Métodos alternativos para a detecção da geração de ânions superóxido em plaquetas

Resumo

A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas contendo oxigênio altamente instáveis. Sua instabilidade química os torna extremamente reativos e lhes dá a capacidade de reagir com moléculas biológicas importantes, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Os ânions superóxido são importantes ROS gerados pela redução da redução molecular de oxigênio (ou seja, aquisição de um elétron). Apesar de sua implicação inicial exclusivamente no envelhecimento, processos degenerativos e patogênicos, sua participação em importantes respostas fisiológicas tornou-se recentemente aparente. No sistema vascular, os ânions superóxido demonstraram modular a diferenciação e a função das células musculares lisas vasculares, a proliferação e migração de células endoteliais vasculares na angiogênese, a resposta imune e a ativação de plaquetas na hemostasia. O papel dos ânions superóxido é particularmente importante na desregulação das plaquetas e nas complicações cardiovasculares associadas a uma infinidade de condições, incluindo câncer, infecção, inflamação, diabetes e obesidade. Tornou-se, portanto, extremamente relevante na pesquisa cardiovascular ser capaz de medir efetivamente a geração de ânions superóxido pelas plaquetas humanas, entender os mecanismos dependentes de redox que regulam o equilíbrio entre hemostasia e trombose e, eventualmente, identificar novas ferramentas farmacológicas para a modulação das respostas plaquetárias levando à trombose e complicações cardiovasculares. Este estudo apresenta três protocolos experimentais adotados com sucesso para a detecção de ânions superóxido em plaquetas e o estudo dos mecanismos dependentes de redox que regulam a hemostasia e a trombose: 1) detecção de ânion superóxido à base de dihidroetídio (DHE) por citometria de fluxo; 2) visualização e análise de ânions superóxido baseados em DHE por imagem plaquetária única; e 3) quantificação baseada em sonda de spin da saída de ânions superóxido em plaquetas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

Introdução

O ânion superóxido (O₂^•-) é o ROS mais funcionalmente relevante gerado nas plaquetas¹. O₂^•- é o produto da redução do oxigênio molecular e o precursor de muitas ROS ² diferentes. A dismutação de O₂^•- leva à geração de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) por meio de reações espontâneas em solução aquosa ou reações catalisadas por superóxido dismutases (SODs³). Embora diferentes fontes enzimáticas tenham sido sugeridas (por exemplo, xantina oxidase⁴, lipoxigenase⁵, ciclooxigenase^{6 e óxido} nítrico sintase⁷), a respiração mitocondrial ^8,9 e as nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-oxidases (NOXs) ¹⁰ são as fontes mais proeminentes de ânion superóxido em células eucarióticas. Este também parece ser o caso das plaquetas, onde o vazamento de elétrons da respiração mitocondrial^11,12 e a atividade enzimática dos NOXs^13,14 foram descritos como os principais contribuintes para a produção de ânions superóxido.

Embora vários estudos tenham se concentrado na regulação de plaquetas por O₂^•-, não há consenso sobre os mecanismos moleculares responsáveis. A modulação da atividade do receptor de superfície via oxidação direta e formação de ligações dissulfeto tem sido proposta para diferentes receptores plaquetários. A regulação positiva da integrina αIIbβ3 por ROS via oxidação direta de resíduos de cisteína tem sido sugerida 15,16,17. Da mesma forma, como as respostas plaquetárias ao colágeno dependem da dimerização dependente de dissulfeto e consequente dimerização da glicoproteína VI (GPVI)¹⁸, a potencialização da atividade do receptor por oxidação dependente de ROS tem sido^proposta19, embora não totalmente comprovada experimentalmente. Finalmente, a oxidação induzida por ROS dos grupos sulfidrila da glicoproteína Ib (GPIb) demonstrou promover a adesão plaquetária e a interação plaqueta-leucocitária durante a inflamação²⁰. Por outro lado, como possível consequência da diminuição da oxidação do grupo sulfidrila e da ativação do receptor, a eliminação do ectodomínio de GPVI e GPIb é diminuída pela redução das condições²¹.

Modos de ação independentes de uma oxidação direta dos receptores da superfície plaquetária também foram propostos. As ROS, incluindo O₂^•-, demonstraram modular positivamente o receptor de colágeno GPVI, atenuando a atividade da proteína tirosina fosfatase 2 contendo a região de homologia Src 2 (SHP-2), que regula negativamente a cascata de sinalização desse receptor²². Além disso, o_O-2^•- pode gerar ONOO^- (peroxinitrito) por reação rápida com óxido nítrico (NO), que normalmente inibe as plaquetas por meio da guanilil ciclase sensível ao NO (NO-GC) e da geração do regulador plaquetário negativo GMP cíclico (GMPc)^23,24. A diminuição resultante nos níveis de NO pode levar à potenciação plaquetária. Alternativamente, sugere-se que a geração de_O2^•- por NOX2 contribua para a peroxidação lipídica e a formação de isoprostano, que é essencial para a ativação e adesão plaquetária²⁵. Finalmente, a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) quinase regulada por sinal extracelular 5 (ERK5), uma proteína quinase proposta como um sensor de estresse redox em plaquetas²⁶, é ativada por O₂^•- e induz um fenótipo pró-coagulante nas plaquetas (conforme estimado pela medição baseada em citometria de fluxo da externalização da fosfatidilserina)²⁷.

A desregulação de_O2^•- e outras gerações de ROS nas plaquetas tem sido associada à resposta hemostática exagerada, levando a complicações cardiovasculares trombóticas associadas à aterosclerose, diabetes mellitus, hipertensão, obesidade e câncer^28,29. Nesses cenários patológicos, a saída de EROs pelas plaquetas é aumentada, o que leva a uma potencialização de suas respostas adesivas e agregatórias. Além do efeito sobre as respostas plaquetárias, a produção de radicais livres de plaquetas pode ter consequências em outras células sanguíneas e estruturas vasculares, que é uma área pouco compreendida e pouco investigada da saúde cardiovascular³⁰. Apesar de nossa compreensão limitada dos mecanismos moleculares que ligam o estresse oxidativo às condições trombóticas, a relevância clínica dos antioxidantes para a proteção contra doenças cardiovasculares tem recebido atenção considerável. Os níveis plasmáticos de antioxidantes demonstraram estar inversamente correlacionados com o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, e o consumo de antioxidantes na dieta demonstrou proteger contra a doença arterial coronariana^31,32. Consequentemente, o uso de antioxidantes dietéticos tem sido defendido como uma abordagem promissora para a prevenção de doenças cardiovasculares 33,34,35. Dentre os efeitos da geração de EROs nas plaquetas, o aumento da apoptose pode ter importantes efeitos fisiopatológicos ^36,37. No geral, protocolos confiáveis para detectar e quantificar a saída de_O2^•- pelas plaquetas são cada vez mais relevantes na pesquisa cardiovascular.

Atualmente, as técnicas disponíveis para a detecção de ROS têm limitações importantes de especificidade (ou seja, a natureza química das moléculas oxidantes detectadas é desconhecida) e confiabilidade (ou seja, a interação indesejada com moléculas biológicas e reagentes experimentais leva a resultados não fisiológicos tendenciosos) ^{38 , 39} . A abordagem mais comumente utilizada para a detecção de ERO em plaquetas baseia-se no uso do diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que é convertido em diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por esterases intracelulares e, consequentemente, em diclorofluoresceína altamente fluorescente (DCF) por oxidantes celulares, incluindo radicais hidroxila e intermediários peroxidase-H₂O₂ ^40,41. Apesar de seu amplo uso, sérias questões têm sido levantadas quanto à confiabilidade dessa abordagem para a medição de ROS intracelulares³⁸. A oxidação de DCFH em DCF pode ser, de fato, induzida por íons de metais de transição (por exemplo, Fe²⁺) ou enzimas contendo heme (por exemplo, citocromos) em vez de ROS⁴². Além disso, o DCFDA é convertido por peroxidases celulares em sua forma de radical livre semiquinona (DCF ^{• -}), que por sua vez é oxidada em DCF por reação com oxigênio molecular (O₂) com a liberação de O₂ ^{• -}, o que leva à amplificação artificial das respostas oxidativas^{41 , 43 , 44}. Portanto, a detecção de ROS intracelulares por DCFDA é útil para obter insights iniciais, mas requer consideração cautelosa e controles experimentais extensivos^38,39.

Este estudo apresenta três técnicas alternativas para a detecção e medição do regulador chave da função plaquetária O₂^•-1. A primeira técnica é a detecção usando DHE e citometria de fluxo, que oferece vantagens de confiabilidade e especificidade sobre o DCFDA. A segunda técnica proposta aqui também utiliza DHE, mas o método de detecção é a imagem de fluorescência plaquetária viva, que permite o estudo da geração_{de O2}^•- na sinalização plaquetária com cinética rápida e resolução de célula única. Finalmente, um protocolo baseado no uso da sonda de spin de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) em experimentos de ressonância EPR oferece a possibilidade de quantificar a taxa de geração de_O2^•- por plaquetas e compará-la em diferentes condições.

Protocolo

A coleta de sangue periférico de voluntários consentidos é aprovada pelo Comitê de Ética local e pela Autoridade Nacional de Pesquisa em Saúde do Serviço de Saúde (referência REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Método 1: Deteção de aniões superóxidos utilizando DHE por citometria de fluxo

1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
2. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
3. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
4. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
5. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante em tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfônico (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 °C) a uma densidade de 2 x 10⁸ plaquetas/mL.
6. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
7. Preparar o DHE em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de reserva de 5 mM.
8. Adicione DHE à suspensão plaquetária na concentração final de 5 μM (dilua a solução estoque de 1 a 1.000, com concentração final de DMSO de 0,1% v / v) e incube por 15 min a 37 ° C.
9. Trate as plaquetas com agentes farmacológicos e/ou sequestrantes de ROS por 15 minutos antes da estimulação com os estímulos e concentrações fisiológicas desejados (por exemplo,., 0,1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno).
10. Após a estimulação, dilua as suspensões plaquetárias de 1 a 10 em tampão HEPES modificado gelado.
11. Para a citometria de fluxo, defina o espalhamento lateral (SSC) e o espalhamento direto (FSC) ganhem a 40 mV e 220 mV, respectivamente, e usem gráficos de dispersão em escala logarítmica para visualizar a população de partículas na suspensão (exemplo na Figura 1A).
12. (OPCIONAL) Imunocorar uma alíquota de suspensão plaquetária usando um anticorpo anti-CD41 para identificar a população de eventos correspondentes às plaquetas (exemplo na Figura 1B).
13. Analisar as amostras por citometria de fluxo utilizando excitação a 405 nm (laser violeta) e emissão a 580 nm de comprimento de onda, que detecta selectivamente o produto 2-hidroxietídio (2OH-Et+) específico do anião superóxido (figura 2).
    NOTA: A fixação com paraformaldeído e o armazenamento de amostras a longo prazo não são aconselháveis.

2. Método 2: Detecção de ânion superóxido usando DHE por imagem de fluorescência plaquetária única

1. Cubra uma lâmina de μ de 8 poços no dia do experimento com 0,1 mg / mL de colágeno fibrilar I de tendões equinos (colágeno Horm), 0,2 mg / mL de fibrinogênio ou 1 mg / mL de poli-L-lisina (PLL) em tampão de Tyrode modificado por 2 h a 37 ° C.
2. Lave duas vezes com tampão de Tyrode modificado (10 min cada).
3. Extinguir a adesão não específica por incubação em tampão de Tyrode modificado mais 5 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) durante um mínimo de 30 min (ou até à experiência).
4. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
5. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
6. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
7. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
8. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante no tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 ° C) a uma densidade de 4 x 10⁷ plaquetas / mL.
9. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
10. Preparar DHE em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de reserva de 10 mM.
11. Adicione DHE na concentração final de 10 μM à suspensão plaquetária (dilua a solução estoque de 1 a 1.000, com concentração final de DMSO de 0,1% v / v) e incube por 1 min (37 ° C).
12. Após o 1 min de incubação com DHE, remova a solução de bloqueio dos poços escolhidos, posicione a lâmina de μ no estágio do microscópio pronta para a imagem e dispense suavemente as plaquetas.
13. Monitore a conversão de DHE para 2OH-Et+ por imagem confocal invertida por 10 min (405/580 nm ex/em), com imagens coletadas a cada 10 s com uma lente de imersão em óleo de 40x.
14. (OPCIONAL) Para poços revestidos com PLL, monitore a geração de ânions superóxido em resposta a um agonista solúvel (por exemplo, 0,1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno) adicionando o agonista 10 minutos após a distribuição de plaquetas e coleta de imagens de fluorescência por mais 10 minutos, conforme descrito na etapa 2.13.
15. (OPCIONAL) Se necessário, adicionar sequestrantes de aniões superóxido ou inibidores seletivos (por exemplo, inibidores de NOX) dispensando suavemente para o lado do poço durante o decurso do tempo e recolher imagens de fluorescência conforme descrito em 2.13 durante mais 10 min.
16. Quantifique a análise de fluorescência de célula única selecionando a Região de Interesse (ROI) contendo plaquetas únicas representativas e analisando a intensidade de fluorescência em diferentes quadros com a ferramenta Medir do conjunto de imagens ImageJ 1.53t.

3. Método 3: Detecção de ânion superóxido por plaquetas usando ressonância paramagnética eletrônica (EPR)

1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
2. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
3. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
4. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
5. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante no tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 ° C) a uma densidade de 2 x 10⁸ plaquetas / mL.
6. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
7. Adicione 5 μM de dietilditiocarbamato (DETC) e 25 μM de desferroxamina à suspensão plaquetária.
8. Sem incubação, adicionar 200 μM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
9. Carregue as amostras no aggregômetro dentro de cubetas de agregação (incluindo ímãs de agitação revestidos de Teflon).
10. Após 1 min, adicione os estímulos na concentração desejada (por exemplo, 1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno). Incubar por 10 min.
11. (OPCIONAL) Obtenha a geração de ânions superóxido em diferentes pontos de tempo, prosseguindo para a etapa 3.12 no momento desejado.
12. Transfira a suspensão plaquetária da cubeta de agregação para um tubo de microcentrífuga e gire rapidamente a 6.000 x g por 10 s.
13. Carregue 50 μL do sobrenadante em micropipetas capilares e sele com cera de vedação EPR.
14. Transfira as amostras para o scanner EPR.
15. Defina o scanner EPR da seguinte forma: campo central 3.492,5 G, varredura de campo 60 G, amplitude de modulação 2 G, tempo de varredura 10 s, número de varreduras 10, frequência de micro-ondas 9,39 GHz, potência de micro-ondas 20 mW, tempo de conversão 327,68 ms, constante de tempo 5242,88 ms.
16. Estime a oxidação de CMH em CM^● como a área sob a curva (AUC) dos picos de EPR registrados usando os parâmetros acima.
17. Construa uma curva de calibração traçando a intensidade de EPR medida conforme descrito na etapa 3.16 no eixo y e as concentrações do CM^● comercialmente disponível no eixo x (por exemplo, 0, 0,3, 1, 3, 10 e 30 μM).
18. A partir da concentração de CM^● nas amostras, obter a quantidade de ânion superóxido gerada pelas plaquetas nas amostras usando as fórmulas descritas na seção Resultados Representativos.

Resultados

Para detecção de fluorescência DHE por citometria de fluxo, mostramos resultados representativos para plaquetas em repouso (Figura 3A) ou estimuladas com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3B). A saída de O₂^•- foi quantificada como intensidade média de fluorescência plaquetária (MFI), conforme mostrado para estimulação com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3C) ou 3 μg/mL de peptídeo relacionado ao colágeno (PCR) (Figura 3D). Um aumento de duas / três vezes na coloração DHE foi observado como resultado da estimulação plaquetária. Para confirmar que o_O2^•- é medido, sugerimos o uso da superóxido dismutase peguilada permeável ao O2^•- (PEG-SOD, 100 unidades/mL), enquanto para identificar a fonte de_O2^•- usamos o inibidor de NOX VAS2870 (10 μM). Tanto para o colágeno quanto para a trombina, o PEG-SOD e o VAS2870 aboliram o aumento da fluorescência do DHE causado pela ativação plaquetária, confirmando que a medição é específica para O₂^•- e que suas fontes nessas condições são as enzimas NOX.

Para a detecção por imagem da fluorescência DHE, apresentamos dados de experimentos que avaliaram a geração de O₂^•- no momento da adesão ao colágeno ou fibrinogênio (e nos 10 min seguintes) (Figura 4A) ou de experimentos com o objetivo de avaliar a geração de_O2^•- a partir de plaquetas previamente aderidas à PLL após estimulação com trombina (Figura 4B). Como esperado, a adesão ao PLL não desencadeia uma produção robusta de O₂^•-. Muito provavelmente porque essa forma de adesão depende da interação eletrostática sem o início de qualquer resposta de sinalização⁴⁵, o que torna essa abordagem adequada para medir a saída de O₂^•- em resposta à adição de agonistas solúveis. Para confirmar que este protocolo permite a detecção de O₂^•-, podem ser utilizados sequestrantes ou inibidores seletivos. Mostramos em estudos anteriores que a N-acetilcisteína (NAC) pode sequestrar O₂^•- e abolir a fluorescência plaquetária nesses experimentos⁴⁶. Aqui, mostramos que o inibidor seletivo de NOX VAS2870 eficaz e instantaneamente reduz a fluorescência em plaquetas aderidas ao colágeno ou fibrinogênio ( Figura 4A ) ou respondendo à trombina ( Figura 4B ). Isso sugere que os NOXs são a fonte de O₂^•- nessas condições experimentais. Filmes representativos para fluorescência DHE (excitação de 405 nm) em resposta à adesão ao colágeno ou fibrinogênio ou à estimulação por trombina de plaquetas aderidas ao PLL estão incluídos como Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, respectivamente. É importante notar que o PEG-SOD, que foi usado com sucesso em outras configurações experimentais como ^{um sequestrador} de O₂^•-, não é eficaz neste tipo de experimento. Não temos uma explicação clara para isso no momento. Podemos supor que o PEG-SOD atinge os compartimentos celulares nos quais o₂^•- induz aumento da fluorescência nos ensaios baseados em imagem, seja com baixa eficiência ou cinética lenta. Investigações mais focadas podem ser necessárias para esclarecer este ponto.

Aplicamos a medida de_O2^•- por EPR em plaquetas em diferentes estudos publicados anteriormente ^{1,13,47,48,49,50}. Uma etapa crucial para esta técnica é a preparação de uma curva de calibração usando CM^● disponível comercialmente (ou seja, o produto da reação entre a sonda de rotação CMH e O₂^•- e as espécies ressonantes medidas por EPR). A reação de CMH e O₂^•- é mostrada na Figura 5A, e exemplos representativos do sinal EPR induzido por diferentes concentrações de CM^● são mostrados na Figura 5B. Os dados de diferentes concentrações de CM^● foram usados para construir uma curva de calibração descrevendo a correlação linear entre a quantidade de CMH oxidado e a intensidade do sinal EPR nas amostras (Figura 5C). A equação abaixo descreve a correlação entre a concentração ^de CM● e a intensidade do sinal EPR e é o ponto de partida para o cálculo da curva de calibração para os experimentos neste estudo (Equação 1):

Como as concentrações ^de CM● e sua intensidade de EPR correspondente foram obtidas experimentalmente, a inclinação e a interceptação do eixo Y da curva de calibração podem ser calculadas. No exemplo mostrado na Figura 5C, Inclinação = 1.002.169 e Interceptação = 596.383. Portanto, a equação para a curva de calibração pode ser reescrita como:

Ao reorganizar a equação acima, é possível calcular a concentração de CM^● para diferentes amostras com base em seus valores de intensidade EPR (Equação 2):

Uma vez conhecida a concentração de CM^● nas amostras, é possível calcular sua taxa de geração por plaqueta e unidade de tempo com a equação abaixo (Equação 3):

Usando a Equação 2, a Equação 3 pode ser reescrita como (Equação 4):

Que no exemplo mostrado na Figura 5C pode ser reescrito como:

A taxa de oxidação do CMH será expressa como attomoles de CM^● gerados por plaqueta por minuto. Este valor pode ser usado para comparar a taxa de geração de O₂^•- entre experimentos e doadores, o que não é possível com sondas fluorescentes como DHE (ou DCFDA). As sondas fluorescentes geralmente permitem apenas uma estimativa do efeito de diferentes condições na geração de O₂^•- como mudanças na intensidade de fluorescência dentro do mesmo experimento. Como para todas as técnicas descritas neste artigo, a especificidade da detecção foi confirmada com sequestrantes de ROS (por exemplo, PEG-SOD, NAC) ou inibidores seletivos de enzimas geradoras de ânion superóxido (por exemplo, VAS2870 para inibir NOXs). Aqui, apresentamos dados para estimulação plaquetária (Figura 6) com trombina (Figura 6A, C, E) ou colágeno (Figura 6B, D, F). Para ambos os agonistas, PEG-SOD foi usado para confirmar que O₂^•- é detectado, enquanto a falta de efeito para a catalase peguilada (PEG-Cat.) sugere que o peróxido de hidrogênio não é detectado por esta técnica ( Figura 6C, D , respectivamente). VAS2870 abole os sinais de EPR induzidos por trombina ( Figura 6E ) e colágeno ( Figura 6F ) , sugerindo que os NOXs são a principal fonte de plaquetas O₂ ^{• -} em resposta a ambos os agonistas.

Figura 1: análise de citometria de fluxo de suspensões de plaquetas. (A) Apresentação típica de gráficos de espalhamento direto (FSC) e lateral (SSC) para plaquetas isoladas. (B) A imunocoloração da suspensão plaquetária com um anticorpo anti-CD41 confirma >98% das partículas na preparação como plaquetas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Reação química do DHE com ânion superóxido e outras ROS e propriedades espectrais de seus produtos. Estrutura e propriedades espectrais do DHE e seus dois produtos de oxidação 2-hidroxi-etídio (2OH-Et+), gerado por reação com ânions superóxido, e etídio (Et+), gerado por reação com outros tipos de ROS (por exemplo, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio). O pico de excitação a 405 nm, destacado por um retângulo azul tracejado na figura, é específico para 2OH-Et+ e pode, portanto, ser usado para detectar/medir O₂^•-. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Geração de ânions superóxido dependentes de trombina e colágeno detectada por DHE e citometria de fluxo. Histogramas representativos para coloração DHE de (A) plaquetas em repouso e (B) estimuladas por trombina. A barra indica valores de coloração DHE abaixo de 500, que é de 70,7% e 16,1% para plaquetas em repouso e estimuladas por trombina, respectivamente. Essa técnica foi utilizada para estimar a geração de ânions superóxido em (C) 0,1 unidade/mL de trombina e (D) 3 μg/mL de plaquetas estimuladas por colágeno. PEG-SOD (100 unidades/mL) foi usado para confirmar que os ânions superóxido são medidos neste experimento, enquanto 10 μM VAS2870 foi usado para identificar as enzimas NOX como a fonte de ânions superóxido. Cada ponto de dados foi calculado como intensidade média de fluorescência (MFI) de 50.000 plaquetas, e cada experimento foi repetido cinco vezes independentes (n = 5), com a média ± SEM mostrada nos gráficos. A significância estatística foi avaliada por ANOVA one-way com pós-teste de Tukey para comparações pareadas (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Geração de ânions superóxido dependentes de colágeno, fibrinogênio e trombina detectada por imagem de fluorescência DHE. (A) A cinética de geração de ânions superóxido foi avaliada para plaquetas aderidas ao colágeno ou fibrinogênio. As plaquetas foram dispensadas em lâminas μ revestidas 1 min após o início da imagem, enquanto 10 μM VAS2870 foram adicionadas 5 min após o início da coleta de imagens. (B) Cinética de geração de ânions superóxido para plaquetas após estimulação com trombina. As plaquetas foram autorizadas a aderir às lâminas de μ revestidas com PLL por 10 minutos antes do início da coleta de imagens. Após 2 min, 0,1 unidade/mL de trombina foi adicionada e, após mais 5 min, 10 μM VAS2870 foi adicionada (ou seja, 7 min do início da imagem). O esquema experimental é apresentado na parte superior dos painéis, enquanto imagens representativas de 0 min, 1 min, 3 min, 6 min e 9 min são mostradas no meio dos painéis. A quantificação de fluorescência DHE de plaqueta única é mostrada na parte inferior dos painéis e foi obtida por análise de intensidade de fluorescência usando ImageJ. Os dados são ± média de SEM de 8 a 12 plaquetas por condição em 4 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cálculos da curva de calibração e da taxa de oxidação do CMH. (A) Estrutura química e propriedades EPR do CMH e CM^●. (B) Exemplos representativos de dados de EPR para diferentes concentrações de CM^● (100 nM a 10 μM). (C) Curva de calibração da intensidade de EPR versus concentração de CM^● . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Detecção da produção de ânions superóxido por plaquetas após estimulação de trombina ou colágeno. A saída de ânion superóxido foi medida por EPR com a sonda de spin CMH em plaquetas estimuladas com (A) 0,1 unidade/mL de trombina ou (B) 3 μg/mL de colágeno. (C, D) Uma concentração de 100 unidades/mL do sequestrante de ânions superóxido PEG-SOD ou 100 unidades/mL da catalase peguilada sequestradora de peróxido de hidrogênio (PEG-Cat.) foi incluída nas condições testadas para ambos os agonistas. A fonte de ânion superóxido foi investigada por co-incubação com o inibidor de NOX VAS2870 (10 μM). Tanto a trombina (E) quanto o colágeno (F) dependem da atividade do NOX para a geração do ânion superóxido. Ao longo da figura, a taxa de reação do ânion CMH/superóxido foi calculada a partir dos traços de EPR, conforme descrito no manuscrito (Equação 4). Os dados são médios ± SEM de 5 (C,D) e 4 experimentos independentes (E,F). A significância estatística foi avaliada por ANOVA one-way com pós-teste de Tukey para comparações pareadas (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Filme representativo para fluorescência DHE (excitação de 405 nm) em resposta à adesão ao colágeno. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Filme representativo para fluorescência DHE (excitação de 405 nm) em resposta ao fibrinogênio de adesão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Filme representativo para fluorescência DHE (excitação de 405 nm) em resposta à estimulação por trombina de plaquetas aderidas ao PLL. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste manuscrito, apresentamos três técnicas diferentes com o potencial de avançar na capacidade de investigar a regulação dependente de redox da função plaquetária por meio da detecção seletiva de O₂^•-. Os dois primeiros métodos são uma melhoria nas técnicas existentes devido à sonda redox utilizada (DHE em vez do DCFDA mais comum, mas menos confiável). Essas técnicas são, portanto, facilmente acessíveis e a maioria dos laboratórios pode adotá-las de forma eficaz sem equipamentos específicos ou custos de treinamento. A terceira técnica baseia-se no uso de equipamentos especializados para a análise da oxidação da sonda de spin CMH por EPR. Essa técnica requer a compra de equipamentos e reagentes especializados e o treinamento dedicado do usuário do laboratório. Consequentemente, parece adequado para laboratórios que se concentram especificamente no estudo de eventos dependentes de redox em plaquetas (ou outras células).

Para técnicas que utilizam DHE, a seleção do comprimento de onda para a excitação é crucial para obter a detecção específica de O₂^•-. O 2-hidroxi-etídio (2OH-Et+) gerado pela reação do DHE com O₂^•- é excitado a 405 nm, enquanto o etídio (Et+) gerado pela reação geral do DHE com ROS (por exemplo, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio) tem um pico de excitação em torno de 520 nm, mas nenhuma excitação em 405 nm (Figura 1)⁵¹. O uso de DHE em vez de DCFDA protege dos artefatos causados pela reação direta dessa sonda com componentes celulares, como peroxidases, outras enzimas contendo heme e agentes redutores de íons metálicos 42,43,44. O DHE tem sido sugerido como uma ferramenta mais segura para estudos redox celulares^38,39. Aqui, propomos o uso de DHE com duas técnicas de leitura diferentes: 1) citometria de fluxo e 2) imagem de fluorescência.

A citometria de fluxo é geralmente uma técnica que permite o manuseio contemporâneo de várias amostras com um rendimento baixo a médio⁵². Infelizmente, a abordagem utilizada neste estudo não permite a fixação da amostra. Embora a diluição das amostras com tampão de Tyrode modificado gelado estabilize a fluorescência nas amostras por até 30 min, a análise de todas as amostras precisa ser realizada nesse período. Isso limita significativamente o número de amostras por experimento. Várias execuções experimentais controladas internamente no mesmo dia e usando a mesma preparação de plaquetas são possíveis, embora os resultados devam ser normalizados para controles e não considerados como experimentos independentes. Essa técnica foi utilizada pelos autores deste manuscrito para destacar o papel da modulação plaquetária dependente de redox nas respostas a diferentes agonistas e moduladores^46,50. Este método pode ser modificado adotando o uso de uma versão quimicamente modificada do DHE que permite o direcionamento das mitocôndrias (ou seja, Mitosox) ⁵³, que tem sido usado para estudos de plaquetas com foco em NOX2⁵⁴. Esta é uma oportunidade interessante que ainda não foi aproveitada por nossos laboratórios.

A técnica de imagem de fluorescência usando DHE proposta aqui tem a vantagem de determinar o curso do tempo de geração de_O2^•- em plaquetas após adesão (agonistas absorvidos na superfície do poço de imagem) ou estimulação (agonistas em suspensão). Isso permite a interpretação da interação de diferentes fases do processo de ativação plaquetária e a avaliação da contribuição de diferentes fontes de O₂^•- (por exemplo, diferentes enzimas geradoras de ROS, por exemplo, NOXs). Nenhuma técnica existente permite esse tipo de investigação. Isso tem um custo em termos de rendimento do ensaio, com cada condição testada levando 30 minutos (o que inclui configuração de μ lâminas, foco e seleção de campo, geração de imagens e economia de dados). Portanto, essa técnica permite testar um pequeno número de condições por dia útil (ou seja, menos de 10). Embora um microscópio confocal tenha sido usado para os dados mostrados aqui, confirmamos que resultados igualmente bons podem ser obtidos com um microscópio de epifluorescência com capacidade de excitação de 405 nm. Isso reduz a necessidade de configurações caras de microscopia confocal e torna essa técnica mais acessível.

O protocolo de EPR foi desenvolvido com base em estudos anteriores em diferentes tipos de células⁵⁵. Essa técnica é amplamente reconhecida como a ferramenta mais confiável para o estudo da geração de ROS e a investigação de eventos dependentes de redox em células³⁸. Além da confiabilidade superior em relação a outras técnicas devido à especificidade da reação das sondas de spin da hidroxilamina com radicais livres de oxigênio⁵⁶, a EPR permite a quantificação da taxa de geração de_O2^•- e sua comparação entre diferentes indivíduos e experimentos. Isso não é possível com técnicas baseadas em fluorescência, que só nos permitem estimar o efeito de condições selecionadas na intensidade de fluorescência em um único experimento e preparação de plaquetas. Embora este protocolo de EPR tenha sido desenvolvido como uma técnica para combinar com a agregação plaquetária para o monitoramento paralelo da ativação plaquetária e_O2^•- geração¹, esses experimentos podem ser realizados sem a análise paralela da agregação. Mesmo sem análise paralela da agregação plaquetária, sugere-se realizar a incubação em um agregometer para garantir uma estimulação plaquetária eficaz, o que requer a tensão de cisalhamento proporcionada pela agitação contínua. Se os experimentos precisarem ser realizados em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem agitação, os níveis de produção de_O2^•- são significativamente mais baixos. Portanto, se essa abordagem experimental for escolhida, sugerimos realizar a incubação de CMH em uma roda giratória e com plaquetas mais densamente concentradas (ou seja, 1 x 10⁹/mL), o que leva a um sinal suficientemente forte para detecção pelo espectrômetro EPR.

Em resumo, apresentamos aqui três técnicas validadas para a detecção de O₂^•- em plaquetas. Eles oferecem diferentes vantagens e podem ser escolhidos de acordo com os objetivos e prioridades experimentais. A primeira técnica baseada no uso de DHE por citometria de fluxo é a menos trabalhosa e demorada e pode, portanto, ser escolhida como uma análise de nível básico. A segunda técnica, baseada no uso de DHE por microscopia de fluorescência, permite uma apreciação da cinética rápida de geração de O₂^•- e o estudo de como diferentes cascatas de sinalização podem afetar a resposta oxidativa na escala de tempo de segundos (enquanto outras técnicas permitem apenas a investigação final de eventos que ocorrem minutos após a estimulação). Finalmente, o EPR permite a quantificação da taxa de geração de O₂^•- e sua comparação entre experimentos e indivíduos. Por esse motivo, a última técnica é particularmente útil para estudos clínicos que visam caracterizar a resposta oxidativa em plaquetas de diferentes indivíduos (por exemplo, comparação entre pacientes ou pacientes versus controles saudáveis). No geral, essas três técnicas oferecem vantagens significativas sobre os métodos existentes e representam um avanço significativo nas ferramentas experimentais à nossa disposição para estudar eventos dependentes de redox em plaquetas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagente para EPR (sonda de rotação)
BD FACSAria III	BD Biosciences	Citômetro de fluxo	NA
Albumina de soro bovino	Merck/Sigma	A7030	Para revestimento de μ-slide
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	Espectrômetro EPR
Catalase– polietilenoglicol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Sequestrante de peróxido de hidrogênio (controle de especificidade)
ChronoLog Modelo 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagente para EPR (controle de calibração)
deferroxamina	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagente para EPR
dietilditiocarbamato (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagente para EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Sonda de ânion
superóxido Dimetilsulfóxido	Merck/Sigma	34869	Para preparação de solução estoque
Placas de cera de vedação EPR	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumível para EPR
EPR água de grau	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagente para EPR
Fibrinogênio de plasma humano	Merck/Sigma	F4883	Para revestimento μ-slide
Anticorpo anti-CD41 humano FITC	BioLegend	303704	Coloração específica para plaquetas para citometria de fluxo
Cuvetes de vidro	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumível para incubação em aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	Para estimulação plaquetária
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	Para isolamento de plaquetas
Micropipetas DURAN 50µ l	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µ L	Consumível para
cloridrato de poli-L-lisina	Merck/Sigma	P2658	Para revestimento μ-slide
Prostaglandina E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	Para isolamento plaquetário
Citrato de sódio (solução a 4% p/v)	Merck/Sigma	S5770	Para isolamento plaquetário
Barras de agitação (revestidas com Teflon)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumível para incubação em aggregometer
Superóxido dismutase– polietilenoglicol (PEG-SOD)	Merck / Sigma	S9549	Eliminador de ânions superóxido (controle de especificidade)
Trombina de plasma humano	Merck / Sigma	T6884	Para estimulação plaquetária e revestimento de lâminas μ
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	Inibidor de NOX
Microscópio confocal Zeiss 510 LSM Microscópio confocal	Zeiss	NA