze meridianos, percorrendo os três meridianos Yin, regulando o Qi e o sangue, dissipando o frio e a umidade e aquecendo o útero, a moxabustão, com a ajuda dos pontos de acupuntura correspondentes, pode expelir fatores patogênicos externamente, Regular o qi e o sangue internamente e, assim, desempenhar um papel na regulação dos meridianos, ativando a circulação sanguínea e interrompendo a dor. O umbigo, também conhecido como Shenque (CV8), pertence ao meridiano Ren, conectando os meridianos Du, Chong e Dai. De acordo com a teoria da MTC, acredita-se que Shenque esteja relacionado aos cinco zang e seis fu25. É considerado uma base congênita e o pivô do equilíbrio yin-yang. Anatômica, a MDP está próxima da pelve e está intimamente ligada ao útero. A doença PDM afeta especificamente o útero, e sua patogênese envolve um desequilíbrio de qi e sangue, bem como um desequilíbrio das vísceras. Ao estimular o ponto de Shenque, é possível influenciar diretamente o qi e a condição sanguínea do útero e tratar efetivamente as cólicas menstruais. Com base na teoria supracitada, selecionamos a estimulação do acuponto de Shenque localizado na região abdominal para a terapia HPM, com o objetivo de melhorar os sintomas da dismenorreia e aliviar a dor.

Para mimetizar a intervenção da MTC no PDM o mais próximo possível com coagulação fria e estase sanguínea, replicamos a técnica HPM no umbigo em ratas. Descobriu-se que o HPM no umbigo tem um efeito analgésico claro e pode diminuir a reação de contorção de ratos com dismenorreia. A fim de investigar o mecanismo de HPM no umbigo para melhorar a PDM e promovê-la, examinamos uma técnica de fixação de ratos e realização de HPM no ponto de acupuntura de Shenque na barriga.

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Protocolo

Este protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética e Gerenciamento de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang. Todas as operações experimentais em animais estão em conformidade com a ética do bem-estar animal experimental e os regulamentos de segurança experimental animal. O estudo usou ratos Wistar fêmeas adultas com idades entre 8 e 10 semanas do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Zhejiang. Antes do experimento, os ratos foram alimentados com uma dieta adaptativa por 1 semana em um ambiente controlado (temperatura: 23-25 °C, umidade: 40%-60%). Os ratos foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com luzes acesas das 8:00 às 20:00, e tiveram acesso irrestrito a comida e água. O protocolo a seguir descreve o PDM com coagulação fria e estabelecimento do modelo de estase sanguínea e HPM no procedimento de terapia do umbigo. Uma representação do procedimento é mostrada na Figura 1.

1. Estabelecimento de PDM com coagulação fria e estase sanguínea

  1. Rastreie os ciclos estrais das ratas por lavagem vaginal.
    1. Insira a pipeta com 60 μL de solução salina a 0,9% no orifício vaginal do rato, pipete para cima e para baixo 3-4 vezes e, em seguida, aspire o líquido e jogue-o em uma lâmina de vidro.
      NOTA: Enrolar o rato em uma toalha que possa ser lavada ou descartada seria apropriado.
    2. Fixe o conteúdo seco adicionando 60 μL de etanol a 95% por 8 min, depois enxágue e seque o conteúdo. Adicione a solução de coloração azul de metileno a 0,1% e incube longe da luz por 10 min. Depois, enxágue e seque o conteúdo.
    3. Observe e obtenha imagens ao microscópio.
      NOTA: Se for observado um grande número de glóbulos brancos e poucas células epiteliais nucleares, o estágio de diestro é confirmado (Figura 1B). Esses ratos foram divididos aleatoriamente em grupo controle, grupo modelo e grupo moxabustão (n = 6).
  2. Estabelecimento de modelos animais de MDP com coagulação a frio e estase sanguínea
    1. Injete benzoato de estradiol por via subcutânea na coxa por 10 dias (0,5 mg por rato no1º e10º dias e 0,2 mg do2º ao9º dia) para induzir a contração do útero.
    2. Coloque as ratas na geladeira a -20 ° C por 4 h no1º ao5º dia de modelagem26. Durante o período de incubação de 4 h, abra a porta do refrigerador no meio do caminho para trocar o ar por 30 min e depois feche-a.
    3. Injete ocitocina (2 U por rato) por injeção intraperitoneal 24 h após a última administração para induzir dismenorréia.
      NOTA: Este estudo é baseado em um trabalho publicado anteriormente que se concentrou na coagulação fria e na preparação do modelo de dismenorreia de estase sanguíneaem ratos 27. O grupo controle foi injetado com o mesmo volume de solução salina e o procedimento de congelamento foi o mesmo do grupo modelo.

2. Terapia HPM para umbigo em ratas modelo PDM com coagulação fria e estase sanguínea

NOTA: Prepare os quatro materiais mais importantes para a terapia do umbigo HPM (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Prepare cones de moxa. Esfregue o fio dental de moxa na mão em forma de fuso (diâmetro 0,8 cm, altura 0,8 cm) (Figura 2A).
  2. Faça uma tigela de massa com um orifício (diâmetro 1 cm, profundidade 0,8 cm) no meio (Figura 2B).
  3. Pesar 0,3 g de pó de TCM (Figura 2C).
    NOTA: De acordo com Du Dongqing28, o pó de TCM contém Corydalis yanhusuo, Evodia fructus, Olíbano, Baishao (Paeoniae Radix Alba), Mirra, Borneol e Wulingzhi (Trogopterus Xanthipes).
  4. Prepare a bolsa de rato para consertar o rato. Isso manterá o rato estável durante o procedimento.
    1. Recorte o pano (comprimento x largura: 20 cm x 20 cm) e costure na diagonal. Corte uma pequena abertura na parte superior para respirar e um orifício (aproximadamente 5 cm de diâmetro) em um lado da bolsa para moxabustão.
    2. Costure um par de cordas de pano de cerca de 10 cm de comprimento e 1 cm de largura nas extremidades superior e inferior da bolsa, respectivamente, para amarrar (Figura 2D).
      NOTA: O experimentador pode fazer um tamanho adequado da bolsa de rato de acordo com o tamanho do animal testado.
  5. Encontre a localização exata do ponto de acupuntura Shenque (CV8).
    1. Consultando aliteratura29,30, localizar o Shenque (CV8) na linha média do abdome do rato, na intersecção dos 2/3 superiores e 1/3 inferiores da linha que liga o apêndice xifóide e a borda superior do osso púbico (Figura 1D).
  6. Remova o cabelo ao redor do ponto de acupuntura Shenque.
  7. Coloque o rato na bolsa de rato. Mantenha o abdômen do rato para cima e exponha os membros inferiores e a cauda. Fixe as partes superior e inferior do corpo do rato e a cauda na mesa de operação com fita adesiva.
    NOTA: Ao amarrar os ratos, o operador deve ser gentil e não muito duro, garantindo que não cause pânico nos ratos e afete os resultados experimentais. Certifique-se de que a fixação esteja solta e não aplique pressão no coração, o que pode levar à mortalidade de ratos.
  8. Desinfetar o Shenque e a pele circundante com etanol a 75 %.
  9. Coloque a tigela no abdômen, aponte seu orifício para o ponto de acupuntura Shenque e coloque o pó TCM no ponto de acupuntura Shenque.
  10. Coloque o cone de moxa no pó TCM.
  11. Acenda o cone de moxa e coloque um novo depois que o anterior queimar. Trate o rato por 30 min (Figura 1E).
    NOTA: Não use anestesia durante o tratamento. Fique quieto. Observe o rato de perto para evitar queimaduras causadas por temperatura excessiva durante a moxabustão.

3. Realização do teste comportamental

  1. Limpe a caixa experimental com etanol a 75% antes de cada teste.
    NOTA: O campo aberto é um cubo de 40 cm x 40 cm x 40 cm sem tampa de caixa de madeira.
  2. Coloque o rato na gaiola após injeção intraperitoneal de ocitocina (2 U) ou solução salina a 0,9%.
  3. Grave o comportamento de contorção por 30 minutos com uma câmera de vídeo.
  4. Calcule as latências de contorção (WLs) e a pontuação de contorção (WS).
    1. De acordo com o método de Schmauss31, divida o comportamento de torção em 4 níveis de 0 a 3. Pontue os animais com base no método de Schmauss.
      NOTA: Nível 0: postura normal (mãos e garras espalmadas no fundo da gaiola ou comportamento exploratório normal); Nível 1: corpo inclinado para a esquerda ou para a direita; Nível 2: patas traseiras esticadas, parte de trás das patas traseiras dobradas e rotação frequente da pelve; Nível 3: contração dos músculos abdominais, patas traseiras esticadas para trás. Os ratos apresentaram respostas contorcidas (contração abdominal, concavidade, extensão do tronco e dos membros posteriores, rotação de um membro, contração uterina), indicando uma preparação bem-sucedida do PDM do tipo estase sanguínea congelada a frio. O período de incubação da contorção é o tempo desde a injeção de ocitocina até a ocorrência de uma reação de contorção. Se o período de incubação exceder 30 min, é calculado como 30 min. Pontuação de torção = (0 [vezes] × 0) + (1 [vezes] × 1) + (2 [vezes] × 2) + (3 [vezes] × 3).

4. Coleta da amostra após o teste comportamental

  1. Segure o rato com a mão e injete pentobarbital sódico a 3% (1 mL / kg) por via intraperitoneal para anestesia profunda.
  2. Pese os ratos para obter o peso corporal.
  3. Incise a pele e o músculo do meio do abdômen para expor o coração.
  4. Insira o coração a partir da posição do ápice com uma agulha de perfusão, fixe a agulha de perfusão com uma pinça hemostática e faça um pequeno corte na aurícula direita.
  5. Perfunda solução salina a 0,9% através do ventrículo esquerdo e da aorta ascendente até que o fígado e os olhos do rato fiquem mais claros e brancos.
  6. Use uma tesoura para cortar o útero e pesá-lo.
  7. Obtenha o índice uterino calculando a relação entre o peso do útero e o peso corporal.

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Resultados

Neste estudo, o benzoato de estradiol em combinação com ocitocina foi usado para induzir o modelo PDM de coagulação fria e o tipo de estase sanguínea para observar o efeito da terapia HPM para o umbigo. Primeiro, observando o comportamento de contorção do rato, determine se o rato PDM com coagulação fria e estase sanguínea foi modelado com sucesso e avalie o comportamento da dor, modelagem e tratamento do rato no útero por meio de WS, WLs e índice uterino. Do6º ao10º dia de modelagem, o tratamento c...

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Discussão

Atualmente, existem vários métodos de modelagem para PDM com coagulação a frio e tipo de estase sanguínea, mas o método principal é o benzoato de estradiol combinado com ocitocina para modelagem de dismenorreia, que será diferente com base nisso. Neste estudo, o método de congelamento de corpo inteiro combinado com benzoato de estradiol e ocitocina foi usado para modelagem. A temperatura do método de congelamento de corpo inteiro foi de -20 °C. No pré-experimento anterior, verificou-se ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang, Explorando o Programa Q (LQ20H270012), o Plano de Tecnologia de Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang (NO.2020ZB124), o Projeto de Pesquisa da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (NO.2021JKZKTS056B) e o Projeto de Nível Hospitalar do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (NO. ZS22ZA01). Somos gratos ao Centro de Animais Experimentais da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang e ao Laboratório Chave de Acupuntura e Neurologia da Província de Zhejiang por nos fornecer as condições experimentais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% fisiológico salinoHangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.SLYSZ1APara injetar o grupo de controle 
Seringa estéril descartável de 1 mLChangzhou Yuekang Medical Equipment Co., Ltd.3000-0515-14Para injeção de drogas
3 mL (estendida) Pipeta PasteurBeijing Lanjieke Technology Co., Ltd.YCKJ-HC-007245Para a montagem de
álcool de desinfecção a 75%Hangzhou OUTOP Biotechnology Co., Ltd.N/APara esterilizar o local de tratamento
Corrediça de vidro revestida com adesivoZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.188105WPara coloração HE
Incubadora bioquímicaShanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Fábrica de equipamentos médicosN / APara desparafinação de tecidos em material de tecido de coloração HE
PreparaçãointernaN / ABolsa para segurar rato
Sistema de varredura de fatia de gerente digitalHamamatsuC13210-01Para varredura de fatia HE
Luvasde látex descartáveisFornecedor verificado - Guangzhou Lige Technology Co., Ltd.LG10-102-1IPara uso durante a operação
Benzoato de estradiolHefei Xinkexin Animal Pharmaceutical Co., Ltd.N/APara estabelecer o modelo de dismenorreia
Excelsior AS Desidratador totalmente automáticoThermo ScientificExcelsior ASPara desidratação de tecido de coloração HE
Ratos Wistar fêmeasCentro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de ZhejiangN/A220– 250 g
de farinhaPreparação internaN/APara tratamento de moxabustão particionada por ervas
FórcepsZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsnzPara coleta de amostras
Formaldeído Xangai Lingfeng Reagente Químico Co., Ltd.441244-1KGPara fixação de tecido
Gemini AS manchador de lâminasThermo ScientificGemini AS Máquina de coloração
HemostatZhejiang Tuzhi Tecnologia Farmacêutica Co., Ltd.lsnzPara coleta de amostras
HistoCoreLeica (Arcadia H)14039357258Para incorporação de tecido de coloração HE
Bola de algodão médica estérilO Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de ZhejiangN / APara esterilizar o local do tratamento
Solução de coloração de azul de metileno (0,1%)Beijing Honghu United Chemical Products Co., Ltd.G1300para triagem de tesouras de microdissecção de ciclo estral
Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.XWJ12APara coleta de amostras
Vidro de cobertura do microscópio (24 mm x 50 mm)Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.10212450CPara o
micrótomodo HE Leica MicrosystemsRM2255Para o congelador de corte do tecido
HefeiMidea Refrigerator Co., Ltd.N/APara estabelecer o modelo de dismenorreia com coagulação a frio e estase sanguínea
Pinça molarHangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.YGJD-11Para coleta de amostras
Meio de montagemHangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.CS9603-100mLPara montagem de tecido
Moxavara O Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de ZhejiangN / APara tratamento de moxabustão particionada por ervas
Hangzhou Dawen Biological Co. de Hangzhou Dawen, Ltd.N/APara a colheita do espécime
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.P1010-2LPara coleta de amostras
TesouraFornecedor verificado - Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsnzpara a coleção do espécime
seccionando a tecnologiaCo. de Shanghai Saihan, Ltd.LEICA-819-boxPara a preparação da seção de parafina de coloração HE
BarbeadorShenzhen Cordes Electrical Appliance Co., Ltd.N/APara raspar o cabelo de um rato
Cloreto de SódioReagente Químico Co., Ltd.A501218-0001Para coleta de amostras
SacaroseZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.S11055-500gPara desidratação gradiente
Recipiente de isolamento térmicoZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsbwx8lPara desparafinação por seção de parafina
de incorporação de tecidos, de forma retangular, com tampa quebrável.Fornecedor verificado - Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.31050102WPara o tecido da coloração do HE que incorpora
a fita adesiva largaZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.N/APara estabilizar o rato durante o procedimento de tratamento
da coloração

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