É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Quantificando a atividade do sistema de secreção de Yersinia pseudotuberculosis tipo III após a falta de ferro e o crescimento anaeróbico

1.4K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66642

⸱

31 de maio de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

Neste artigo

Resumo

As bactérias colonizam os tecidos hospedeiros que variam em biodisponibilidade de oxigênio e ferro, mas a maioria das abordagens para estudar bactérias usa meios ricos e aerados. Este protocolo descreve a cultura do patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis sob diferentes concentrações de ferro e tensão de oxigênio, e quantifica a atividade do sistema de secreção de Yersinia tipo III, que é um importante fator de virulência.

Resumo

Um mecanismo chave de virulência para muitos patógenos Gram-negativos é o sistema de secreção tipo III (T3SS), um apêndice em forma de agulha que transloca proteínas efetoras citotóxicas ou imunomoduladoras em células hospedeiras. O T3SS é um alvo para campanhas de descoberta de antimicrobianos, uma vez que é acessível extracelularmente e amplamente ausente de bactérias não patogênicas. Estudos recentes demonstraram que o T3SS de Yersinia e Salmonella é regulado por fatores responsivos ao ferro e ao oxigênio, que são importantes sinais específicos de nicho encontrados durante a infecção de mamíferos. Aqui está descrito um método para a falta de ferro de Yersinia pseudotuberculosis, com subsequente suplementação opcional de ferro inorgânico. Para avaliar o impacto da disponibilidade de oxigênio, esse processo de falta de ferro é demonstrado em condições aeróbicas e anaeróbicas. Finalmente, a incubação das culturas à temperatura do hospedeiro mamífero de 37 ° C induz a expressão de T3SS e permite a quantificação da atividade de Yersinia T3SS visualizando proteínas efetoras liberadas no sobrenadante. As etapas detalhadas aqui oferecem uma vantagem sobre o uso de quelantes de ferro na ausência de falta de ferro, o que é insuficiente para induzir uma fome de ferro robusta, presumivelmente devido aos eficientes sistemas de absorção e eliminação de ferro de Yersinia . Da mesma forma, a vidraria de laboratório de lavagem ácida é detalhada para garantir a remoção do ferro residual, que é essencial para induzir uma forte falta de ferro. Além disso, o uso de um agente quelante é descrito para remover o ferro residual do meio e cultivar as bactérias por várias gerações na ausência de ferro para esgotar os estoques de ferro bacteriano. Ao incorporar protocolos padrão de precipitação de proteínas induzida por ácido tricloroacético, SDS-PAGE e coloração com prata, este procedimento demonstra maneiras acessíveis de medir a atividade do T3SS. Embora este procedimento seja otimizado para Y. pseudotuberculosis, ele oferece uma estrutura para estudos em patógenos com sistemas robustos semelhantes de absorção de ferro. Na era da resistência aos antibióticos, esses métodos podem ser expandidos para avaliar a eficácia de compostos antimicrobianos direcionados ao T3SS em condições relevantes para o hospedeiro.

Introdução

Muitos patógenos Gram-negativos clinicamente relevantes, como Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas e Shigella, codificam o sistema de secreção tipo III (T3SS) para injetar proteínas efetoras nas células hospedeiras1. Em muitas espécies bacterianas, o T3SS está sob estrito controle regulatório2. Por exemplo, a translocação de proteínas efetoras de Yersinia T3SS em células-alvo do hospedeiro é fundamental para subverter os mecanismos de defesa do hospedeiro e permitir a colonização bacteriana dos tecidos do hospedeiro. No entanto, a atividade de Yersinia T3SS é metabolicamente onerosa e pode desencadear o reconhecimento pelos receptores imunes do hospedeiro3. Assim, os reguladores que detectam pistas ambientais específicas controlam a expressão de genes T3SS em muitas espécies bacterianas. Como patógenos como Yersinia experimentam mudanças ambientais durante seu ciclo de infecção que afetam a expressão de fatores críticos de virulência, é importante desenvolver condições laboratoriais que imitem características salientes de nichos hospedeiros ocupados por patógenos bacterianos. Especificamente, a tensão de oxigênio e a disponibilidade de ferro diferem entre vários locais de tecido de maneira espaço-temporal e afetam a expressão de genes de virulência, como o T3SS 4,5,6. Portanto, o objetivo deste método é avaliar como o oxigênio e o ferro impactam a expressão do Yersinia T3SS. Isso fornecerá informações sobre a dinâmica da interação patógeno-hospedeiro.

O método descrito aqui detalha como cultivar Yersinia pseudotuberculosis aeróbica e anaeróbia, bem como como esgotar os estoques de ferro de Yersinia durante o crescimento aeróbico ou anaeróbico. Existem algumas considerações importantes destacadas aqui sobre o sucesso da cultura de bactérias sob essas condições variáveis. Primeiro, a cultura anaeróbica requer suplementação adicional de glicose, uma modificação que é observada na receita da mídia. Em segundo lugar, uma vez que Y. pseudotuberculosis emprega sideróforos e outros sistemas de absorção de ferro que podem eliminar o ferro do meio ambiente de forma robusta, atenção especial é dedicada a garantir que os meios de cultura e vidraria de laboratório estejam o mais livres possível de ferro7. Estudos anteriores usaram quelantes de ferro, como o dipiridil, para esgotar o ferro de culturas bacterianas ricas em meios para imitar a falta de ferro 8,9. No entanto, o esgotamento dos estoques de ferro de Yersinia para induzir a falta de ferro requer a remoção de ferro residual em vidraria e meios, bem como o crescimento prolongado na ausência de ferro. Este protocolo detalha como lavar com ácido os vidros e quelar meios para remover o ferro residual, além de cultivar as bactérias por várias gerações para garantir a falta completa de ferro. A falta de ferro pode ser garantida medindo os níveis relativos de transcrição de genes responsivos ao ferro bem caracterizados em todas as condições, conforme demonstrado aqui com yfeA e bfd.

O ponto culminante deste protocolo demonstra como precipitar proteínas efetoras T3SS secretadas de cada uma dessas condições, tratando o sobrenadante da cultura com ácido tricloroacético (TCA) e visualizando as proteínas secretadas por meio de SDS-PAGE. Finalmente, a atividade relativa do T3SS é avaliada visualizando proteínas secretadas por meio da coloração de prata e quantificando os níveis relativos de proteínas efetoras do T3SS, conhecidas como proteínas externas de Yersinia (Yops) 10 .

Os ensaios de atividade do T3SS geralmente utilizam anticorpos específicos para detectar os níveis de proteína efetora do T3SS no sobrenadante da cultura. No entanto, os anticorpos western blotting para proteínas efetoras T3SS geralmente não estão disponíveis comercialmente. Portanto, atenção especial foi dada para garantir que a visualização final da atividade do T3SS neste método não exija anticorpos específicos e, em vez disso, possa alavancar a coloração de prata, que permite a visualização de todas as proteínas secretadas. Embora este método seja especificamente adaptado e otimizado para Y. pseudotuberculosis, ele pode ser adaptado a outras espécies bacterianas, embora as condições exatas do meio e os tempos de incubação variem.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes, composição do meio, sequências de primers e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho experimental geral.

1. Preparação de vidraria lavada com ácido e mídia M9 quelatada

NOTA: Antes de começar, consulte a seção de materiais para obter os reagentes e receitas exatos que serão usados. O meio M9 foi usado pela primeira vez para ensaios de Yersinia T3SS em Cheng et al.11.

  1. Despeje 100 mL de HCl 6 N em um frasco de vidro de 250 mL.
    CUIDADO: O HCl é extremamente perigoso; Certifique-se de que as precauções apropriadas sejam tomadas ao manusear esta substância.
  2. Feche a boca do recipiente de vidro com uma rolha de vidro e gire cuidadosamente o frasco por 1 min para distribuir completamente o HCl, mudando ocasionalmente de direção.
  3. Descarte o HCl 6 N adequadamente.
  4. Enxágue o recipiente de vidro adicionando 100 mL de H2O deionizado, selando a boca, agitando por 20 s e despejando a água.
  5. Repita a etapa de enxágue por um total de 3 vezes.
  6. Deixe secar ao ar. Autoclave para esterilizar.
  7. Para quelar o meio, misture os componentes M9 com o reagente quelante e mexa com uma barra de agitação magnética em temperatura ambiente por ~ 18 h. Filtre-esterilize e adicione MgSO4 a uma concentração final de 1 mM.

2. Cultura de Y. pseudotuberculosis sob diferentes níveis de ferro e tensão de oxigênio

  1. Streak Y. pseudotuberculosis (cepa IP2666pIB1 é usada neste estudo) em placas de ágar Lysogeny Broth (LB) e incubar à temperatura ambiente.
    NOTA: A incubação de Yersinia a 37 ° C, particularmente em meio com baixo teor de cálcio, leva à atividade do T3SS, interrupção do crescimento e, finalmente, seleciona a perda do plasmídeo para a regra de Yersinia vi(pYV) que codifica o T3SS12. Portanto, este protocolo usa incubação de Yersinia a 26 ° C até que a atividade do T3SS precise ser medida.
  2. Após 48 h, uma vez formadas colônias visíveis, inocule 4 mL de meio M9 contendo 0,2% de glicose, 1 mg / L de FeSO4,7H 2O e suplementado com casaminoácidos (referidos aqui como meio M9) de uma única colônia isolada e cultura durante a noite a 26 ° C com aeração a 250 rpm por aproximadamente 18 h.
    NOTA: Use vidraria lavada com ácido começando com a etapa seguinte e seguindo em frente.
  3. Subcultura em meio M9 quelatado seguindo as etapas abaixo.
    NOTA: Para todas as etapas subsequentes, o meio M9 com glicose a 0,9% é usado em vez da glicose padrão a 0,2%.
    1. Usando um espectrofotômetro, medir a densidade óptica (OD600) da cultura noturna.
    2. Diluir a cultura durante a noite para um valor de OD600 de 0,1 em um total de 14 mL de meio M9 quelatado estéril contendo 0,9% de glicose e sem FeSO4,7H 2O em um frasco lavado com ácido de 250 mL sem suplementação de ferro.
    3. Incubar durante 8 h a 26 °C com arejamento a 250 rpm.
  4. Subcultura em culturas aeróbicas e anaeróbicas em paralelo.
    1. Meça o OD600 das culturas em crescimento.
    2. Para continuar a incubação aeróbica, subcultive as culturas em crescimento para um valor OD600 de 0,1 em 14 mL de meio estéril quelatado M9 contendo 0,9% de glicose e sem FeSO4,7H 2O em um frasco lavado com ácido de 250 mL e cultura com aeração a 26 ° C por 12 h sem suplementação de ferro.
    3. Para cultura anaeróbica, subcultive para um valor OD600 de 0,1 em 14 mL de meio M9 quelatado estéril em dois tubos de vidro lavados com ácido. No primeiro tubo, adicione FeSO4.7H 2O esterilizado por filtro (usando membrana de polietersulfona de 0,22 μm) para uma concentração final de 1 mg / L (referido como "alto teor de ferro"). No segundo tubo, adicione FeSO4.7H 2O para uma concentração final de 0.01 mg/L (referida como "baixo teor de ferro"). Isso pode ser feito usando uma solução estoque de FeSO4.7H 2O a 10 mg / mL. Incubar ambos os tubos anaeróbia em uma câmara anaeróbica à temperatura ambiente por 12 h.
      NOTA: 1 mg / L FeSO4.7H 2O fornece condições repletas de ferro para o crescimento robusto de Yersinia. Por outro lado, a adição de apenas 0,01 mg / L de FeSO 4,7H2O a culturas anaeróbicas garante crescimento suficiente em condições anaeróbicas, mas ainda permite respostas de falta de ferro, enquanto as culturas aeróbicas são cultivadas por 12 h na ausência de qualquer adição de ferro para estimular as respostas de falta de ferro antes da estimulação da atividade do T3SS.
  5. Induza a atividade do sistema de secreção tipo III.
    1. Mude as culturas anaeróbicas para 37 ° C e continue a incubação anaeróbica por 4 h para induzir o T3SS.
    2. Meça o OD600 da cultura de crescimento aeróbico.
    3. Em dois frascos lavados com ácido, subcultive as culturas de crescimento aeróbico para um valor OD600 de 0,2 em 14 mL de meio M9 quelatado estéril. No primeiro balão, adicionar FeSO4,7H 2O esterilizado por filtro para uma concentração final de 1 mg/l. No segundo balão, adicionar FeSO 4,7H2O para uma concentração final de 0,01 mg/l. Incubar ambos os balões com arejamento a 26 °C a 250 rpm durante 2 h.
    4. Após 2 h, deslocar as culturas aeróbias para 37 °C com arejamento a 250 rpm e incubar durante 4 h para induzir o T3SS.

3. Precipitação de ácido tricloroacético (TCA) de proteínas efetoras T3SS

  1. Quando a incubação anaeróbica estiver concluída, medir a DO600 das culturas.
  2. Normalize todas as amostras anaeróbicas para obter a mesma massa celular (consulte o exemplo fornecido na Tabela 1). Para cultura anaeróbica, geralmente espere um valor OD600 de ~ 0,5 em culturas carentes de ferro e ~ 1 para culturas repletas de ferro. Nesse caso, use 6 mL das culturas carentes de ferro e 3 mL das culturas repletas de ferro.
    NOTA: A cultura restante pode ser usada para outros fins, como a coleta de RNA total e o uso de PCR quantitativo para medir os níveis de estado estacionário do mRNA alvo (não descrito aqui).
  3. Transfira os volumes normalizados de cada cultura para tubos de 15 mL.
  4. Para controlar a eficiência da precipitação de proteínas secretadas, adicione 4 μL de albumina sérica bovina (BSA) 0,5 mg / mL em cada tubo.
  5. Culturas de pellets a 3200 x g por 15 min a 4 °C.
  6. Conecte um filtro de PVDF de 0,22 μm a uma seringa de 10 mL e filtre o sobrenadante de cada cultura peletizada em um tubo novo de 15 mL.
    NOTA: Esta etapa de filtração minimiza as chances de transferência de células bacterianas inteiras, o que resultaria em proteínas citoplasmáticas indesejadas na amostra.
  7. Adicionar 10% do volume sobrenadante de 6,1 N TCA a cada amostra.
  8. Vórtice vigorosamente por 1 min. Incube os tubos no gelo em uma câmara fria a 4 °C durante a noite.
    NOTA: A duração da incubação pode ser otimizada com base na necessidade. Apenas uma incubação de 1 h pode funcionar para condições ou cepas em que a secreção é robusta.
  9. Repetir as etapas de recolha de pellets e precipitação de TCA com as culturas aeróbias uma vez concluída a incubação de 4 h.
    NOTA: Normalize as culturas aeróbicas peletizando volumes com massa celular equivalente.
  10. Adicione 2 mL de cada amostra a um tubo novo de 2 mL e centrifugue a 21.000 x g por 15 min a 4 ° C.
  11. Aspire o sobrenadante usando um acessório de vácuo e tome cuidado para não tocar no fundo ou nas laterais do tubo.
    NOTA: O pellet pode ser difícil de visualizar e pode aparecer como uma névoa ao longo do comprimento do tubo.
  12. Repita as etapas 3.10 e 3.11 até que todo o conteúdo de cada reação de precipitação seja precipitado em um único tubo de 2 mL. Isso pode levar três ou quatro etapas sequenciais de centrifugação, mas permite a concentração de todas as proteínas secretadas de cada amostra em um tubo de 2 mL.
  13. Para lavar os pellets, adicione suavemente 1 mL de acetona 100% gelada em cada tubo. Para evitar a perda de amostra, não ressuspenda e não toque nas laterais do tubo.
  14. Centrifugue as amostras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  15. Aspirar o sobrenadante e ter cuidado para não tocar no fundo ou nas laterais do tubo.
  16. Repita as etapas de lavagem com acetona gelada 3.13 e 3.14.
  17. Depois de aspirar o sobrenadante pela última vez, abra os tubos e deixe o pellet secar completamente na bancada por aproximadamente 1 h.
  18. Adicione 50 μL da solução FSB: DTT a cada amostra seca. Para evitar a perda de proteína, não ressuspenda.
  19. Vortex completamente cada amostra por 1 min, garantindo que a solução FSB: DTT cubra as paredes de todo o tubo. Isso pode ser otimizado usando um acessório de vórtice capaz de segurar vários tubos ao mesmo tempo.
  20. Ferva as amostras a 95 °C durante 15 min.
  21. Centrifugar brevemente as amostras durante 30 s à velocidade máxima à temperatura ambiente.
  22. Conservar a -80 °C até utilização futura.

4. SDS-PAGE e coloração de prata para visualizar proteínas efetoras T3SS

  1. Carregue 15 μL de cada amostra anaeróbica e 10 μL de cada amostra aeróbica em um gel SDS-PAGE a 12,5%, juntamente com 3 μL de um padrão não corado disponível comercialmente como escada.
  2. Execute o gel por cerca de 90 min a 100 V. Essas configurações podem variar dependendo do aparelho usado.
  3. Siga o protocolo de coloração de prata seguindo as instruções do fabricante, resultando em um gel, conforme mostrado na Figura 2.

5. Quantificando a atividade relativa do T3SS

  1. Posicione o gel no sistema de imagem, certificando-se de que todas as bandas destinadas à quantificação estejam no quadro da imagem.
    NOTA: O peso molecular da BSA é de ~ 66 kDa, enquanto o peso molecular da proteína efetora T3SS YopE é de ~ 23 kDa.
  2. No software, selecione todas as bandas YopE em todos os poços.
  3. Defina a banda YopE de referência para o sample apropriado.
  4. Exporte os valores de quantificação relativos calculados pelo software para todas as bandas YopE.
  5. Voltando ao software, selecione todas as bandas BSA em todos os poços.
  6. Defina a banda BSA de referência para garantir que ela seja da mesma amostra que a banda YopE de referência.
  7. Exporte os valores de quantificação relativos calculados pelo software para todas as bandas BSA.
  8. Para calcular os níveis de expressão YopE relativos, divida o valor da quantidade relativa YopE pelo valor da quantidade relativa BSA para cada amostra.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este método permite a comparação relativa de Yops secretados em várias condições relativas a uma condição de referência de interesse. O fluxo de trabalho experimental geral é representado na Figura 1. A Tabela 1 mostra uma representação de como a normalização da cultura de células normalmente ocorreria no caso de cada condição de cultura e o volume de TCA que seria adicionado a cada sobrenadante. Aqui, resultados representativos são mostrados usando Y. pseudotuberculosis...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O T3SS é um importante fator de virulência em muitas bactérias patogênicas; Portanto, o desenvolvimento de técnicas laboratoriais para estudar sua regulação é importante para a compreensão da patogênese e desenvolvimento de potenciais terapêuticas1. Ferro e oxigênio são conhecidos por serem importantes pistas do hospedeiro detectadas por patógenos bacterianos para regular a expressão de T3SS5; portanto, este método apresenta uma estratégia ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Imagens gráficas criadas usando BioRender.com. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (www.NIH.gov) conceder R01AI119082.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de ponta Luer-Lok de 10 mLBD301029
10x SDS Running Buffer Base caseirade 0,25 M Tris, 1,92 M de glicina, 1% SDS em volume de 1 L
12,5% SDS-Page Gelcaseiro de
15 mL de tubos de culturaFalcon352059Para a noite inicial
Tubos Falcon de 15 mLFalcom352196Para coleta de sobrenadante
Frasco de cultura de 250 mLBelco251000250
Sistema de filtro de 500 mLCorning431097
6 N Solução de ácido clorídricoFisher Scientific7732185
AcetonaFisher ChemicalA949-44 L
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBio RadNúmero do modelo: Universal Hood III
Tubos de cultura de vidro borosilicatoFisherbrand14-961-34Para cultura anaeróbica
Chelex 100 ResinaBio Rad142-1253
Chelex M9 +0,9% Mídia de glicoseCaseiro6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1% de casaminoácidos, 0,9% dextrose, 0,0005% tiamina, 5 g/L de resina Chelex 100. Agite o meio por 18 h em temperatura ambiente, filtre usando uma unidade de filtração Corning de 500 mL e, em seguida, adicione MgSO4 para solução 1 mM de MgSO4 final
Tampão de amostra final (FSB)Feito em0,1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% de glicerol, 0,2% de azul de bromofenol
FSB: Solução DTTFeito emFSB+0.2M DTT
Image Lab SoftwareSoftware Bio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z
Bloco de calor IsotempdeFisher Scientific
LB Feitoem casa10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, 15 g de ágar em 1 L de volume total. Mídia de glicose autoclavada
M9 + 0,2%Home made6 g / L Na2< / sub>HPO4< / sub>, 3 g / L KH2< / sub>PO4< / sub>, 0,5 g / L NaCl, 1 g / L NH4< / sub>Cl, 1 mM de MgSO4, 1 mg/L de FeSO47H2O, 1% de casaminoácidos, 0,2% de dextrose, 0,0005% de tiamina 
Acessório de filtro Millex-GP PES 0.22um para seringaMilliporeSLGPR33RSPara filtração FeSO47H2O
Acessório de filtro Millex-GV PVDF 0.22um para seringaMilliporeSLGVR33RSPara filtração sobrenadante
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
SDS-PAGE Aparelho de GelBio RadNúmero do Modelo: Mini PROTEAN Tetra Cell
Kit de Coloração SilverXpress Silver InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI ScientificBDRAA1155
Solução de ácido tricloroacético 6.1NSigma AldrichT0699
Coy Lab Productshttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Primer sequences 
yfeA para a frente - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverso - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd para a frente - ccagcatcagccccatacag
bfd para a frente - tggcttgtcggatgcacttc
yopE para a frente - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE reverso - CTTGGCATTGAGTGATACTG
casa casa Placas ágar 88860021 Câmara Anaeróbica de Vinil

Referências

  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Secreção de Proteínas EfetorasAnálise por SDS-PAGEColoração por PrataDisponibilidade de OxigênioPrecipitação de ProteínasVirulência Bacteriana
Quantificando a atividade do sistema de secreção de Yersinia pseudotuberculosis tipo III após a falta de ferro e o crescimento anaeróbico
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.