Quantificando a atividade do sistema de secreção de Yersinia pseudotuberculosis tipo III após a falta de ferro e o crescimento anaeróbico

Summary

As bactérias colonizam os tecidos hospedeiros que variam em biodisponibilidade de oxigênio e ferro, mas a maioria das abordagens para estudar bactérias usa meios ricos e aerados. Este protocolo descreve a cultura do patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis sob diferentes concentrações de ferro e tensão de oxigênio, e quantifica a atividade do sistema de secreção de Yersinia tipo III, que é um importante fator de virulência.

Abstract

Um mecanismo chave de virulência para muitos patógenos Gram-negativos é o sistema de secreção tipo III (T3SS), um apêndice em forma de agulha que transloca proteínas efetoras citotóxicas ou imunomoduladoras em células hospedeiras. O T3SS é um alvo para campanhas de descoberta de antimicrobianos, uma vez que é acessível extracelularmente e amplamente ausente de bactérias não patogênicas. Estudos recentes demonstraram que o T3SS de Yersinia e Salmonella é regulado por fatores responsivos ao ferro e ao oxigênio, que são importantes sinais específicos de nicho encontrados durante a infecção de mamíferos. Aqui está descrito um método para a falta de ferro de Yersinia pseudotuberculosis, com subsequente suplementação opcional de ferro inorgânico. Para avaliar o impacto da disponibilidade de oxigênio, esse processo de falta de ferro é demonstrado em condições aeróbicas e anaeróbicas. Finalmente, a incubação das culturas à temperatura do hospedeiro mamífero de 37 ° C induz a expressão de T3SS e permite a quantificação da atividade de Yersinia T3SS visualizando proteínas efetoras liberadas no sobrenadante. As etapas detalhadas aqui oferecem uma vantagem sobre o uso de quelantes de ferro na ausência de falta de ferro, o que é insuficiente para induzir uma fome de ferro robusta, presumivelmente devido aos eficientes sistemas de absorção e eliminação de ferro de Yersinia . Da mesma forma, a vidraria de laboratório de lavagem ácida é detalhada para garantir a remoção do ferro residual, que é essencial para induzir uma forte falta de ferro. Além disso, o uso de um agente quelante é descrito para remover o ferro residual do meio e cultivar as bactérias por várias gerações na ausência de ferro para esgotar os estoques de ferro bacteriano. Ao incorporar protocolos padrão de precipitação de proteínas induzida por ácido tricloroacético, SDS-PAGE e coloração com prata, este procedimento demonstra maneiras acessíveis de medir a atividade do T3SS. Embora este procedimento seja otimizado para Y. pseudotuberculosis, ele oferece uma estrutura para estudos em patógenos com sistemas robustos semelhantes de absorção de ferro. Na era da resistência aos antibióticos, esses métodos podem ser expandidos para avaliar a eficácia de compostos antimicrobianos direcionados ao T3SS em condições relevantes para o hospedeiro.

Introduction

Muitos patógenos Gram-negativos clinicamente relevantes, como Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas e Shigella, codificam o sistema de secreção tipo III (T3SS) para injetar proteínas efetoras nas células hospedeiras¹. Em muitas espécies bacterianas, o T3SS está sob estrito controle regulatório². Por exemplo, a translocação de proteínas efetoras de Yersinia T3SS em células-alvo do hospedeiro é fundamental para subverter os mecanismos de defesa do hospedeiro e permitir a colonização bacteriana dos tecidos do hospedeiro. No entanto, a atividade de Yersinia T3SS é metabolicamente onerosa e pode desencadear o reconhecimento pelos receptores imunes do hospedeiro³. Assim, os reguladores que detectam pistas ambientais específicas controlam a expressão de genes T3SS em muitas espécies bacterianas. Como patógenos como Yersinia experimentam mudanças ambientais durante seu ciclo de infecção que afetam a expressão de fatores críticos de virulência, é importante desenvolver condições laboratoriais que imitem características salientes de nichos hospedeiros ocupados por patógenos bacterianos. Especificamente, a tensão de oxigênio e a disponibilidade de ferro diferem entre vários locais de tecido de maneira espaço-temporal e afetam a expressão de genes de virulência, como o T3SS ^4,5,6. Portanto, o objetivo deste método é avaliar como o oxigênio e o ferro impactam a expressão do Yersinia T3SS. Isso fornecerá informações sobre a dinâmica da interação patógeno-hospedeiro.

O método descrito aqui detalha como cultivar Yersinia pseudotuberculosis aeróbica e anaeróbia, bem como como esgotar os estoques de ferro de Yersinia durante o crescimento aeróbico ou anaeróbico. Existem algumas considerações importantes destacadas aqui sobre o sucesso da cultura de bactérias sob essas condições variáveis. Primeiro, a cultura anaeróbica requer suplementação adicional de glicose, uma modificação que é observada na receita da mídia. Em segundo lugar, uma vez que Y. pseudotuberculosis emprega sideróforos e outros sistemas de absorção de ferro que podem eliminar o ferro do meio ambiente de forma robusta, atenção especial é dedicada a garantir que os meios de cultura e vidraria de laboratório estejam o mais livres possível de ferro⁷. Estudos anteriores usaram quelantes de ferro, como o dipiridil, para esgotar o ferro de culturas bacterianas ricas em meios para imitar a falta de ferro ^8,9. No entanto, o esgotamento dos estoques de ferro de Yersinia para induzir a falta de ferro requer a remoção de ferro residual em vidraria e meios, bem como o crescimento prolongado na ausência de ferro. Este protocolo detalha como lavar com ácido os vidros e quelar meios para remover o ferro residual, além de cultivar as bactérias por várias gerações para garantir a falta completa de ferro. A falta de ferro pode ser garantida medindo os níveis relativos de transcrição de genes responsivos ao ferro bem caracterizados em todas as condições, conforme demonstrado aqui com yfeA e bfd.

O ponto culminante deste protocolo demonstra como precipitar proteínas efetoras T3SS secretadas de cada uma dessas condições, tratando o sobrenadante da cultura com ácido tricloroacético (TCA) e visualizando as proteínas secretadas por meio de SDS-PAGE. Finalmente, a atividade relativa do T3SS é avaliada visualizando proteínas secretadas por meio da coloração de prata e quantificando os níveis relativos de proteínas efetoras do T3SS, conhecidas como proteínas externas de Yersinia (Yops) ¹⁰ .

Os ensaios de atividade do T3SS geralmente utilizam anticorpos específicos para detectar os níveis de proteína efetora do T3SS no sobrenadante da cultura. No entanto, os anticorpos western blotting para proteínas efetoras T3SS geralmente não estão disponíveis comercialmente. Portanto, atenção especial foi dada para garantir que a visualização final da atividade do T3SS neste método não exija anticorpos específicos e, em vez disso, possa alavancar a coloração de prata, que permite a visualização de todas as proteínas secretadas. Embora este método seja especificamente adaptado e otimizado para Y. pseudotuberculosis, ele pode ser adaptado a outras espécies bacterianas, embora as condições exatas do meio e os tempos de incubação variem.

Protocol

Os detalhes dos reagentes, composição do meio, sequências de primers e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho experimental geral.

1. Preparação de vidraria lavada com ácido e mídia M9 quelatada

NOTA: Antes de começar, consulte a seção de materiais para obter os reagentes e receitas exatos que serão usados. O meio M9 foi usado pela primeira vez para ensaios de Yersinia T3SS em Cheng et ^al.11.

1. Despeje 100 mL de HCl 6 N em um frasco de vidro de 250 mL.
   CUIDADO: O HCl é extremamente perigoso; Certifique-se de que as precauções apropriadas sejam tomadas ao manusear esta substância.
2. Feche a boca do recipiente de vidro com uma rolha de vidro e gire cuidadosamente o frasco por 1 min para distribuir completamente o HCl, mudando ocasionalmente de direção.
3. Descarte o HCl 6 N adequadamente.
4. Enxágue o recipiente de vidro adicionando 100 mL de H₂O deionizado, selando a boca, agitando por 20 s e despejando a água.
5. Repita a etapa de enxágue por um total de 3 vezes.
6. Deixe secar ao ar. Autoclave para esterilizar.
7. Para quelar o meio, misture os componentes M9 com o reagente quelante e mexa com uma barra de agitação magnética em temperatura ambiente por ~ 18 h. Filtre-esterilize e adicione MgSO₄ a uma concentração final de 1 mM.

2. Cultura de Y. pseudotuberculosis sob diferentes níveis de ferro e tensão de oxigênio

1. Streak Y. pseudotuberculosis (cepa IP2666pIB1 é usada neste estudo) em placas de ágar Lysogeny Broth (LB) e incubar à temperatura ambiente.
   NOTA: A incubação de Yersinia a 37 ° C, particularmente em meio com baixo teor de cálcio, leva à atividade do T3SS, interrupção do crescimento e, finalmente, seleciona a perda do plasmídeo para a regra de Yersinia vi(pYV) que codifica o T3SS¹². Portanto, este protocolo usa incubação de Yersinia a 26 ° C até que a atividade do T3SS precise ser medida.
2. Após 48 h, uma vez formadas colônias visíveis, inocule 4 mL de meio M9 contendo 0,2% de glicose, 1 mg / L de FeSO_{4,7H 2}O e suplementado com casaminoácidos (referidos aqui como meio M9) de uma única colônia isolada e cultura durante a noite a 26 ° C com aeração a 250 rpm por aproximadamente 18 h.
   NOTA: Use vidraria lavada com ácido começando com a etapa seguinte e seguindo em frente.
3. Subcultura em meio M9 quelatado seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: Para todas as etapas subsequentes, o meio M9 com glicose a 0,9% é usado em vez da glicose padrão a 0,2%.
   1. Usando um espectrofotômetro, medir a densidade óptica (OD₆₀₀) da cultura noturna.
   2. Diluir a cultura durante a noite para um valor de OD₆₀₀ de 0,1 em um total de 14 mL de meio M9 quelatado estéril contendo 0,9% de glicose e sem FeSO_{4,7H 2}O em um frasco lavado com ácido de 250 mL sem suplementação de ferro.
   3. Incubar durante 8 h a 26 °C com arejamento a 250 rpm.
4. Subcultura em culturas aeróbicas e anaeróbicas em paralelo.
   1. Meça o OD₆₀₀ das culturas em crescimento.
   2. Para continuar a incubação aeróbica, subcultive as culturas em crescimento para um valor OD₆₀₀ de 0,1 em 14 mL de meio estéril quelatado M9 contendo 0,9% de glicose e sem FeSO_{4,7H 2}O em um frasco lavado com ácido de 250 mL e cultura com aeração a 26 ° C por 12 h sem suplementação de ferro.
   3. Para cultura anaeróbica, subcultive para um valor OD₆₀₀ de 0,1 em 14 mL de meio M9 quelatado estéril em dois tubos de vidro lavados com ácido. No primeiro tubo, adicione FeSO_{4.7H 2}O esterilizado por filtro (usando membrana de polietersulfona de 0,22 μm) para uma concentração final de 1 mg / L (referido como "alto teor de ferro"). No segundo tubo, adicione FeSO_{4.7H 2}O para uma concentração final de 0.01 mg/L (referida como "baixo teor de ferro"). Isso pode ser feito usando uma solução estoque de FeSO_{4.7H 2}O a 10 mg / mL. Incubar ambos os tubos anaeróbia em uma câmara anaeróbica à temperatura ambiente por 12 h.
      NOTA: 1 mg / L FeSO_{4.7H 2}O fornece condições repletas de ferro para o crescimento robusto de Yersinia. Por outro lado, a adição de apenas 0,01 mg / L de FeSO 4,7H₂O a culturas anaeróbicas garante crescimento suficiente em condições anaeróbicas, mas ainda permite respostas de falta de ferro, enquanto as culturas aeróbicas são cultivadas por 12 h na ausência de qualquer adição de ferro para estimular as respostas de falta de ferro antes da estimulação da atividade do T3SS.
5. Induza a atividade do sistema de secreção tipo III.
   1. Mude as culturas anaeróbicas para 37 ° C e continue a incubação anaeróbica por 4 h para induzir o T3SS.
   2. Meça o OD₆₀₀ da cultura de crescimento aeróbico.
   3. Em dois frascos lavados com ácido, subcultive as culturas de crescimento aeróbico para um valor OD₆₀₀ de 0,2 em 14 mL de meio M9 quelatado estéril. No primeiro balão, adicionar FeSO_{4,7H 2}O esterilizado por filtro para uma concentração final de 1 mg/l. No segundo balão, adicionar FeSO 4,7H₂O para uma concentração final de 0,01 mg/l. Incubar ambos os balões com arejamento a 26 °C a 250 rpm durante 2 h.
   4. Após 2 h, deslocar as culturas aeróbias para 37 °C com arejamento a 250 rpm e incubar durante 4 h para induzir o T3SS.

3. Precipitação de ácido tricloroacético (TCA) de proteínas efetoras T3SS

1. Quando a incubação anaeróbica estiver concluída, medir a DO₆₀₀ das culturas.
2. Normalize todas as amostras anaeróbicas para obter a mesma massa celular (consulte o exemplo fornecido na Tabela 1). Para cultura anaeróbica, geralmente espere um valor OD₆₀₀ de ~ 0,5 em culturas carentes de ferro e ~ 1 para culturas repletas de ferro. Nesse caso, use 6 mL das culturas carentes de ferro e 3 mL das culturas repletas de ferro.
   NOTA: A cultura restante pode ser usada para outros fins, como a coleta de RNA total e o uso de PCR quantitativo para medir os níveis de estado estacionário do mRNA alvo (não descrito aqui).
3. Transfira os volumes normalizados de cada cultura para tubos de 15 mL.
4. Para controlar a eficiência da precipitação de proteínas secretadas, adicione 4 μL de albumina sérica bovina (BSA) 0,5 mg / mL em cada tubo.
5. Culturas de pellets a 3200 x g por 15 min a 4 °C.
6. Conecte um filtro de PVDF de 0,22 μm a uma seringa de 10 mL e filtre o sobrenadante de cada cultura peletizada em um tubo novo de 15 mL.
   NOTA: Esta etapa de filtração minimiza as chances de transferência de células bacterianas inteiras, o que resultaria em proteínas citoplasmáticas indesejadas na amostra.
7. Adicionar 10% do volume sobrenadante de 6,1 N TCA a cada amostra.
8. Vórtice vigorosamente por 1 min. Incube os tubos no gelo em uma câmara fria a 4 °C durante a noite.
   NOTA: A duração da incubação pode ser otimizada com base na necessidade. Apenas uma incubação de 1 h pode funcionar para condições ou cepas em que a secreção é robusta.
9. Repetir as etapas de recolha de pellets e precipitação de TCA com as culturas aeróbias uma vez concluída a incubação de 4 h.
   NOTA: Normalize as culturas aeróbicas peletizando volumes com massa celular equivalente.
10. Adicione 2 mL de cada amostra a um tubo novo de 2 mL e centrifugue a 21.000 x g por 15 min a 4 ° C.
11. Aspire o sobrenadante usando um acessório de vácuo e tome cuidado para não tocar no fundo ou nas laterais do tubo.
    NOTA: O pellet pode ser difícil de visualizar e pode aparecer como uma névoa ao longo do comprimento do tubo.
12. Repita as etapas 3.10 e 3.11 até que todo o conteúdo de cada reação de precipitação seja precipitado em um único tubo de 2 mL. Isso pode levar três ou quatro etapas sequenciais de centrifugação, mas permite a concentração de todas as proteínas secretadas de cada amostra em um tubo de 2 mL.
13. Para lavar os pellets, adicione suavemente 1 mL de acetona 100% gelada em cada tubo. Para evitar a perda de amostra, não ressuspenda e não toque nas laterais do tubo.
14. Centrifugue as amostras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
15. Aspirar o sobrenadante e ter cuidado para não tocar no fundo ou nas laterais do tubo.
16. Repita as etapas de lavagem com acetona gelada 3.13 e 3.14.
17. Depois de aspirar o sobrenadante pela última vez, abra os tubos e deixe o pellet secar completamente na bancada por aproximadamente 1 h.
18. Adicione 50 μL da solução FSB: DTT a cada amostra seca. Para evitar a perda de proteína, não ressuspenda.
19. Vortex completamente cada amostra por 1 min, garantindo que a solução FSB: DTT cubra as paredes de todo o tubo. Isso pode ser otimizado usando um acessório de vórtice capaz de segurar vários tubos ao mesmo tempo.
20. Ferva as amostras a 95 °C durante 15 min.
21. Centrifugar brevemente as amostras durante 30 s à velocidade máxima à temperatura ambiente.
22. Conservar a -80 °C até utilização futura.

4. SDS-PAGE e coloração de prata para visualizar proteínas efetoras T3SS

1. Carregue 15 μL de cada amostra anaeróbica e 10 μL de cada amostra aeróbica em um gel SDS-PAGE a 12,5%, juntamente com 3 μL de um padrão não corado disponível comercialmente como escada.
2. Execute o gel por cerca de 90 min a 100 V. Essas configurações podem variar dependendo do aparelho usado.
3. Siga o protocolo de coloração de prata seguindo as instruções do fabricante, resultando em um gel, conforme mostrado na Figura 2.

5. Quantificando a atividade relativa do T3SS

1. Posicione o gel no sistema de imagem, certificando-se de que todas as bandas destinadas à quantificação estejam no quadro da imagem.
   NOTA: O peso molecular da BSA é de ~ 66 kDa, enquanto o peso molecular da proteína efetora T3SS YopE é de ~ 23 kDa.
2. No software, selecione todas as bandas YopE em todos os poços.
3. Defina a banda YopE de referência para o sample apropriado.
4. Exporte os valores de quantificação relativos calculados pelo software para todas as bandas YopE.
5. Voltando ao software, selecione todas as bandas BSA em todos os poços.
6. Defina a banda BSA de referência para garantir que ela seja da mesma amostra que a banda YopE de referência.
7. Exporte os valores de quantificação relativos calculados pelo software para todas as bandas BSA.
8. Para calcular os níveis de expressão YopE relativos, divida o valor da quantidade relativa YopE pelo valor da quantidade relativa BSA para cada amostra.

Results

Este método permite a comparação relativa de Yops secretados em várias condições relativas a uma condição de referência de interesse. O fluxo de trabalho experimental geral é representado na Figura 1. A Tabela 1 mostra uma representação de como a normalização da cultura de células normalmente ocorreria no caso de cada condição de cultura e o volume de TCA que seria adicionado a cada sobrenadante. Aqui, resultados representativos são mostrados usando Y. pseudotuberculosis de tipo selvagem (WT) IP2666pIB1, bem como dois mutantes congênitos, ΔyscNU e ΔyopE. O mutante ΔyopE é usado como um controle sem YopE, enquanto o mutante ΔyscNU é usado como um controle negativo T3SS completo, pois é incapaz de montar um T3SS funcional^13,14. Uma imagem representativa de um gel SDS-PAGE a 12,5% corado de prata contendo as proteínas secretadas é representada na Figura 2. Conforme descrito acima, cada amostra continha BSA enriquecida como controle para a eficiência da precipitação de proteínas. Ao analisar os dados, os conjuntos de dados anaeróbicos e aeróbicos devem ser tratados como conjuntos de dados independentes, uma vez que cada um foi normalizado separadamente. Nas amostras anaeróbicas, ~ 38 vezes mais YopE estava presente nas amostras com baixo teor de ferro em relação às amostras com alto teor de ferro, consistente com resultados anteriores^15,16. Nas amostras aeróbias, uma quantidade semelhante de YopE secretado foi observada em amostras com baixo e alto teor de ferro, consistente com resultados anteriores¹⁶. Geralmente, pelo menos três réplicas biológicas de cada condição são usadas para estabelecer significância estatística.

Para confirmar que este protocolo resulta em falta de ferro adequada, a análise de qPCR foi conduzida nos genes responsivos ao ferro yfeA e bfd na cepa do tipo selvagem em todas as condições. YfeA é a proteína de ligação periplasmática de um sistema de transporte ABC responsável pelo transporte de ferro, enquanto Bfd é uma ferredoxina associada à bacterioferritina envolvida na mobilização de estoques de ferro 17,18,19,20. O RNA foi isolado conforme descrito anteriormente²¹ e, como esperado, yfeA e bfd foram significativamente regulados positivamente em condições de depleção de ferro em relação a condições repletas de ferro, tanto aeróbia quanto anaeróbia, conforme mostrado na Figura 3. Além disso, quantificamos os níveis de estado estacionário de mRNA de yopE usando qPCR para confirmar que os resultados observados para YopE relativo no nível de proteína foram consistentes com os níveis de transcrição de yopE (ver Figura 3).

Finalmente, como as bactérias são propensas a lisar em condições estressantes de cultura, era importante mostrar que as etapas deste protocolo não resultam em lise bacteriana que possa confundir os resultados. Para confirmar isso, as amostras de sobrenadantes precipitadas por TCA foram submetidas a western blotting e sondadas para YopE e RpoA, uma subunidade da RNA polimerase e uma proteína citoplasmática. Conforme mostrado na Figura 4, embora o padrão de expressão de YopE tenha seguido o mostrado na Figura 3, não houve evidência de RpoA presente nos sobrenadantes da amostra, sugerindo que não havia lise observável que liberasse RpoA citoplasmático no sobrenadante.

Figura 1: Fluxo de trabalho experimental para o cultivo de Yersinia pseudotuberculosis sob disponibilidade variável de ferro e oxigênio. Representação gráfica das etapas de cultura. Observe que os copos lavados com ácido devem ser usados a partir do dia 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados do gel SDS-PAGE 12,5% corado com prata de proteína precipitada por TCA de sobrenadantes de cultura. Os sobrenadantes de cultura precipitados foram carregados em um gel SDS-PAGE a 12,5% e corados com prata. (A) Perfil de secreção de cepas WT, ΔyscNU e ΔyopE cultivadas anaeróbia. Valores relativos representativos de YopE normalizados para a amostra anaeróbica WT repleta de ferro. (B) Perfil de secreção de cepas WT,Δ yscNU e ΔyopE cultivadas aeróbicas. Valores relativos representativos de YopE normalizados para a amostra aeróbica WT repleta de ferro. As setas brancas indicam YopE (~23 kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os níveis relativos de mRNA de genes responsivos ao ferro demonstram a falta de ferro. O RNA foi isolado de WT Y. pseudotuberculosis cultivado nas condições descritas na Figura 1. qPCR foi usado para medir a expressão relativa dos níveis de yfeA, bfd e yopE normalizados para 16S rRNA em condições anaeróbicas (AC) e aeróbicas (DF). **** p < 0,0001 conforme determinado por um teste t não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A falta de RpoA citoplasmático em amostras sobrenadantes demonstra a falta de lise celular em condições de cultura. 5 μL de sobrenadantes precipitados de (A) amostras anaeróbicas e (B) aeróbicas da Figura 3 foram executados em um gel SDS-PAGE a 12,5% junto com um controle de pellets. As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF para western blotting. A membrana foi cortada e a metade superior sondou RpoA usando um anticorpo anti-RpoA, e a metade inferior sondou YopE usando um anticorpo anti-YopE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(UMA)
ANAERÓBIO
Condição	OD	Volume a Coletar (mL)	Volume de TCA 6,1 N adicionado ao Sup (mL)
WT Baixo Ferro	0.5	6	0.6
WT Ferro Alto	1	3	0.3
(B)
AERÓBICO
Condição	OD	Volume a Coletar (mL)	Volume de TCA 6,1N adicionado ao Sup (mL)
WT Baixo Ferro	0.9	6	0.6
WT Ferro Alto	1.4	3.857	0.386

Tabela 1: Fluxo de trabalho de coleta de amostra representativa. No dia 5, (A) uma vez que a incubação de 4 h a 37 ° C esteja completa para as amostras anaeróbicas, 6 mL da amostra com o menor valor de OD₆₀₀ foram coletados e o restante dos volumes de amostra foram normalizados de acordo. Após a filtragem do sobrenadante, foi adicionado TCA 6,1 N. (B) Uma vez que as incubações aeróbicas (2 h a 26 ° C e 4 h a 37 ° C) foram concluídas, 6 mL da amostra com o menor valor de OD₆₀₀ foram coletados e o restante dos volumes de amostra foram normalizados de acordo. Após a filtragem do sobrenadante, foi adicionado TCA 6,1 N.

Discussion

O T3SS é um importante fator de virulência em muitas bactérias patogênicas; Portanto, o desenvolvimento de técnicas laboratoriais para estudar sua regulação é importante para a compreensão da patogênese e desenvolvimento de potenciais terapêuticas¹. Ferro e oxigênio são conhecidos por serem importantes pistas do hospedeiro detectadas por patógenos bacterianos para regular a expressão de T3SS⁵; portanto, este método apresenta uma estratégia para cultivar Y. pseudotuberculosis em condições anaeróbicas ou aeróbicas, com falta ou reposição de ferro, e demonstra como quantificar a atividade relativa do T3SS nessas diferentes condições, avaliando as quantidades relativas dos níveis secretados de proteína efetora YopE T3SS.

Embora o fluxo de trabalho para este experimento seja relativamente simples, existem alguns pontos que devem ser considerados de perto para otimizar os resultados. Durante a etapa de precipitação de proteínas mediada por TCA, é importante evitar aspirar o pellet de proteína, que pode ser difícil de ver. Tomar precauções extras para não permitir que a ponta do aspirador toque nas paredes ou no fundo do tubo é fundamental. Além disso, ao lidar com cepas mutantes com um nível mais baixo de atividade de T3SS, é aconselhável coletar uma amostra maior para processar. Por fim, se as pistas parecerem manchadas após o processamento da amostra e a coloração do gel em vez de produzir bandas distintas, isso pode ser devido à lise celular durante a cultura ou ao transporte de bactérias inteiras do pellet para a fração sobrenadante. Neste caso, o experimento deve ser repetido e mais cuidado deve ser tomado para evitar a retirada do pellet ao remover o sobrenadante. É importante notar que este protocolo pode não ser sensível o suficiente para detectar proteínas que são secretadas em quantidades muito baixas, caso em que outros métodos de detecção podem precisar ser empregados. Além disso, como muitos agentes quelantes removem cátions divalentes que não sejam ferro e magnésio do meio, outros cátions divalentes podem ser adicionados de volta ao meio após a quelação para determinar seu efeito na secreção.

Outro ponto importante a ser considerado nesses experimentos é a propensão dos sais no meio M9 a precipitar, resultando em variabilidade entre os lotes experimentais. Para mitigar esse problema, é possível adicionar MgSO₄ esterilizado por filtro ao meio imediatamente antes da cultura.

No geral, esses métodos fornecem uma estrutura robusta para quantificar a atividade relativa de Yersinia T3SS medindo os níveis de proteína. Juntamente com abordagens paralelas que visam avaliar a expressão de T3SS, os métodos apresentados aqui permitem uma compreensão abrangente da dinâmica de T3SS em resposta a pistas ambientais relevantes para o hospedeiro. Este protocolo também pode ser adaptado a outras bactérias que podem ser cultivadas em um meio definido onde uma fonte de ferro pode ser omitida e para aplicações onde a medição de proteínas secretadas é pertinente à questão científica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de ponta Luer-Lok de 10 mL	BD	301029
10x SDS Running Buffer		Base caseira	de 0,25 M Tris, 1,92 M de glicina, 1% SDS em volume de 1 L
12,5% SDS-Page Gel	caseiro de
15 mL de tubos de cultura	Falcon	352059	Para a noite inicial
Tubos Falcon de 15 mL	Falcom	352196	Para coleta de sobrenadante
Frasco de cultura de 250 mL	Belco	251000250
Sistema de filtro de 500 mL	Corning	431097
6 N Solução de ácido clorídrico	Fisher Scientific	7732185
Acetona	Fisher Chemical	A949-4	4 L
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging System	Bio Rad	Número do modelo: Universal Hood III
Tubos de cultura de vidro borosilicato	Fisherbrand	14-961-34	Para cultura anaeróbica
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-1253
Chelex M9 +0,9% Mídia de glicose	Caseiro		6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1% de casaminoácidos, 0,9% dextrose, 0,0005% tiamina, 5 g/L de resina Chelex 100. Agite o meio por 18 h em temperatura ambiente, filtre usando uma unidade de filtração Corning de 500 mL e, em seguida, adicione MgSO4 para solução 1 mM de MgSO4 final
Tampão de amostra final (FSB)	Feito em		0,1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% de glicerol, 0,2% de azul de bromofenol
FSB: Solução DTT	Feito em		FSB+0.2M DTT
Image Lab Software	Software Bio Rad	https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z
Bloco de calor Isotemp	de	Fisher Scientific
LB Feito	em casa		10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, 15 g de ágar em 1 L de volume total. Mídia de glicose autoclavada
M9 + 0,2%	Home made		6 g / L Na2< / sub>HPO4< / sub>, 3 g / L KH2< / sub>PO4< / sub>, 0,5 g / L NaCl, 1 g / L NH4< / sub>Cl, 1 mM de MgSO4, 1 mg/L de FeSO47H2O, 1% de casaminoácidos, 0,2% de dextrose, 0,0005% de tiamina
Acessório de filtro Millex-GP PES 0.22um para seringa	Millipore	SLGPR33RS	Para filtração FeSO47H2O
Acessório de filtro Millex-GV PVDF 0.22um para seringa	Millipore	SLGVR33RS	Para filtração sobrenadante
Precision Plus Protein Unstained Standard	Bio Rad	1610363
SDS-PAGE Aparelho de Gel	Bio Rad	Número do Modelo: Mini PROTEAN Tetra Cell
Kit de Coloração SilverXpress Silver	Invitrogen	LC6100
The BellyDancer Shaker	IBI Scientific	BDRAA1155
Solução de ácido tricloroacético 6.1N	Sigma Aldrich	T0699
	Coy Lab Products		https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Primer sequences
yfeA para a frente - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverso - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd para a frente - ccagcatcagccccatacag
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