Revelando o fenótipo ferropótico do meduloblastoma

A ferroptose é um tipo de morte celular dependente de espécies reativas de oxigênio (ROS) recém-contextualizadas¹. Além das ROS, o ferro desempenha um papel crucial nesse tipo de morte celular, daí o nome². A etapa final e executiva da ferroptose é o acúmulo catalisado por ferro de dano oxidativo de lipídios na membrana plasmática que eventualmente leva ao comprometimento da integridade da membrana e permeabilidade seletiva e, finalmente, à morte celular por borbulhamento. O evento de hidroperoxidação lipídica é um fenômeno que ocorre naturalmente; no entanto, sua propagação por toda a membrana celular é impedida pela defesa antioxidante da célula. O principal ator neste contexto é a proteína E glutationa peroxidase 4 (GPx4), que pode se aproximar da membrana e converter hidroperóxidos lipídicos em seus derivados de álcool menos tóxicos³. O poder redutor da GPx4 é principalmente, mas não exclusivamente, fornecido pela glutationa (GSH), um tripeptídeo composto pelos aminoácidos não essenciais: glicina, glutamato e cisteína. O aminoácido limitante da taxa para a biossíntese de GSH é a cisteína⁴. Embora a cisteína seja classificada como um aminoácido não essencial, suas necessidades podem facilmente exceder sua produção interna em células altamente proliferativas (como células cancerígenas). Assim, foi reclassificado no grupo dos aminoácidos semi-essenciais. A importação necessária de cisteína ocorre principalmente através do sistema Xc-, que permite a importação da forma oxidada (dominante) de cisteína (também conhecida como cistina) em detrimento da exportação de glutamato⁵. O sistema Xc- é composto por uma subunidade de transporte independente de Na+ e dependente de Cl, conhecida como xCT, e uma subunidade de acompanhante, conhecida como CD98. Até recentemente, as propriedades antiferroptoticas do eixo xCT-GSH-GPx4 eram vistas como únicas e irreplicáveis⁶. No entanto, em 2019, uma via antiferroptótica alternativa, consistindo de ubiquinol (Coenzima Q10) e sua enzima regenerativa - proteína supressora de ferroptose 1 (FSP1), foi descrita ^7,8. Logo depois, outro sistema desintoxicante de hidroperóxido lipídico envolvendo GTP ciclohidrolase-1/tetrahidrobiopterina (GCH1/BH4) foi relatado⁹. No entanto, o papel central do eixo xCT-GSH-GPx4 na prevenção da ferroptose parece não ser contestado.

Na última década, a ferroptose tem sido extensivamente estudada em uma variedade de tipos de tumores, mostrando grande potencial como estratégia anticâncer (revisado por Lei et ^al.10). Além disso, foi relatado que as células cancerígenas exibindo alta resistência aos quimioterápicos convencionais e / ou propensão a metástase são surpreendentemente sensíveis aos indutores de ferroptose, como inibidores de GPx4^{11 , 12 , 13} . No entanto, no contexto de tumores cerebrais, o potencial dos indutores ferroptóticos permanece amplamente pouco estudado. Embora esse tipo de morte celular tenha sido intimamente associado à lesão de isquemia-reperfusão cerebral¹⁴e doenças neurodegenerativas¹⁵, seu potencial no contexto de tumores cerebrais tem sido limitado principalmente ao glioblastoma, o tumor craniocerebral maligno mais comum (revisado por Zhuo et ^al.16). Por outro lado, a sensibilidade do meduloblastoma, o tumor cerebral pediátrico maligno mais comum e uma das principais causas de mortalidade infantil, aos indutores de ferroptose permanece amplamente inexplorada. Até onde sabemos, há escassa literatura revisada por pares ligando ferroptose e meduloblastoma. No entanto, alguns estudos revelaram que o ferro desempenha um papel crucial na sobrevivência, proliferação e potencial tumorigênico das células-tronco cancerígenas (CSCs) do meduloblastoma e do glioblastoma17,18, tornando-as potencialmente mais vulneráveis à indução da ferroptose. Isso é particularmente significativo, pois o meduloblastoma é notório por sua subpopulação de CSCs, ou células iniciadoras/propagadoras de tumores, que parecem ser amplamente responsáveis pela quimiorresistência, disseminação e recidiva tumoral¹⁹.

A sensibilidade à indução de ferroptose é tipicamente investigada medindo o conteúdo/acúmulo de hidroperóxido lipídico, que pode ou não levar à morte celular. Os indutores de ferroptose mais comumente usados são (1) erastina, um inibidor do transportador xCT²⁰, (2) RSL3, um inibidor da enzima GPx4² e / ou (3) doadores de ferro, como citrato de ferro-amônio (FAC) ²¹ . O teor de hidroperóxido lipídico é avaliado usando a sonda seletiva BODIPY 581/591 C11²², que tem máximos de excitação e emissão em 581/591 nm em seu estado reduzido. Após a interação e oxidação por hidroperóxidos lipídicos, a sonda muda seus máximos de excitação e emissão para 488/510 nm. Normalmente, um aumento significativo no conteúdo de hidroperóxido lipídico precede a morte celular ferroptótica. Como a ferroptose não é uma morte celular programada, não há cascata de sinalização molecular que leve à sua execução. Portanto, a única forma de confirmá-lo é monitorar o teor de hidroperóxido lipídico e utilizar inibidores específicos para esse tipo de morte celular, como a ferrostatina 1²³. A ferrostatina 1 é um antioxidante lipofílico que pode penetrar no compartimento lipídico da célula e desintoxicar os hidroperóxidos lipídicos, prevenindo assim eventos ferroptóticos.

O presente estudo foi conduzido usando linhagens celulares de meduloblastoma do tipo selvagem (WT) DAOY, que foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO₂ em meio DMEM suplementado com 8% de FBS. A linhagem celular deletada por xCT foi mantida nas mesmas condições, com experimentos realizados em meio suplementado com N-acetilcisteína (NAC) 1 mM. As células foram regularmente rastreadas para micoplasma usando um Kit de Detecção de Micoplasma disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) e foram cultivadas até a 10ª passagem.

1. Colhendo e semeando as células

NOTA: Todas as etapas são realizadas usando técnicas assépticas estéreis em uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos. As células de meduloblastoma DAOY são aderentes, o que significa que todas as células não anexadas podem ser descartadas por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca²⁺ e Mg²⁺.

1. Pegue o prato de caldo (placa de Petri, 100 mm de diâmetro) com as células e remova as células flutuantes e o meio da placa usando um aspirador.
2. Adicione 5-10 mL de PBS ao prato, lave o fundo com movimentos circulares do prato e, em seguida, remova o PBS do prato usando um aspirador.
3. Adicione 1 mL de tripsina (diluição de 10x) ao prato. Incube a placa até que um toque suave na placa desaloje as células. Tome 10 mL de meio de cultura DMEM suplementado com 8% de FBS e colha mecanicamente as células do prato.
4. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
5. Pegue 500 μL da suspensão celular e coloque-a em uma cubeta para contagem. Conte o número de células por mL de suspensão celular. Um contador de células automatizado foi usado para este estudo (ver Tabela de Materiais).
6. Calcule o volume necessário para retirar da suspensão celular para ter 1,00,000 células.
7. Pegue uma placa de 6 poços e adicione o volume calculado da suspensão celular em cada poço, em seguida, adicione meios de cultura DMEM suplementados com 8% de FBS a 2 mL em cada poço.

2. Tratamento das células

NOTA: O controle e os tratamentos são realizados em triplicata. Os grupos são os seguintes: Controle (DMSO), 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3, 250 μM de FAC, 2 μM de Ferrostatina 1, 1 μM de erastin + 2 μM de Ferrostatin 1, 0,3 de μM RSL3 + 2 μM de Ferrostatin 1, 250 μM de FAC + 2 μM de Ferrostatin 1. Quatro placas de 6 poços são necessárias para o experimento, conforme indicado na Tabela 1). Os detalhes comerciais de todos os reagentes necessários estão listados na Tabela de Materiais.

1. 24 h após a semeadura, adicione o tratamento correspondente ao poço com as células.
2. Deixe a loiça a 37 °C e 5% de CO₂ na incubadora.

3. Coloração de hidroperóxidos lipídicos das células tratadas com sonda BODIPY 581/591 C11

NOTA: A solução de estoque da sonda específica para hidroperóxido lipídico é preparada em DMSO na concentração de 1 mM. As alíquotas da solução-mãe são armazenadas a -20 °C em tubos não transparentes. Para a coloração, prepare uma solução de trabalho de 2 μM da sonda em meio DMEM suplementado com 8% de FBS.

1. 6 h após o tratamento, observe as células sob um microscópio óptico (o arredondamento celular deve ser visível).
2. Retire os pratos da incubadora e coloque-os em uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos.
   Usando um aspirador, remova a mídia e as células flutuantes (mortas).
3. Adicione suavemente 2 mL de PBS a cada poço, lave o fundo com movimentos circulares das placas de 6 poços e, em seguida, remova o PBS dos poços usando um aspirador.
4. Adicionar 2 ml da solução de trabalho da sonda (concentração final de 2 μM em DMEM suplementado com FBS).
5. Deixe o prato na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 30 min no escuro (os pratos podem ser embrulhados em papel alumínio).

4. Análise por citometria de fluxo do teor de hidroperóxido lipídico nas células tratadas

NOTA: Todas as etapas a seguir são executadas no escuro (sem luzes na capela de fluxo laminar).

1. Retire os pratos da incubadora e coloque-os em uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos.
   Usando um aspirador, remova a solução de coloração.
2. Adicione suavemente 2 mL de PBS a cada poço, lave o fundo com movimentos circulares das placas de 6 poços e, em seguida, remova o PBS dos poços usando um aspirador.
3. Repita a etapa de lavagem mais uma vez e aspire qualquer PBS restante do poço usando um aspirador.
4. Adicione 150 μL de um reagente de dissociação celular disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) no fundo de cada poço e incube a placa até que o batimento suave da placa desaloje as células. Pegue 250 μL de tampão FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) e colha mecanicamente as células dos poços.
5. Transfira as células para o tubo FACS correspondente (previamente marcado) com a tampa do filtro. Coloque o tubo com as células no gelo no escuro até que a análise seja realizada (a análise deve ser realizada dentro de uma hora após a coloração).
   NOTA: A configuração e calibração da máquina FACS dependem da máquina usada (consulte a Tabela de Materiais).
6. Crie um novo experimento e dê um nome a ele (Ferroptose em DAOY - hidroperóxidos lipídicos).
7. No projeto do experimento, escolha o laser (488 nm) e o filtro (FITC).
8. Na visualização de dados, selecione o tamanho adequado da célula (>12 μm), defina as tensões PMT (a população de células deve aparecer no primeiro quadrante do gráfico de pontos SSC-H/FSC-H) e gate o gráfico de pontos.
9. Adicione um novo gráfico - histograma, com FITC-A no eixo y e escala logarítmica.
10. Vortex as amostras no tubo FACS, coloque-as na máquina FACS e carregue a amostra. Registre 10.000 eventos singleto FSC e nomeie o arquivo (por exemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte o arquivo como .fcs.

5. Coloração de iodeto de propídio (PI) das células mortas após o tratamento

NOTA: O desenho do experimento é exatamente o mesmo que para a medição de hidroperóxido lipídico (consulte a etapa 1 e a etapa 2).

1. 24 h após a semeadura, retire os pratos da incubadora e coloque-os na capela de fluxo laminar.
2. Colete o meio (com células mortas) em um tubo de 15 mL.
3. Adicione 1 mL de PBS a cada poço, lave o fundo com movimentos circulares das placas de 6 poços e, em seguida, colete o PBS no tubo com o respectivo meio.
4. Adicione 200 μL de tripsina (diluição de 10x) no fundo de cada poço e incube a placa até que um toque suave na placa desaloje as células. Use o respectivo meio + PBS para colher as células dos poços.
5. Centrifugue a suspensão da célula a 180 x g por 10 min à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante usando um aspirador.
6. Ressuspenda o pellet celular em 300 μL de tampão FACS e coloque-o no gelo até a análise.
7. Imediatamente antes da análise, adicione a solução de PI (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração final de 2 μg / mL.

6. Análise por citometria de fluxo de células mortas 24h após o tratamento

NOTA: As configurações e a calibração da máquina FACS são feitas conforme indicado anteriormente (consulte a etapa 4).

1. Crie um novo experimento e dê um nome a ele (Ferroptose em DAOY - morte celular).
2. No planejamento do experimento, escolha o laser (488 nm) e o filtro (PE).
3. Na visualização de dados, selecione o tamanho adequado da célula (>12 μm), defina as tensões PMT (a população de células deve aparecer no primeiro quadrante do gráfico de pontos SSC-H/FSC-H) e gate o gráfico de pontos.
4. Adicione um novo gráfico - histograma, com PE-A no eixo y e escala logarítmica.
5. Vortex as amostras no tubo FACS, coloque-as na máquina FACS e carregue a amostra.
6. Registre 10.000 eventos singleto FSC e nomeie o arquivo (por exemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte o arquivo como .fcs.

7. Análise por citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células DAOY xCT-/-

NOTA: As células xCT-^/- foram geradas conforme descrito anteriormente²⁴.

1. Para este experimento, semeie as células conforme indicado na etapa 2, mas em vez do tratamento, complemente o meio com 1 mM de NAC durante a noite.
2. No dia seguinte, mantenha o NAC em um grupo e remova-o do outro.
3. Efectuar a análise por citometria de fluxo do teor de hidroperóxido lipídico exactamente da mesma forma descrita no passo 6.

8. Análise dos resultados do citómetro de fluxo

1. Abra o documento .fcs no software FlowJo (consulte Tabela de materiais).
2. Clique duas vezes no arquivo individual para abrir todos os eventos (não apenas singletos FCS) registrados na amostra individual (gráfico de pontos SSC-A/FSC-A). Como as configurações são tais que o gating feito na máquina não é preservado, é necessário fazer o portão mais uma vez e nomear a população (por exemplo, DAOY WT).
3. Clique duas vezes na população fechada para abrir outra janela com o histograma.
4. Altere o eixo Y para o filtro fluorescente usado (Comp-FITC/PE-A).
5. Altere o eixo X para modal (normalize cada pico para seu modo, ou seja, para % do número máximo de células encontradas em um compartimento específico).
6. Copie o histograma para o editor de layout. Repita isso para todas as amostras e, sempre que um novo histograma for colado no editor de layout, arraste-o sobre o anterior para que os histogramas sejam sobrepostos (meio deslocamento).

A linhagem celular de meduloblastoma DAOY foi cultivada em meio DMEM padrão suplementado com 8% de FBS até atingir aproximadamente 60% de confluência. No dia do experimento, as células foram colhidas e 1.00.000 células por poço foram semeadas em placas de 6 poços, de acordo com a Tabela 1. No dia seguinte, as células (em triplicata) foram tratadas com 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de FAC. As placas foram então colocadas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Após 6 h, as células foram observadas ao microscópio para detectar células borbulhantes, conforme indicado pelas setas da Figura 1. Isso serviu como um indicador de que a droga era eficaz na indução da ferroptose antes que as células fossem preparadas para coloração com hidroperóxido lipídico e subsequente análise de FACS.

Para a detecção do teor de hidroperóxido lipídico, foi utilizado o corante específico BODIPY 581/591 C11 na concentração final de 2 μM por 30 min. Como esse corante é sensível ao redox, foi necessário remover qualquer tratamento das células e lavá-las com PBS pré-aquecido. Após meia hora de coloração, as células foram lavadas duas vezes com PBS, destacadas usando a solução de descolamento de células e preparadas para análise FACS. Os dados obtidos nesta etapa mostraram aumento da fluorescência verde do corante nas amostras tratadas com os três medicamentos (Figura 2). No entanto, o efeito mais potente foi observado com 0,3 μM de RSL3 ( Figura 2B ), enquanto 1 μM de eratina ( Figura 2A ) e 250 μM de FAC ( Figura 2C ) mostraram um efeito um pouco menor após 6 h de tratamento.

Para estabelecer que o acúmulo de hidroperóxido lipídico detectado leva à morte celular, especificamente à ferroptose, os mesmos tratamentos descritos na Tabela 1 foram aplicados por 24 h. Para a análise das células mortas por citometria de fluxo, foram colhidas as células e o sobrenadante. As células vivas e mortas foram peletizadas por centrifugação e depois ressuspensas em tampão FACS para posterior análise de citometria de fluxo. Os dados apresentados na Figura 3 demonstraram que todos os três tratamentos induziram a morte celular maciça, que foi completamente evitada com o uso do inibidor específico da ferroptose, ferrostatina-1. Isso claramente apóia a ocorrência de morte celular ferroptótica após inibição de xCT, inibição de GPx4 ou sobrecarga de ferro em células de meduloblastoma.

Dado que as três drogas mostraram efeitos um pouco diferentes no acúmulo de hidroperóxido lipídico, provavelmente devido a diferenças na potência, uma abordagem genética foi empregada para investigar a potência total dos indutores ferroptóticos. As células DAOY xCT-/- obtidas anteriormente (Figura Suplementar 1A) foram cultivadas no mesmo meio que suas contrapartes WT, mas com suplementação de NAC. Essa seleção positiva permitiu que as células xCT-/- crescessem em cultura. No entanto, 6 h após a remoção do NAC do meio de cultura, as células começaram a acumular hidroperóxidos lipídicos no mesmo nível que as células WT tratadas com RSL3 (Figura 4). Da mesma forma que a inibição farmacológica, a remoção do NAC do meio induziu o borbulhar característico das células xCT-/- após 6 h (Figura Suplementar 1B).

Figura 1: Fenótipo ferroptótico das células do meduloblastoma. Micrografias representativas de células DAOY WT tratadas (ou não) por 6 h com 1 μM de eratina (ERA), 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de citrato de ferroamônio (FAC) na presença ou não de 2 μM de inibidor de ferroptose Ferrostatina-1 (Ferro-1). As setas brancas indicam células redondas e "borbulhantes", indicando um fenótipo ferroptótico visível sob um microscópio óptico. Ampliação: 20x, inserções: 40x. Barras de escala: 50 μm, inserções: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Hidroperóxido lipídico como marcador-chave de ferroptose em células de meduloblastoma. Dados representativos da coloração de hidroperóxido lipídico por citometria de fluxo nas células tratadas por 6 h com (A,B) 1 μM de eratina (ERA), (C,D) 0,3 μM de RSL3 ou (E,F) 250 μM de citrato de ferroamônio (FAC), na presença ou não de 2 μM de inibidor de ferroptose Ferrostatina-1 (Ferro-1). (A, C, E) Gráficos de pontos dos eventos registrados; (B, D, F) Representação do histograma do teor de hidroperóxido lipídico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Indução da morte celular por via farmacológica. Gráficos de pontos representativos de citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio após 6 h de tratamento com 1 μM de eratina (ERA), 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de citrato de ferroamônio (FAC), na presença ou não de 2 μM de inibidor de ferroptose Ferrostatina-1 (Ferro-1). O gating separa as populações vivas (Q4) e mortas (Q3) das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Indução de ferroptose por abordagem genética. Dados representativos da coloração de hidroperóxido lipídico por citometria de fluxo nas células DAOY WT e xCT-/- após 6 h na presença ou não de 2 μM de inibidor de ferroptose Ferrostatin-1 (Ferro-1). À esquerda está a representação do histograma do conteúdo de hidroperóxido lipídico. À direita estão os gráficos de pontos dos eventos registrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Detalhes do tratamento das células controle e experimentais.

Figura suplementar 1: Morte celular ferroptótica das células DAOY xCT-/- . (A) Análise de Western blot do nível de xCT em células DAOY WT e xCT-/- em meio DMEM suplementado ou não com 2 μM de Ferrostatina-1. (B) Micrografias representativas das células DAOY xCT-/- na presença (esquerda) e ausência (direita) de N-acetilcisteína 1mM por 6 h. As setas brancas indicam células redondas e "borbulhantes", indicando um fenótipo ferroptótico visível sob um microscópio óptico. Ampliação: 40x. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Declaramos não haver conflito de interesses para o estudo aqui apresentado.