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Artigo de método

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

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DOI:

10.3791/66657

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26 de abril de 2024

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

Neste artigo

Resumo

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Resumo

Proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, desempenham funções essenciais, como divisão celular e manutenção da forma celular. Além disso, FtsZ e MreB surgiram como alvos importantes para novas descobertas de antimicrobianos. Vários ensaios foram desenvolvidos para identificar compostos direcionados à ligação de nucleotídeos e polimerização dessas proteínas do citoesqueleto, focados principalmente em FtsZ. Além disso, muitos dos ensaios são trabalhosos ou caros, e verificar se essas proteínas são o alvo celular da droga geralmente requer vários métodos. Finalmente, a toxicidade das drogas para as células eucarióticas também representa um problema. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em células de etapa única para descobrir novas moléculas direcionadas ao citoesqueleto bacteriano e minimizar os golpes que podem ser potencialmente tóxicos para as células eucarióticas. A levedura de fissão é passível de peneiras de alto rendimento baseadas em microscopia, e uma peneira visual pode identificar facilmente qualquer molécula que altere a polimerização de FtsZ ou MreB. Nosso ensaio utiliza a placa padrão de 96 poços e depende da capacidade das proteínas bacterianas do citoesqueleto de polimerizar em uma célula eucariótica, como a levedura de fissão. Embora os protocolos descritos aqui sejam para levedura de fissão e utilizem FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli, eles são facilmente adaptáveis a outras proteínas bacterianas do citoesqueleto que se montam prontamente em polímeros em qualquer hospedeiro de expressão eucariótica. O método aqui descrito deve ajudar a facilitar a descoberta de novos antimicrobianos direcionados às proteínas bacterianas do citoesqueleto.

Introdução

A resistência generalizada a quase todos os antibióticos atualmente empregados para combater infecções bacterianas criou uma necessidade imediata de novas categorias de antibióticos. Um relatório de 2019 indicou que as infecções resistentes a antibióticos resultaram na perda de 1,27 milhão de vidas, contribuindo para uma contagem geral de 4,95 milhões de mortes ao considerar complicações de infecções bacterianas resistentes1. Embora ainda seja eficaz na prática clínica, o arsenal atual de antibióticos visa predominantemente um espectro estreito de processos celulares, concentrando-se principalmente na parede celular, DNA e síntese de proteínas. Ao longo do último meio século, menos de 30 proteínas foram exploradas comercialmente como alvos para o desenvolvimento de novos antibacterianos 2,3. Essa gama limitada de alvos viáveis cria restrições significativas para a descoberta de novos antibióticos ou seus derivados para combater bactérias resistentes a antibióticos. Assim, para superar o problema emergente de resistência aos antibióticos, há a necessidade do desenvolvimento de novos antibióticos com novos alvos e mecanismos de ação.

Idealmente, um alvo antibacteriano deve ser um componente essencial do crescimento celular bacteriano, ser conservado em todas as espécies filogeneticamente diversas, mostrar menos homologia eucariótica e ser acessível a antibióticos4. Desde a descoberta das proteínas bacterianas do citoesqueleto envolvidas na divisão celular e na manutenção da forma celular, elas surgiram como um ponto focal promissor para o desenvolvimento de compostos antibacterianos5. Essas proteínas são essenciais para a viabilidade bacteriana e desempenham um papel fundamental na manutenção da forma celular (MreB, CreS), divisão (FtsZ, FtsA) e segregação de DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semelhante ao citoesqueleto em células eucarióticas. Notavelmente, FtsZ exibe um nível notavelmente alto de conservação em uma ampla gama de organismos procarióticos, enquanto MreB é encontrado em quase todas as bactérias em forma de bastonete. Essa ampla distribuição e relevância na viabilidade celular tornam essas proteínas um alvo fascinante na pesquisa de antibióticos 5,6,7.

É crucial adotar uma abordagem multifacetada que combine observações in vivo, interações in vitro e experimentos enzimáticos para validar completamente as proteínas do citoesqueleto bacteriano como o alvo primário de um inibidor potencial7. Procedimentos trabalhosos ou implicações substanciais de custo sobrecarregam muitos ensaios disponíveis para esse fim. Esses são obstáculos notáveis para sua utilização generalizada na triagem de compostos de chumbo que podem afetar o citoesqueleto bacteriano. Dentre estes, a microscopia se destaca como um método excepcionalmente eficiente e rápido para avaliar a eficácia dos compostos, examinando diretamente as mudanças na morfologia celular. No entanto, a heteroassociação da proteína-alvo com outros complexos do citoesqueleto, efeitos indiretos devido à ligação fora do alvo e alterações no potencial de membrana, dificuldade em penetrar na célula com eficiência e presença de bombas de efluxo, especialmente em bactérias Gram-negativas, tornam coletivamente complexo identificar a causa precisa da deformação celular bacteriana 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, ou levedura de fissão, como é comumente conhecida, é um organismo eucariótico unicelular em forma de bastonete. A levedura de fissão é amplamente utilizada como organismo modelo em biologia celular e molecular devido à extraordinária conservação em processos celulares, como o ciclo e divisão celular, organização celular e replicação cromossômica com eucariotos superiores, incluindo humanos11,12. Além disso, Errington e colegas expressaram uma proteína citoesquelética bacteriana localizada em pólo DivIVA em levedura de fissão para demonstrar que DivIVA se acumulou em superfícies curvadas negativamente13. Mais uma vez, Balasubramanian e seu grupo estabeleceram pela primeira vez a levedura de fissão como um sistema de modelo celular para trazer novos insights sobre o mecanismo, montagem e dinamicidade da proteína do citoesqueleto de actina de E. coli, como MreB14 e homólogo de tubulina FtsZ15. Eles também demonstram a capacidade do A22 de impedir eficientemente a polimerização do MreB por meio de microscopia de epifluorescência quando expresso em levedura14. Depois disso, outros grupos também empregaram com sucesso leveduras de fissão para estudar as propriedades de montagem das proteínas FtsZ1 e FtsZ2 do cloroplasto16. Mais recentemente, estabelecemos uma prova de conceito da viabilidade do uso de levedura de fissão como uma plataforma celular para rastrear especificamente inibidores do citoesqueleto bacteriano, conduzindo uma avaliação abrangente do impacto de três inibidores de FtsZ conhecidos - proteínas sanguinarina, berberina e PC190723-on FtsZ derivadas de duas bactérias patogênicas, a saber, Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori17. Além disso, este ensaio baseado em células de etapa única é fundamental para minimizar o risco de identificação de compostos que podem ser potencialmente tóxicos para células eucarióticas.

Neste relatório, utilizando o sistema de levedura de fissão, propomos um fluxo de trabalho sistemático usando a placa padrão de 96 poços para triagem semiautomatizada e quantificação do efeito de inibidores de pequenas moléculas direcionados a FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli. Aqui, configuramos e otimizamos o fluxo de trabalho semiautomatizado usando os inibidores estabelecidos PC190723 e A22 que visam especificamente FtsZ e MreB, respectivamente. Este fluxo de trabalho usa um microscópio de epifluorescência equipado com uma platina motorizada de alta precisão e aquisição automatizada de imagens em uma placa padrão de 96 poços para melhorar a padronização atual. Portanto, ele pode ser aplicado a telas de médio e alto rendimento de bibliotecas químicas sintéticas e contorna alguns dos desafios listados acima.

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Protocolo

1. Expressão de proteínas citoesqueléticas bacterianas marcadas com GFP em S. pombe

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre todos os plasmídeos e cepas usados aqui. Consulte a Tabela 2 para todas as composições de mídia.

  1. Realize a clonagem de E. coli MreB com uma fusão GFP N-terminal (GFP-MreB) e S. aureus FtsZ carregando uma GFP C-terminal (SaFtsZ-GFP) no vetor de expressão de S. pombe, pREP42 com um promotor repressível de tiamina de força média, nmt4118,19 conforme descrito anteriormente14,15. Manter, amplificar e isolar os plasmídeos das estirpes de E. coli (DH10β) conforme descrito em20,21.
    NOTA: Outras cepas de E. coli , como DH5α, XL1Blue, TOP10, etc. ou outras células competentes comercialmente disponíveis usadas rotineiramente para clonagem molecular também podem ser usadas.
  2. Transformação dos plasmídeos pREP42-GFP-EcMreB e pREP42-SaFtsZ-GFP em S. pombe
    1. Transforme os plasmídeos pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) e pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) em cepa de S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) usando o método de acetato de lítio22, conforme mencionado nas etapas abaixo.
    2. Dia 1 - Cultura primária: Inocule um loop cheio de cultura de S. pombe recém-listrada em 3 mL de extrato de levedura autoclavado e caldo de suplementos (YES). Incubá-lo num agitador orbital a 30 °C durante a noite (O/N).
    3. Dia 2:
      1. Cultura secundária: Adicione cerca de 500 μL de cultura primária a 30 mL de caldo YES autoclavado. Incubar a 30 °C durante 3 - 4 h com agitação até que o OD600 atinja 0,4 - 0,6.
        NOTA: Para cada transformação, 30 mL são usados.
      2. Pellet a cultura de 30 mL a 2.500 x g por 6-8 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e lavar as células com 50 ml de água destilada estéril (D/W). Derrube novamente e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de D/W estéril e transfira-o para um tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugue como acima e descarte o sobrenadante.
      3. Adicione 1 mL de acetato de lítio 0,1 M, solução de Tris-EDTA (LiAc-TE) e centrifugue como acima. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de LiAc-TE 0,1 M. Centrifugue e descarte o sobrenadante, deixando 100 μL de solução para trás.
      4. Adicione 10 a 20 μg de DNA transportador (DNA de esperma de salmão; desnaturado e resfriado rapidamente em gelo) e 2 a 3 μg do DNA do plasmídeo, que precisa ser transformado. Misture delicadamente. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Adicionar 260 μL de 40% de PEG/LiAc-TE; misture delicadamente. Incubar durante 60 min no shaker ou num termomixer a 30 °C com uma mistura suave. Adicione 43 μL de DMSO; misture delicadamente.
      6. Choque térmico a 42 °C por 10 min no termomisturador. Pellet a 2.500 x g por 6-8 min e descarte o sobrenadante. Lave o pellet 1x com 1 mL de D/W estéril.
      7. Pellet, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 μL de D / W estéril. Placa 100 μL em placas de meio mínimo de Edimburgo (EMM) contendo 5 μg / mL de tiamina (para reprimir o promotor nmt41 ) e suplementos de aminoácidos adenina (0,225 mg / mL), histidina (0,225 mg / mL) e leucina (0,225 mg / mL), mas sem uracila (marcador de seleção para plasmídeo pREP42).
        NOTA: Alternativamente, placa 70 μL e 130 μL em duas placas diferentes. Dois volumes diferentes (70 μL e 130 μL) são semeados para obter colônias isoladas em pelo menos uma das placas, dependendo das eficiências de transformação, que podem variar de experimento para experimento.
      8. Incubar as placas a 30 °C durante 2-3 dias até que as colónias apareçam. Misture uma única colônia com 100 μL de D / W estéril e espalhe em uma placa EMM nova contendo tiamina, mas sem uracila, conforme descrito acima.
      9. Incubar a 30 °C durante 2-3 dias até aparecer um relvado completo. Raspe o gramado crescido de células usando uma alça inoculante e ressuspenda-o para 1 mL de meio YES contendo 30% de glicerol em um frasco criogênico.
      10. Congelar rapidamente o frasco criogênico em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C para preservar os estoques de levedura congelados.
  3. Expressão de proteínas do citoesqueleto bacteriano em levedura de fissão
    1. Listre assepticamente um adesivo do estoque de glicerol em uma placa específica de levedura fresca para obter cultura suficiente para novos experimentos.
      NOTA: No caso do pREP42, usamos uma placa de ágar EMM (meio mínimo) contendo adenina, histidina e leucina (como usando a cepa de S. pombe (h- leu1-32 ura4-D18)) sem uracila (uracila presente no pREP42 como marcador de seleção). Adicionamos 15 a 20 μM de tiamina às placas de ágar (já que o pREP42 possui o promotor nmt41 repressível de tiamina) para reprimir a expressão do gene de interesse ao crescer na placa.
    2. Inocule uma pequena alça do inóculo do adesivo listrado em 5 mL de meio EMM específico para levedura sem tiamina e incube-o por 10 a 12 h a 30 ° C.
      NOTA: A expressão de FtsZ e MreB de diferentes espécies sob o promotor nmt41 no S. pombe pode variar, tipicamente de 16 a 30 h. O tempo ideal para a expressão proteica de GFP-EcMreB e SaFtsZ-GFP em S. pombe é de 20 a 24 h e 16 a 20 h a 30 °C, respectivamente, sem tiamina.

2. Tratamento de culturas de S. pombe expressando proteínas citoesqueléticas bacterianas marcadas com GFP

NOTA: Várias moléculas de medicamentos diferentes são testadas na cultura de levedura cultivada durante a noite em uma placa de 96 poços.

  1. Inocule uma cultura fresca transferindo 50 μL da cultura noturna para cada poço de uma placa de 96 poços contendo 150 μL de meio EMM de levedura fresca usando o instrumento de pipetagem multicanal semiautomatizado de 96 poços.
  2. Ao pipetar para dentro e para fora para uma mistura adequada usando uma pipeta multicanal semiautomatizada de 96 poços, introduza lentamente diferentes concentrações crescentes de medicamentos na cultura em crescimento, cada uma feita em triplicata, conforme representado no esquema da Figura 1.
  3. Como controle positivo, use os medicamentos já conhecidos, PC190723 para (S. aureus FtsZ) e A22 (para E. coli MreB) em duplicata.
    NOTA: Como relatado anteriormente, PC190723 e A22 foram usados em uma concentração de 56,2 μM17 e 72,6 μM 14,17, respectivamente. Enquanto isso, o tratamento A22 de SaFtsZ e PC190723 tratamento de EcMreB serviram como controles negativos, respectivamente.
  4. Use DMSO como controle de solvente em três concentrações diferentes de acordo com as concentrações mais baixas e mais altas de medicamentos.
    NOTA: O solvente no qual os medicamentos são dissolvidos é usado como controle de solvente.
  5. Incubar as culturas de controlo e tratadas a 30 °C durante 6-10 h (até que as células mostrem a expressão de proteínas fluorescentes bacterianas) e, em seguida, obter imagens utilizando microscopia de epifluorescência.

3. Visualização dos polímeros

  1. Aplicar uma camada de 20 μL de 1 mg/ml de concanavalina A em cada alvéolo da placa de fundo opticamente transparente de 96 poços (paredes pretas para imagens de fluorescência) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Aspire o líquido e deixe secar ao ar por 10 min.
  2. Transferir 20 μL de células da placa de cultura para cada poço respectivo e deixar descansar por 10 min. Lave a célula 3x-4x com o meio EMM estéril.
  3. Com a lente objetiva a ser usada no lugar (consulte a etapa 3.6), use o modo de navegação no painel de aquisição do software de aquisição de imagem para alinhamento de placas de 96 poços e cobertura de poços. Alinhe as bordas do poço no navegador.
  4. Em seguida, selecione os parâmetros de cobertura do poço, que incluem uma seleção de várias posições da região de interesse no poço, e use o controle de foco automático adaptativo com o modo sob demanda para manter a amostra em foco durante a geração de imagens.
  5. Adquira imagens usando contraste de interferência diferencial (DIC) e fluorescência. Defina filtros de excitação e emissão de 475/28 nm e 525/48 nm, respectivamente, para obter imagens das proteínas bacterianas marcadas com GFP expressas em leveduras. Obtenha pilhas Z em um tamanho de passo de 0,2 μm através da espessura das células de levedura (5 μm).
  6. Capture imagens usando um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 1,4 NA de 100x e uma câmera CMOS de 2.000 x 2.000 sCMOS (tamanho de pixel de 6,5 μm x 6,5 μm). Use um sistema de iluminação LED para excitação do fluoróforo.
    NOTA: Qualquer sistema de microscópio de epifluorescência que tenha uma platina motorizada para uma placa de 96 poços com posicionamento preciso de vários pontos deve ser adequado. Adquira todas as imagens celulares de controle e tratadas com drogas com um tempo de exposição semelhante (geralmente na faixa de 0,3 a 0,5 s) em um binning de 1 x 1 e iluminação de 15% a 20% para minimizar as variáveis do experimento e manter a consistência.

4. Quantificação das imagens usando ImageJ

  1. Processe imagens de células e meça o número de pontos por célula e a densidade de FtsZ17. No caso de MreB, meça a densidade e a anisotropia23 e compare entre as células controle e tratadas usando Fiji (v2.0.0-rc-69 / 1.52p) 24.
  2. Usando as imagens do canal DIC, primeiro contorne as células de levedura individuais usando a ferramenta de desenho à mão livre e salve como uma região de interesse (ROI) no gerenciador de ROI. Esta etapa ainda não é automatizada, mas ferramentas desenvolvidas recentemente usando aprendizado de máquina 25,26 podem ser tentadas e incorporadas em um futuro próximo.
  3. Mascarar a área externa da cela e preencher de preto conforme descrito em27.
  4. Use a macro de análise OPS threshold IJ1, um recurso integrado em Fiji, para contar o número de pontos24.
  5. Use o método otsu para limite automático e mascare as partículas segmentadas. Execute o plug-in analisar partículas usando uma macro.
  6. Para medir a densidade do polímero (quantidade de citoesqueleto por unidade de área em uma célula), processe as imagens conforme descrito, incluindo as etapas de mascaramento e esqueletização27,28. Use Lpx 2Dfilter no plug-in lpx para esqueletizar as imagens.
  7. Para obter detalhes, consulte esta publicação recente17. Realize a quantificação do polímero EcMreB conforme mencionado anteriormente em23, use anisotropia para quantificar a organização espacial usando FibrilTool29 conforme descrito anteriormente23.
    NOTA: Esses métodos de análise podem ser usados para quantificar quaisquer outras proteínas do citoesqueleto bacteriano que são tratadas ou não tratadas pelos medicamentos.

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Resultados

Instalação da placa de 96 poços para a triagem de drogas
O uso de S. pombe para expressar um S. aureus FtsZ marcado com GFP C- terminal de um vetor (pREP42) contendo o promotor repressível de tiamina de força média nmt41foi previamente estabelecido17 e, da mesma forma, o MreB de E. coli marcado com GFP N-terminal também foi expresso em S. pombe14. Também mostramos que PC190723, um inibidor específico de SaFtsZ...

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Discussão

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma séria ameaça à saúde global e há uma necessidade urgente de novos antibióticos com novos alvos. O citoesqueleto bacteriano emergiu como um alvo atraente para o desenvolvimento de novos antibióticos, com inibidores de pequenas moléculas da proteína de divisão celular FtsZ, como TXA709, já em ensaios clínicos de FaseI 30. Vários métodos têm sido desenvolvidos para identificar inibidores da polimerização de FtsZ 7,31

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

SMP, SR e AKS reconhecem as bolsas recebidas do Instituto Nacional de Educação e Pesquisa Científica, Departamento de Energia Atômica. O RS reconhece o apoio financeiro interno do Departamento de Energia Atômica, e este trabalho é apoiado por meio de uma bolsa de pesquisa para o RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) do Departamento de Biotecnologia (DBT). Os autores também agradecem a V Badireenath Konkimalla por seus comentários, sugestões e discussões ao longo do desenvolvimento do protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
96 Poços CC2 CVG Óptico Estéril, com Tampa. PretoThermo Scientific™
placa de 96 poçosCorning  
Cloridrato A22 Sigma SML0471Dissolvido em DMSO
AdeninaFormediumTMDOC0229225 mg/L de meio 
Concanavalina A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 
meio mínimo de Edimburgo (ágar EMM ou caldo EMM)para o PMD0210 médioTMVeja abaixo a composição
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 com controle deslizante de 2 posiçõesEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L de mídia 
Microscópio de fluorescência invertida Leica DMi8empresa alemãLeica Microsystems
DOC0157225 mg/L de mídia 
Acetato de lítio Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolvido em DMSO
Polietilenoglicol (PEG)Sigma 
FiltroTiamina SigmaT4625esterilizado
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L de meio, Armazene a solução a 36° C
SIM (Extrato de levedura + suplementos) ÁgarFormediumTMPCM0410Veja abaixo a composição
SIM (Extrato de levedura + suplementos) CaldoFormediumTMPCM0310Veja abaixo a composição
Levedura (S. pombe) meio  <
em>Extrato de levedura + suplementos (YES)
Composição<strong>g/L
Extrato de levedura5
Dextrose30
Agar17
Adenina0,05
L-Histidina0,05
L-Leucina0,05
L-Lisina HCl0,05
Uracila0,05
Edinburg meio mínimo (EMM)
Composiçãog/Lconcentração
hidrogênio ftalato 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593,5 mM
glicose2% (p/v) ou 20 g/L  111 mM
Sais (estoque x 50)20 mL/L (v/v)
Vitaminas (estoque x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerais (Estoque x 10.000)0.1 mL/L (v/v)
Sais x 50  52,5 g/l MgCl2,6H20 (0,26 M) 52,50,26 M
0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM) 0,0007354,99 mM
50 g/l KCl (0,67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitaminas x 1000  1 g/l de ácido pantotênico 14,20 mM
10 g/l de ácido nicotínico1081,2 mM
10 g/l inositol 1055,5 mM
10 mg/l de biotina 0,0140,8 µ M
Minerais x 10.000  bórico580,9 mM
MnSO4   423,7 mM
ZnSO4.7H2O413,9 mM
FeCl2.6H2O   27,40 mM
ácido molibdênico0,42,47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0,41,60 mM
de ácido cítrico 1047,6 mM
Cepas/Plasmídeos
CepasDescriçãoReferência
CCD190Escherichia coli DH10β  Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
160376CLS3370317275 A Leucine FormediumTM da 202398potássio de

Referências

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