Apresenta-se um protocolo para cirurgia de osteotomia femoral com o uso de fixação interna em axolotes maduros. O procedimento pode ser utilizado para realizar estudos comparativos sobre regeneração de membros e consolidação de fraturas em anfíbios aquáticos.
Artigo de método
Estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em Ambystoma mexicanum
Neste artigo
Resumo
Resumo
O axolote (Ambystoma mexicanum) é um organismo modelo promissor para a medicina regenerativa devido à sua notável capacidade de regenerar órgãos perdidos ou danificados, incluindo membros, cérebro, coração, cauda e outros. Estudos sobre axolotes lançam luz sobre as vias celulares e moleculares que regem a ativação do progenitor e a restauração tecidual após a lesão. Esse conhecimento pode ser aplicado para facilitar a cicatrização de lesões incompetentes de regeneração, como a não consolidação óssea. No protocolo atual, a estabilização da osteotomia do fêmur usando um sistema de fixação de placa interna é descrita. O procedimento foi adaptado para uso em animais aquáticos (axolote , Ambystoma mexicanum). Foram utilizados axolotes de ≥20 cm focinho-cauda com fêmures comparáveis totalmente ossificados do tamanho de camundongos, e atenção especial foi dada ao posicionamento e fixação da placa, bem como aos cuidados pós-operatórios. Esta técnica cirúrgica permite a fixação óssea padronizada e estabilizada e pode ser útil para comparação direta com a regeneração de membros de axolotes e estudos análogos de cicatrização óssea em anfíbios e mamíferos.
Introdução
O axolote (Ambystoma mexicanum) é um modelo importante para a regeneração de órgãos, incluindo cauda, medula espinhal, cérebro, coração, brânquias e membros 1,2,3,4,5. Estudos detalhados da regeneração de membros de axolotes descobriram mecanismos de desdiferenciação celular e a formação de um pool de células-tronco, blastema, no local da amputação. Devido à capacidade das células do blastema de reconstruir todas as partes dos membros ausentes, incluindo um esqueleto padronizado 6,7, o axolote parece ser um organismo modelo atraente para estudos de cicatrização óssea. Recentemente, vários estudos se concentraram mais na biologia óssea em axolotes, descrevendo a morfologia esquelética, a composição celular e a dinâmica de ossificação.
Verificou-se em mamíferos que o processo de cicatrização óssea em ossos longos ocorre via ossificação endocondral e consiste em vários estágios: hematoma, tecido de granulação e formação de calo mole, ossificação de calo em calo duro e osso tecido e remodelação óssea8. Um estudo recente mostrou que estágios semelhantes podem ser observados na cicatrização óssea do axolote9.
Até agora, as fraturas de axolote eram estudadas em um sistema não estabilizado, em que o osso é simplesmente cortado com tesoura de iridectomia. As grandes fraturas foram criadas no zeugópode, onde a osteotomia é realizada em um dos ossos, enquanto o outro serve de suporte 10,11. Em contraste, as fraturas são rotineiramente estudadas em mamíferos, incluindo ratos e camundongos, usando sistemas de fixação confiáveis, como pinos intramedulares e placas de alinhamento ósseo, para controlar o tamanho da fratura e garantir o alinhamento ósseo.
Assim, o método visa garantir uma fixação estabilizada e uniforme do fêmur axolote antes da osteotomia. Para tornar os estudos de axolotes mais comparáveis aos de mamíferos, incluindo camundongos e humanos, foram considerados o pino intramedular12, o fixador de placa externa13,14 e a fixação da placa de alinhamento ósseo interno 15,16,17. Este último demonstrou garantir a fixação óssea adequada e permitir a criação de uma lacuna de um determinado tamanho usando um ou dois cortes com uma serra Gigly de um diâmetro específico. Como os axolotes representam as larvas aquáticas de Ambystoma mexicanum, o fixador externo pode ter causado complicações pós-cirúrgicas devido à ferida aberta e ao contato com a água. Como os axolotes não desenvolvem centros de ossificação secundários nem mesmo muito tarde em seu desenvolvimento (20 anos18) e, portanto, a haste intramedular padrão usada em camundongos pode não ser impedida de perfurar as epífises, foi tomada a decisão de aplicar um método de fixação de placa interna a grandes axolotes. Em axolotes grandes, o tamanho do fêmur e o grau de ossificação se assemelham aos de um camundongo adulto, permitindo assim a osteotomia diafisária média com fixação da placa de titânio1.
O tamanho da lacuna da fratura determina em grande parte a dinâmica e o resultado da cicatrização. Por exemplo, em um camundongo, as fraturas estabilizadas de 0,25 mm cicatrizam principalmente por ossificação intramembranosa devido ao seu pequeno tamanho e estabilização rígida; uma fratura de 0,7 mm cicatriza por ossificação endocondral, com a formação de um calo cartilaginoso ao redor da fratura; Grandes defeitos, como defeitos de tamanho crítico de 3,5 mm, não cicatrizam completamente e, portanto, são usados para modelar a não consolidação da fratura óssea16. Neste estudo, o protocolo de fixação da placa do fêmur do axolote antes da osteotomia usando o exemplo de uma lacuna de fratura de 0,7 mm foi estabelecido com o objetivo final de comparar a cicatrização óssea do axolote com a do camundongo9.
Após a osteotomia, as fraturas foram submetidas ao processo de ossificação endocondral, embora mais lenta do que em camundongos, possivelmente devido ao estilo de vida aquático dos axolotes e taxas de divisão celular mais lentas. No método aqui apresentado, mostra-se a osteotomia com gap de 0,7 mm com fixação de placa rígida; no entanto, outros tamanhos de folga e fixadores semiflexíveis, bem como placas de diferentes materiais, são potencialmente possíveis. No geral, o método apresentado aqui pode ser usado para fixação óssea padronizada e será útil para estudos comparando a regeneração de membros de axolotes com a cicatrização óssea ou estudando a cicatrização óssea em axolotes sob diferentes condições para garantir a fixação padronizada de fraturas.
Protocolo
O seguinte procedimento foi realizado com a aprovação do Magistrado de Viena (GZ: MA 58-65248-2021-26). Axolotes longos (Ambystoma mexicanum) de 5 a 8 anos de idade, ≥ 20 cm focinho à ponta da cauda (focinho à ponta da cauda) foram usados para cirurgia de fratura e amputações. Tanto homens quanto mulheres foram usados para as cirurgias. Os axolotes foram criados nas instalações do Instituto de Pesquisa de Patologia Molecular. A dor e o risco de infecções foram controlados com analgésicos e antibióticos adequados para garantir um resultado bem-sucedido. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação animal
- Banhar o animal em solução de benzocaína a 0,03% por cerca de 15-20 min até que a sedação total seja alcançada e não haja movimento reflexivo ao tocar o membro com uma pinça.
- Coloque o animal com o lado ventral voltado para baixo em toalhas de papel molhadas embebidas em solução de benzocaína a 0,03% e cubra-o com papel toalha embebido em benzocaína. A pele de animais aquáticos, como os axolotes, é sensível ao ressecamento e, portanto, é essencial cobrir a superfície corporal para evitar a desidratação e garantir a respiração cutânea (pele).
- Estique o membro posterior a ser operado usando uma pinça de anel. Não aplique reagentes de desinfecção, como etanol, pois a pele do axolote é sensível a produtos químicos e facilmente irritada. Em vez disso, use 0,7x PBS (A-PBS) com 50 U/mL de penicilina e 20 μg/mL de estreptomicina para limpar o membro e, posteriormente, para irrigação óssea ao serrar.
NOTA: A infecção geralmente não é uma preocupação para as cirurgias realizadas em axolotes. No entanto, devido à natureza aquática desses animais e às suturas colocadas na superfície da pele, recomendamos o uso de antibióticos para evitar qualquer contaminação do sítio cirúrgico.
2. Cirurgia
NOTA: Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas. Métodos comuns de esterilização, como esterilização por calor, autoclavagem e lavagem em etanol a 70%, seguidos de remoção completa dos restos de álcool, são adequados para esse fim. Se estiver operando em vários animais, esterilize as ferramentas usando um esterilizador de esferas quentes ou etanol a 70%.
- Faça uma incisão longitudinal lateral (1,5-2 cm) com um bisturi acima do osso do fêmur, abrangendo toda a coxa no membro posterior superior. Para fazer isso, palpe o osso antes de cortar a pele.
- Desloque cuidadosamente os músculos e nervos do local da cirurgia sem cortar. Use uma pinça curvada para fazê-lo com eficiência.
- Coloque suavemente uma pinça curvada sob o fêmur para expô-lo para a cirurgia.
- Coloque uma placa fixadora rígida de 7,75 mm com 4 orifícios junto com a diáfise do fêmur, evitando tocar nas articulações, e prenda-a na posição alinhada com uma pinça.
- Use quatro parafusos de titânio de 2 mm para prender o osso à placa.
NOTA: Os parafusos usados neste protocolo têm um design complexo e consistem em 4 partes: a parte principal (será aparafusada no osso), cabeça do parafuso (permite a remoção dos parafusos e da placa usando a chave de caixa quadrada), pescoço mais estreito (usado como ponto de ruptura uma vez que o parafuso é apertado no osso) e uma alça de parafuso (usada para prender à chave de fenda e ao dispositivo de guia da serra). - A ordem de fixação do parafuso é importante. Comece com os parafusos internos primeiro e depois com os dois parafusos externos para garantir que a placa esteja alinhada com o eixo ósseo. Use uma broca manual para criar o primeiro orifício no osso para facilitar a inserção do parafuso, seguido pela colocação do1º parafuso. Perfure no meio da circunferência óssea para evitar osso mais fino de um lado, o que pode resultar em fratura óssea espontânea. Use irrigação com 0,7x PBS + 1% Pen/Strep durante a perfuração. Nãoquebre a alça do(s) 1º(s) parafuso(s)(opcional: 1º e2º).
- Aplique o dispositivo de guia da serra no(s) parafuso(s)1º (opcional: 1ºe 2º ) e alinhe-o com o osso e a placa.
NOTA: Neste protocolo, uma placa, parafusos, um dispositivo de guia de serra e uma serra são fornecidos pelo mesmo fabricante e otimizados para se encaixarem. O dispositivo de guia de serra pode vir em diferentes tamanhos para ser compatível com diferentes placas e tamanhos de serra. - Use o dispositivo de guia de serra para perfurar e inserir o restante dos parafusos. Garanta o alinhamento da placa com o osso. Quebre as alças dos parafusos.
- Coloque um pedaço de filme plástico (6-7 mm por 4-5 cm), esterilizado com etanol a 70% e depois autoclavado ou esterilizado por calor (140 °C por 4 horas), sob o fêmur para evitar danos aos tecidos moles durante o processo de osteotomia.
NOTA: Para isso, pode-se usar um pedaço de filme plástico, cortado de um saco para esterilização por calor. - Coloque a serra de fio Gigly entre o osso e o filme de proteção.
- Corte o osso usando a serra de fio Gigly de 0,66 mm, criando um único corte de 0,7 mm no fêmur. Use irrigação constante com 0,7x PBS + 1% Pen/Strep durante a serragem para minimizar os danos e o atrito nos tecidos.
- Remova a serra e a guia da serra e use uma chave de fenda para quebrar as alças dos parafusos.
- Remova o filme de proteção e irrigue o local da cirurgia com 0,7x PBS + 1% Pen/Strep.
- Cubra a parte superior da placa e os parafusos com cera de abelha de osso estéril para proteger a pele e os músculos da irritação pelas bordas dos parafusos.
- Coloque os músculos e a pele em cima da cera de abelha óssea.
- Feche o local da incisão com uma sutura sintética 7.0 (polipropileno/polietileno) usando pontos simples interrompidos. A sutura sintética é usada para minimizar a contaminação com bactérias e fungos transmitidos pela água.
3. Manejo pós-operatório
- Para despertar o animal, coloque-o em um tanque com água fresca artificial da lagoa, suplementada com 50 U/mL de penicilina, 20 μg/mL de estreptomicina e analgésico Butorfanol (0,5 mg/L de água).
- Observe o animal começar a mover as brânquias, dar passos e nadar - geralmente dentro de 1 h após a cirurgia.
- Mantenha o animal por 3 dias em água de lagoa artificial com 50 U/mL de penicilina e 20 μg/mL de estreptomicina antes de devolvê-lo ao tanque de retenção. Para garantir a analgesia, adicione Butorfanol (0,5 mg/L de água).
- Certifique-se de que as suturas permaneçam no lugar e que ocorra a cicatrização adequada da ferida.
Resultados
O procedimento cirúrgico aqui descrito (Figura 1) dura entre 20 min e 30 min e requer um cirurgião e um assistente. Opcionalmente, use um microscópio de dissecção binocular ou sistema de lupa.
Figura 1: Esquemas do procedimento cirúrgico e da configuração experimental. (A) O fêmur é exposto por dissecção de pele e afastamento dos músculos do campo cirúrgico. (B) Uma placa de titânio está alinhada com o fêmur. (C) O1º orifício interno é criado usando uma furadeira manual. (D) Um parafuso é colocado no1º orifício. (E) A guia da serra e da broca é inserida e fixada na alça do1º parafuso. (F) O restante dos parafusos é fixado na ordem indicada. (G) A serra e a guia da broca são cuidadosamente removidas e as alças dos parafusos são quebradas ao girar a chave de fenda devido à maior rigidez do osso em comparação com o pescoço do parafuso. (H) A película de segurança e a serra Gigly são colocadas sob o osso. (I) A osteotomia é realizada sob irrigação constante do local de corte. (J) As cabeças dos parafusos são cobertas com cera de abelha de osso estéril antes de substituir o músculo e fechar a pele com pontos. (D,E,F): os números indicam a sequência em que os furos são feitos e os parafusos são colocados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Atenção especial deve ser dada às etapas de alinhamento placa-osso e fixação da placa (Figura 2). A variação na idade do axolote leva a pequenas diferenças no tamanho, forma e grau de ossificação do fêmur. Assim, em alguns casos, foi um desafio encontrar uma boa posição da placa para garantir espaço suficiente para a fixação do parafuso. No total, a falha de fixação foi observada em 23,5% dos animais, o que pode ser resultado de ossos mais estreitos ou menos ossificados em animais mais jovens (Figura 3). A falha de fixação resultou em um desalinhamento do osso osteotomizado. Isso foi detectado pela presença de parafusos destacados, deslocamento dos fragmentos ósseos com desalinhamento do eixo ósseo de >20° ou deslocamento lateral pronunciado. Enquanto o primeiro pode ser observado durante a colheita das amostras, os outros podem não ser óbvios até que a análise de microCT seja feita. Enquanto nos membros devidamente alinhados, o tecido de granulação estava localizado na lacuna da fratura 3 semanas após a cirurgia, nas amostras desalinhadas, ele parecia muito maior, possivelmente na tentativa de estabilizar o osso.
Figura 2: Visão geral do procedimento cirúrgico e animal resultante com osteotomia de membro posterior esquerdo. (A) São apresentadas as principais etapas da cirurgia: exposição do fêmur, alinhamento correto da placa de titânio, utilização de guia de serra para confecção de furos no osso com broca manual e aplicação dos parafusos, uso de película protetora e guia de serra (seta amarela) para osteotomia, Fratura do fêmur de 0,7 mm (seta branca), cobrindo as cabeças dos parafusos com cera de abelha de osso estéril (seta roxa) e o resultado final com membro fechado. (B) Animal após a cirurgia. A seta indica o membro posterior esquerdo, onde foi realizada a cirurgia de osteotomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O uso de cera de abelha de osso estéril antes da costura da pele (Figura 2) reduziu a reabertura pós-operatória da pele acima da placa de fixação. O membro permaneceu funcional e pôde ser usado para ficar em pé e andar logo após a remoção da anestesia.
Figura 3: Resultados representativos da osteotomia fixada em placa de axolote. (A) MicroCT de fêmures intactos e fraturados. Observe uma lacuna no osso 3 semanas após a fratura. 23,5% dos membros apresentaram falha na fixação, resultando em desalinhamento ósseo. Nas amostras fixadas, o calo duro está se formando em 6-9 meses após a fratura. (B) Coloração Safranin O/Light Green de fêmures intactos e fraturados. Observe uma lacuna com tecido de granulação no osso 3 semanas após a fratura. Aos 6 meses após a fratura, o calo duro consiste em osso e cartilagem tecidos. Barras de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A microCT e a análise histológica (coloração Safranin O/Light Green) permitiram a visualização da posição dos fragmentos ósseos e do tamanho do gap da fratura, bem como o estado de cicatrização óssea. Os dados de microCT foram adquiridos com resolução nominal de 10,05 μm em um scanner de espécimes disponível comercialmente e analisados usando software compatível (ver Tabela de Materiais), conforme descrito em Polikarpova et al.9. Em contraste com os mamíferos, onde a fratura do mesmo tamanho (0,7 mm) é fechada com calo cartilaginoso e ósseo 3-5 semanas após a cirurgia, nenhum calo foi observado 3 semanas após a cirurgia em axolote. Tipicamente, o calo cartilaginoso era visível aos 3 meses de pós-operatório9 e o calo ósseo ossificado - aos 6 meses de pós-operatório (Figura 3).
Discussão
O método atualmente descrito de fixação e osteotomia da placa do fêmur permite sua aplicação em animais aquáticos, como o Ambystoma mexicanum (axolote). Este método cirúrgico foi recentemente utilizado para comparar a consolidação de fraturas e regeneração de membros em axolotes com a consolidação de fraturas em camundongos9. Como nos camundongos, uma placa fixadora de 4 orifícios pode ser fixada ao osso com parafusos auto-quebráveis, e uma serra Gigly pode ser usada para criar uma fratura de tamanho uniforme15. A fixação da placa facilita a retenção do tamanho da lacuna e garante o alinhamento do fragmento ósseo. O método de analgesia também foi otimizado com a implementação do banho de butorfanol, pois é menos invasivo (em comparação com as injeções de buprenorfina), que não é relatado como influenciando a cicatrização óssea (como no carprofeno). No entanto, como pouco se sabe sobre o manejo da dor em anfíbios em geral e a dor pós-operatória especificamente, o uso de tratamento analgésico preemptivo pode ser sugerido como um refinamento adicional do procedimento. Aqui, a adaptação de protocolos utilizados em outras espécies de anfíbios poderia ser considerada19. Para uma avaliação objetiva do estado de saúde do animal após a cirurgia, recomenda-se a implementação e aplicação de folhas de pontuação específicas para a definição da intervenção e dos parâmetros humanos.
Ao contrário do método descrito para o camundongo16, um filme plástico é usado para proteger o tecido subjacente antes da osteotomia. Além disso, devido à natureza aquática e à musculatura menos pronunciada dos membros, os axolotes necessitaram de um adesivo de proteção com cera de abelha no topo da placa e dos parafusos, bem como atenção especial ao uso de pontos sintéticos de pele, pois os biofilmes foram coletados nas suturas absorvíveis (à base de poliglactina 910). A penicilina-estreptomicina é utilizada como parte do tratamento pós-operatório para prevenir a contaminação da ferida e da sutura.
O método foi otimizado para axolotes de 5 a 8 anos de idade e ≥20 cm do focinho à cauda e, portanto, limitado a animais grandes e bastante velhos. Esta também pode ser a razão para a cicatrização óssea mais lenta do que a dos mamíferos devido às taxas gerais de proliferação celular mais baixas em animais tão velhos. No entanto, isso pode ser benéfico se for necessário resolver as etapas mais sutis da cicatrização óssea20. Outra característica importante do método é a natureza comercial dos principais materiais consumíveis utilizados no protocolo: placa de fixação, parafusos e serra Gigly. Devido à compatibilidade otimizada desses dispositivos, são criados defeitos ósseos de tamanho e distância confiáveis das extremidades ósseas. No protocolo atual, é descrita a aplicação de uma placa metálica de titânio em ossos de axolotes. Para camundongos, placas de plástico PEEK foram desenvolvidas para facilitar a imagem de microCT das amostras17. As placas de PEEK em axolotes também foram testadas com resultados semelhantes; no entanto, eles poderiam ser aplicados apenas em animais maiores devido ao volume ligeiramente maior das placas fixadoras de plástico em comparação com as placas de metal.
Neste estudo, utilizamos animais de 5 a 8 anos de idade e observamos falha de fixação em 23,5% de todas as cirurgias, com maiores taxas de falha nos animais mais jovens. Assim, recomendamos o uso de animais mais velhos com maior grau de ossificação óssea. A taxa de falha foi independente do sexo; assim, ambos os sexos são igualmente qualificados. Para o planejamento do tamanho da amostra, deve-se calcular aproximadamente 20% de perda amostral devido ao desfecho desfavorável. O número exato de animais depende do desenho experimental e do número de condições a serem analisadas; No entanto, o número mínimo de animais recomendado por grupo deve ser de 5+20% = 6 animais.
No geral, este método oferece uma melhoria significativa em relação às cirurgias não fixadas ou vizinhas usadas anteriormente. Além disso, usando este método, é possível estudar grandes axolotes que possuem ossos semelhantes em tamanho e maturação aos usados em estudos com camundongos. Isso é importante, pois o microCT só é possível em grandes axolotes devido ao grau de ossificação.
O método é um avanço importante na área, pois permite a comparação direta da regeneração do membro do axolote com a consolidação da fratura, com tamanho de gap controlado e alinhamento ósseo adequado (em 76,5% das cirurgias realizadas). Além disso, com placas de fixação de plástico PEEK, microCT e raios-X podem ser usados para avaliação do processo de cicatrização óssea. Finalmente, a cirurgia descrita aqui pode ser adaptada para outros anfíbios aquáticos, como tritões e sapos, facilitando ainda mais os estudos entre espécies de cicatrização de fraturas ósseas.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Sabine Stumpp pelo excelente suporte técnico e a Lidia Grösser pela assistência nas cirurgias. Esta pesquisa foi financiada pelo Fundo Austríaco de Ciência [Hertha Firnberg Fellowship número T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [CRC 1444].
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Serra de fio Gigly de 0,66 mm | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Sutura Optilene | Braun | C3090538 | |
| benzocaína | Sigma-Aldrich | E1501 | diluir para 0,03% antes de usar |
| Butorfanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG-diluir | para 0,5 mg/L antes de usar | |
| Broca 0,30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 Fórceps - Padrão/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Broca Manual | RISystem | RIS.390.130 | melhor ter pelo menos 3 peças |
| Micro CT analisador de dados | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan NRecon software | |
| Micro CT specimen scanner | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
| Pinça de íris Moria MC31b - lisa, curva, 10 cm | Ferramentas de Belas Ciências | 11373-12FST | 2 peças |
| Broca MouseFix-& Guia de serra 1,75 mm, | RISystem | RIS.301.102 | |
| Placa MouseFix 4 furos, | RISystem | RIS.401.110 | |
| Parafuso MouseFix, L =2,00 mm | RISystem | RIS.401.100 | precisa de 4 por osso |
| Pinça de padrão estreito | VWR | FSCI11002-12 | |
| penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Pinça de anel | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| bisturi #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
| Chave de caixa quadrada 0,50 mm | RISystem | , RIS.590.111 | |
| Cera de osso estéril, 2,5 g | Ethicon, Johnson & Tesoura Fina para | Johnson W810 | |
| - Reta/11.5cm | Ferramentas de Ciência Fina | 91460-11 |
Referências
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Reimpressões e permissões
