Artigo de método

Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

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DOI:

10.3791/66635

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17 de maio de 2024

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1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

Neste artigo

Resumo

O protocolo atual descreve um modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média em ratos que preserva a estrutura anatômica dos vasos cerebrais sem causar danos.

Resumo

O AVC isquêmico é a principal causa de incapacidade e mortalidade a longo prazo entre adultos em todo o mundo. Modelos animais de AVC isquêmico têm contribuído significativamente para a compreensão de seus mecanismos patológicos e para o desenvolvimento de possíveis tratamentos. Atualmente, existem dois métodos comuns envolvendo técnicas de filamento (sutura endovascular) para induzir modelos animais de isquemia cerebral. No entanto, esses métodos têm limitações inerentes, como redução da perfusão sanguínea para o cérebro, danos ao sistema da artéria carótida externa, ingestão prejudicada de alimentos e/ou água e disfunção sensorial da face. Este artigo apresenta um novo método para induzir um modelo de AVC isquêmico em ratos sem comprometer a anatomia vascular cerebral. Neste estudo, a artéria carótida comum (ACC) de ratos Sprague-Dawley foi exposta e uma incisão foi feita. Um filamento foi então inserido através da incisão na artéria carótida interna para ocluir a artéria cerebral média. Após 1,5 h de isquemia induzida, o filamento ocluído foi totalmente removido da artéria carótida interna e da ACC. A incisão na ACC foi posteriormente suturada com pontos microcirúrgicos 11-0 ao microscópio (aumento de 4x). Através da utilização de técnicas microcirúrgicas para reparar o CCA, este estudo desenvolveu com sucesso um método único para induzir um modelo de AVC isquêmico em ratos, preservando a integridade anatômica dos vasos sanguíneos cerebrais.

Introdução

O acidente vascular cerebral, a principal causa de morte e disfunção neurológica de longa duração em adultos em todo o mundo, abrange vários tipos, sendo o acidente vascular cerebral isquêmico responsável por aproximadamente 81,9% dos casos, enquanto a hemorragia cerebral e a hemorragia subaracnóidea representam 14,9% e 3,1%, respectivamente1. O AVC isquêmico geralmente resulta de aterosclerose ou oclusão da artéria cerebral média (ACM), levando à redução do fluxo sanguíneo cerebral local e subsequente dano cerebral. Essa redução no suprimento de nutrientes para as células isquêmicas desencadeia a depleção de energia, causando perda da integridade da membrana, inchaço celular e, eventualmente, lise. Além disso, fatores como aumento do cálcio intracelular, liberação de aminoácidos excitatórios, aumento da produção de radicais livres e ativação de células inflamatórias contribuem para a lesão do tecido cerebral pós-AVC2.

Os objetivos do tratamento do AVC isquêmico são multifacetados: reduzir os danos neurológicos contínuos e diminuir a mortalidade e a incapacidade a longo prazo; prevenir complicações decorrentes da imobilidade e disfunção neurológica; e minimizar o risco de recorrência do AVC. Dada a complexidade da fisiopatologia do AVC isquêmico, um modelo robusto de AVC é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de tratamentos direcionados ao AVC isquêmico.

Atualmente, a oclusão da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo animal comum de AVC isquêmico3. A MCAo é normalmente realizada inserindo um monofilamento com ponta de silicone ou embotado em chama através dos vasos cervicais até atingir a origem da artéria cerebral média (MCA). Em 1986, Koizumi e colegas desenvolveram uma técnica envolvendo a inserção de um monofilamento com ponta de silicone através de uma incisão na artéria carótida comum (ACC), permitindo que ele alcançasse a entrada da ACM e bloqueasse seu fluxo sanguíneo4. Em 1989, o grupo de Longa relatou outro método MCAo que envolvia a introdução de um monofilamento através de uma incisão na artéria carótida externa (ECA). O monofilamento então atravessa a bifurcação da artéria carótida interna (ACI) e ECA antes de atingir o ponto de partida da classe MCA5.

As limitações dos dois métodos existentes para induzir MCAo são evidentes. O método de Koizumi requer o bloqueio permanente da ACC ipsilateral, levando à redução da perfusão da ACM, uma vez que a reperfusão depende apenas do círculo de Willis4. Por outro lado, o método de Longa envolve o corte do ECA, resultando em danos ao sistema ECA e subsequente comprometimento da função muscular facial5. Esse dano pode impactar na ingestão de alimentos e água, bem como causar disfunção sensorial da face, afetando a reabilitação e a avaliação da função neurológica pós-AVC isquêmico6.

O protocolo atual procura abordar essas limitações desenvolvendo um novo método para induzir um modelo de AVC isquêmico sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais. Essa nova abordagem utiliza técnicas microcirúrgicas para reparar o CCA, evitando assim as desvantagens associadas aos métodos anteriores.

Protocolo

O procedimento experimental recebeu aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yantai (Número de Aprovação: YTDX20230410) e aderiu às Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Ratos machos da raça Sprague-Dawley pesando entre 300-350 g foram utilizados para este estudo. Uma lista abrangente dos animais, reagentes e equipamentos usados é fornecida na Tabela de Materiais.

1. Preparação dos animais

  1. Alojar os animais em um ambiente que mantenha um ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura e umidade controladas. Certifique-se de que eles tenham acesso irrestrito a comida e água.

2. Anestesia

  1. Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal com uma mistura contendo cetamina (80 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg).
    NOTA: Incline a cabeça e o corpo dos ratos para baixo. O local da injeção está no quadrante inferior direito do abdômen do animal. Puxe o êmbolo para trás antes de injetar. O volume médio de injeção é de 0,4 mL.
  2. Confirme a indução da anestesia avaliando o reflexo de retirada da pata traseira e o reflexo de piscar. Se a profundidade adequada da anestesia não for alcançada, suplementar com isoflurano durante o procedimento cirúrgico.

3. Procedimento de modelagem isquêmica

  1. Esterilize as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave. Desinfete as mesas cirúrgicas e equipamentos relacionados com etanol 70%.
  2. Prepare o local da cirurgia raspando o pelo ao redor do local da incisão previsto. Desinfetar a pele no sítio cirúrgico três vezes com betadina e etanol a 70%.
  3. Faça uma incisão na linha média no lado ventral, com aproximadamente 1,5 cm de comprimento, e abra a fáscia superficial.
  4. Realize uma dissecção aguda e romba para expor a artéria carótida externa (ECA), a artéria carótida interna (ICA) e a artéria carótida comum (CCA) de acordo com o método descrito anteriormente7.
  5. Coloque três suturas de seda 4-0 ao redor do CCA e outra sutura de seda através do ECA perto da bifurcação do ICA. Amarre um nó deslizante soltável no CCA proximal. Aperte a sutura no CCA distal usando um hemostático para bloquear o fluxo sanguíneo. Amarre frouxamente outro nó corrediço ao redor do CCA durante a sutura para garantir que o vaso não esteja ocluído.
    NOTA: Certifique-se de que o nó corrediço não esteja excessivamente apertado, apenas o suficiente para bloquear o fluxo sanguíneo, pois precisará ser liberado durante a sutura vascular.
  6. Faça uma incisão de 0,5 mm entre a sutura proximal da seda e a sutura do meio na ACC usando uma tesoura.
    NOTA: Certifique-se de que a incisão permite que o filamento (ponta revestida de silicone) entre no CCA.
  7. Introduzir um filamento 4-0 de 3 cm de comprimento (ponta revestida de silicone) no CCA. Aperte as suturas de seda ao redor do CCA para prender o filamento intraluminal e evitar sangramento; em seguida, remova a sutura da CCA distal.
  8. Continue a inserir o filamento no lúmen do MCA, controlando as suturas ao redor do ECA para garantir que o filamento não entre no ECA. O comprimento de inserção é normalmente de 18 mm a 20 mm.
  9. Inicie um cronômetro e registre a hora em que a oclusão começa. Suture a incisão no pescoço com suturas de seda 3-0 e coloque cuidadosamente o animal em uma gaiola de recuperação. Administre 0,5 mL de solução salina normal por via intraperitoneal.

4. Sutura microcirúrgica da ACC

  1. Reanestesiar o rato 1,5 h após a isquemia. Desinfete o local da incisão três vezes com etanol a 70% e reabra a incisão.
  2. Retire suavemente o filamento de oclusão até que a ponta branca fique claramente visível perto da incisão CCA. Coloque um micro grampo horizontalmente próximo ao nó de sutura intraluminal seguro próximo à bifurcação CCA.
    NOTA: Evite clamping a ponta do filamento branco para evitar o descolamento do silicone e subsequente trombose.
  3. Solte o nó de sutura intraluminal seguro e remova completamente o filamento.
  4. Coloque outro micro grampo perto do lado da extremidade do coração do nó CCA proximal. Em seguida, remover o nó de sutura ao redor da CCA proximal.
    NOTA: A colocação adequada das pinças é crucial para elevar os vasos fixos em etapas posteriores para facilitar a sutura microvascular. Coloque grampos horizontalmente nos músculos circundantes para evitar deslizamento.
  5. Enxágue o local da incisão com solução salina normal e seque a área com uma bola de algodão estéril para remover o sangue e obter um campo cirúrgico claro.
  6. Sob um microscópio (ampliação de 4x), suture a incisão CCA usando suturas microcirúrgicas 11-0 em um padrão interrompido, normalmente exigindo dois pontos, dependendo do tamanho da incisão.
  7. Após a sutura, remova os micro grampos de ambas as extremidades do CCA para restaurar o fluxo sanguíneo.
  8. Aplique pressão com uma bola de algodão estéril no local da sutura do CCA por 30 s. Observe o CCA por 2 min para garantir que não ocorra sangramento. Suturar a incisão no pescoço do rato e colocar o animal em uma caixa de cuidados a 35 °C para recuperação da anestesia antes de devolvê-lo à gaiola.
    NOTA: Administrar por via intraperitoneal com meloxicam na dose de 2 mg/kg para analgesia pós-operatória.

5. Coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)

  1. Três dias após a isquemia-reperfusão, eutanasiar os animais sob anestesia profunda com isoflurano a 4% e luxação cervical.
  2. Remova os miolos e corte-os em cortes coronais de 2 mm de espessura usando uma lâmina de bisturi8.
  3. Incube as seções cerebrais com TTC a 2% por 20 min a 37 ° C.
  4. Enxágue as seções cerebrais duas vezes com formalina a 10% e, em seguida, fixe-as com formalina a 10% por 30 minutos em temperatura ambiente.
  5. Capture fotografias digitais de cortes consecutivos e meça quantitativamente as áreas de infarto usando o software Image J.

6. Teste de função neurológica

NOTA: A função neurológica foi avaliada pelo teste de Garcia, seguindo um relatório anterior9.

  1. Avalie a atividade espontânea, a simetria no movimento dos quatro membros, o alongamento da pata dianteira, a escalada, a propriocepção corporal e a resposta ao toque das vibrissas. Atribua pontuações com base nos critérios do teste de Garcia, com uma pontuação máxima de 18 pontos indicando função neurológica normal.

7. Análise estatística

  1. Utilize o GraphPad Prism para realizar análises estatísticas usando o teste t de Student. Expresse os dados como a média ± desvio padrão. Considere-se diferenças entre médias estatisticamente significantes se P < 0,05.

Resultados

O processo de microssutura
O filamento foi retirado próximo à incisão do CCA até que a ponta do filamento branco fosse visível (Figura 1A). Micro grampos foram então colocados no CCA (Figura 1B). Sob microscópio com aumento de 4x, a incisão da ACC foi suturada com suturas microcirúrgicas em padrão interrompido (Figura 1C). Posteriormente, os microclamps foram removidos da ACC, restaurando a estrutura anatômica e o fluxo sanguíneo (Figura 1D).

TTC coloração e taxa de mortalidade
Um total de 12 ratos machos adultos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: sham e modelo (n = 6 em cada grupo). Infelizmente, um animal do grupo simulado morreu de overdose de anestésico e um animal do grupo modelo morreu em 24 horas. Os infartos resultantes de isquemia cerebral foram observados tanto no estriado quanto no córtex (Figura 2A). Aos 3 dias após o AVC isquêmico, a porcentagem total de infarto foi medida em 29,3% ± 1,6% do hemisfério (Figura 2B), com uma taxa de mortalidade de 16,7% após a cirurgia.

Avaliação da função neurológica
Em 1 e 3 dias após o AVC isquêmico, os escores dos grupos modelo diminuíram significativamente em comparação com os dos grupos simulados (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Figura 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Figura 3B, respectivamente).

figure-results-1
Figura 1: O processo de microssutura. (A) O filamento é retirado do CCA. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. (B) A seta preta indica a incisão após a remoção completa do filamento. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. (C) Sob microscópio (ampliado 4x), a incisão da ACC foi suturada com suturas microcirúrgicas 11-0 em um padrão interrompido. As setas azuis indicam os grampos microvasculares. A seta preta indica a incisão suturada. (D) Os micro grampos são removidos e o fluxo sanguíneo do CCA é restaurado. A seta preta indica o local suturado da CCA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Resultados da coloração TTC do modelo de isquemia. (A) Imagens representativas de fatias de cérebro coradas com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) após isquemia cerebral. No tecido vivo, o TTC é enzimaticamente reduzido pelas desidrogenases a 1,3,5-trifenilformazan, que tem uma cor vermelha. Os tecidos nas áreas necróticas permanecem brancos devido à ausência de tal atividade enzimática. (B) Porcentagem de área isquêmica em ratos 3 dias após isquemia cerebral. Em comparação com o grupo Sham, **P < 0,01. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Havia cinco ratos em cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Avaliação da função neurológica. (A) Pontuações de Garcia 1 dia após isquemia cerebral. (B) Escores de Garcia 3 dias após isquemia cerebral. Em comparação com o grupo Sham, **P < 0,01. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Havia cinco ratos em cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A MCAo é um método amplamente utilizado para criar modelos animais de AVC, replicando efetivamente o processo de AVC observado em pacientes, restaurando o fluxo sanguíneo após isquemia 10,11,12. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de AVC isquêmico que permite a reperfusão da ACC sem causar danos à ECA. Após a indução da isquemia, é realizado o reparo microcirúrgico da ACC. Embora a medição direta do fluxo sanguíneo da ACC não tenha sido realizada, os experimentadores observaram pulsação vascular na ACC antes de prosseguir com a reperfusão. Essa técnica preserva a integridade anatômica dos vasos do pescoço, ao mesmo tempo em que se assemelha ao processo de AVC em pacientes. Além disso, avaliações da função neurológica e da área de isquemia cerebral confirmaram a validade do AVC induzido por essa abordagem cirúrgica.

Os modelos de AVC isquêmico descritos anteriormente podem ser afetados por vários fatores. No método de Koizumi et al.4, a reperfusão sanguínea depende fortemente do círculo de Willis devido à ligadura da ACC. No entanto, variações na vasculatura cerebral podem influenciar o volume final do infarto cerebral, potencialmente aumentando a taxa de mortalidade do modelo de AVC devido à baixa perfusão sanguínea13,14. Além disso, a isquemia da ECA pode prejudicar a função dos músculos e nervos faciais, impactando na avaliação de várias funções neurológicas15,16.

O método atual aborda esses desafios por meio de três etapas principais: (1) Manter a incisão do CCA o menor possível, grande apenas o suficiente para a inserção do filamento, reduzindo o tempo e os danos associados à sutura vascular. (2) Colocar pinças microvasculares o mais próximo possível da bifurcação do CCA ao clampear o CCA distal para evitar o clampeamento da ponta do filamento branco, o que pode levar ao descolamento do silicone e trombose. (3) Observar a ACC quanto à retomada da pulsação e ausência de sangramento substancial antes de suturar a incisão cervical na linha média após o reparo vascular.

O método atual tem várias limitações. Em primeiro lugar, existe a possibilidade de formar êmbolos no local da sutura, o que pode levar a mais isquemia cerebral se eles se desprenderem. Esse risco deve ser cuidadosamente considerado e gerenciado em experimentos futuros. Em segundo lugar, o estudo não monitorou o peso corporal dos ratos, o que torna difícil determinar se o método afetou sua ingestão de alimentos. A ingestão de alimentos é um indicador direto das vantagens do método, e sua avaliação pode fornecer informações valiosas. Por fim, o método atual requer proficiência técnica em operações microcirúrgicas, o que pode limitar seu uso generalizado sem treinamento e experiência adequados.

Em resumo, embora o método de modelagem MCAo ofereça alta relevância fisiológica e integridade estrutural, ele vem com limitações que precisam ser abordadas para uma experimentação mais robusta. Preservar a integridade anatômica dos vasos do pescoço e simular de perto os processos de AVC em pacientes são pontos fortes significativos do método. Essa abordagem, sem dúvida, contribuirá significativamente para a pesquisa de AVC isquêmico, melhorando a confiabilidade e a precisão dos modelos experimentais. Em última análise, isso pode levar a menos grupos experimentais necessários para testar os efeitos terapêuticos, resultando em resultados experimentais mais confiáveis.

Divulgações

Os autores não têm nenhum interesse conflitante potencial a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Introdução à Inteligência Estrangeira da Província de Hebei em 2023. Agradecemos a Lisa Kreiner, PhD, de Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), por editar o texto em inglês de um rascunho deste manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% formalinaPequim Labgic Technology Co., Ltd.BL913A
11-0 suturas microcirúrgicasNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3/8 1&vezes;
2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto (TTC)SIGMAT8877
3-0 sutura de sedaNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3-0
isoflurano a 4%   Fornecedor verificado - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.
6-0 sutura de sedaNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.6-0
70% etanolShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.
FilamentoXinong Technologies Co Ltd.2838-A5
Cetamina   Jiangsu Hengrui Farmacêutica Co., Ltd.230613BL
Ratos machos Sprague DawleyJinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.SCXK (Lu) 20190003
MicroclipsShanghai Jinzhong Fábrica de Dispositivos MédicosW40150
MicroscópioZEISSS100 OPMI pico
Caixa de enfermagemFuyi Electrical Appliance Co., Ltd.FYL-YS-100L
xilazinaSIGMAPHR3263
52022110220230408 Beijing

Referências

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