Artigo de método

Gravação de base: uma técnica para analisar as respostas dos neurônios gustativos em Drosophila

DOI:

10.3791/66665

⸱

1 de março de 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método raramente usado de registro eletrofisiológico, o registro de base, permite a análise de características da codificação do sabor que não podem ser examinadas pelos métodos convencionais de registro. O registro de base também permite a análise das respostas gustativas a estímulos hidrofóbicos que não podem ser estudados usando métodos eletrofisiológicos tradicionais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os insetos saboreiam o mundo externo através de pêlos gustativos, ou sensilas, que têm poros nas pontas. Quando um sensillum entra em contato com uma fonte potencial de alimento, os compostos da fonte de alimento entram pelo poro e ativam os neurônios internos. Por mais de 50 anos, essas respostas foram registradas usando uma técnica chamada registro de pontas. No entanto, esse método tem grandes limitações, incluindo a incapacidade de medir a atividade neural antes ou depois do contato com o estímulo e a exigência de que os saborizantes sejam solúveis em soluções aquosas. Descrevemos aqui uma técnica que chamamos de gravação de base, que supera essas limitações. O registro de base permite a medição da atividade dos neurônios gustativos antes, durante e depois do estímulo. Assim, permite uma análise extensiva das respostas OFF que ocorrem após um estímulo gustativo. Pode ser usado para estudar compostos hidrofóbicos, como feromônios de cadeia longa, que têm solubilidade muito baixa em água. Em resumo, o registro de base oferece as vantagens da eletrofisiologia de sentido único como meio de medir a atividade neuronal - alta resolução espacial e temporal, sem a necessidade de ferramentas genéticas - e supera as principais limitações da técnica tradicional de registro de pontas.

Introdução

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Os insetos, incluindo as moscas drosofilídeos, são dotados de um sofisticado sistema gustativo que lhes permite extrair informações químicas complexas do ambiente. Esse sistema permite discernir a composição química de várias substâncias, distinguindo entre as nutritivas e as nocivas 1,2.

No centro desse sistema estão estruturas especializadas conhecidas como pêlos gustativos ou sensilas, estrategicamente localizadas em várias partes do corpo. Nas moscas drosofilídeos, essas sensilas estão localizadas no labelo, que é o principal órgão gustativo da cabeça da mosca 1,2,3,4, bem como nas pernas e asas 1,2,5,6. O labelo está localizado na ponta da tromba e contém dois lobos 4,7,8. Cada lóbulo é coberto com 31 sensilas gustativas categorizadas como curtas, longas e intermediárias 4,7,8. Cada uma dessas sensilas abriga 2-4 neurônios gustativos 1,2,9,10. Esses neurônios gustativos expressam membros de pelo menos quatro famílias de genes diferentes, a saber, os genes do receptor gustativo (Gr), receptor ionotrópico (Ir), batedor de carteira (Ppk) e potencial receptor transitório (Trp) 1,2,11,12,13. Essa diversidade de receptores e canais equipa os insetos com a capacidade de reconhecer uma ampla gama de compostos químicos, incluindo pistas não voláteis e voláteis 1,2,14.

Por mais de 50 anos, os cientistas quantificaram a resposta dos neurônios gustativos e seus receptores usando uma técnica chamada registro de ponta 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. No entanto, esse método tem grandes limitações. Primeiro, a atividade neural pode ser medida apenas durante o contato com o estímulo, e não antes ou depois do contato. Essa limitação impede a medição da atividade espontânea de pico e impede a medição das respostas OFF. Em segundo lugar, apenas os saborizantes solúveis em soluções aquosas podem ser testados.

Essas limitações podem ser superadas por uma técnica eletrofisiológica alternativa raramente usada chamada "registro de base". Aqui descrevemos essa técnica, que adaptamos de um método usado por Marion-Poll e colegas24, e mostramos os recursos cruciais de codificação de sabor que agora podem ser convenientemente medidos14.

Protocolo

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O protocolo a seguir está em conformidade com todas as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Yale.

1. Moscas

  1. Coloque 10-15 moscas recém-emergidas em frascos de cultura padrão frescos a 25 ° C e 60% de umidade relativa em um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
  2. Use moscas quando tiver 3-7 dias de idade.

2. Estímulos quimiossensoriais

  1. Obtenha estímulos quimiossensoriais da mais alta pureza disponível. Armazene-os conforme recomendado pelo fornecedor até o uso.
  2. Dissolva os estímulos quimiossensoriais e dilua até as concentrações desejadas em água ou outro solvente não tóxico desejado, como óleo de parafina. Agitar as soluções preparadas durante um mínimo de 1 h no caso de compostos sólidos dissolvidos.

3. Capilar de estímulo de vidro

  1. Puxe um capilar de vidro para reter o estímulo de um capilar de vidro de borossilicato (100 mm de comprimento, 1 mm de diâmetro externo, 0.58 mm de diâmetro interno) usando um instrumento extrator de pipeta. Procure obter um diâmetro de ponta entre 3 μm e 10 μm.
  2. Encha o capilar de vidro com a solução de estímulo preferida usando uma ponta de pipeta microcarregadora. Tome cuidado para evitar bolhas, que podem ser removidas batendo suavemente.
  3. Se o estímulo cristalizar na ponta, limpe ou substitua o capilar do estímulo de vidro.

4. Eletrodos de referência e registro

  1. Use hastes de tungstênio (127 μm de diâmetro e 76.2 mm de comprimento) para eletrodos de referência e registro. Afie os eletrodos de referência e registro com aproximadamente 1 μm de diâmetro na ponta (as formas desses eletrodos são representadas em Delventhal et al.36) mergulhando-os repetidamente por vários segundos em uma solução de KNO3 a 10% (~ 1 M) ou uma solução de KOH a 10% (1,8 M).
    NOTA: Esta solução requer corrente (0.3-3 mA) para facilitar este processo.

5. Preparação da mosca para gravação de base

  1. Desenhe uma única mosca do frasco para um aspirador. Retire o aspirador e prenda o animal colocando um dedo sobre a extremidade.
  2. Expulse a mosca para uma ponta de pipeta de plástico de 200 μL. Mantendo a extremidade do aspirador na ponta da pipeta, use a extremidade para empurrar a mosca para frente, de cabeça, em direção à extremidade estreita da ponta da pipeta.
  3. Apare a ponta da pipeta em cada extremidade (ou seja, anterior e posterior ao animal) usando uma lâmina de barbear.
  4. Use argila ou um pequeno pedaço de algodão para empurrar a mosca para frente, até que metade da cabeça se projete da extremidade da ponta da pipeta aparada. Use uma pinça para empurrar suavemente até que o labelo na frente da cabeça fique exposto.
  5. Fixe a ponta da pipeta aparada em uma lâmina de microscópio de vidro usando argila (Figura 1).
  6. Sob o estereomicroscópio, posicione o labelo lateralmente em uma lamínula de modo que um lóbulo, junto com sua sensila gustativa, fique exposto (Figura 1). A lamínula mantém o labelo no lugar.

6. Equipamento da eletrofisiologia

  1. Selecione uma sala para a configuração da plataforma que tenha temperatura e umidade relativa estáveis (<70%) e esteja isolada de fontes de ruído elétrico e mecânico, como geladeiras e centrífugas.
  2. Coloque o microscópio no centro de uma mesa antivibração.
  3. Prenda um micromanipulador manual à mesa antivibração (Figura 2).
  4. Conecte um eixo de aço inoxidável que prende o eletrodo de referência de tungstênio ao micromanipulador manual (Figura 2).
  5. Conecte os manipuladores motorizados - um com um suporte para a sonda do eletrodo de registro e um segundo com um suporte conectado a um eixo de aço inoxidável para o capilar de estímulo de vidro - à mesma mesa usando suportes (Figura 2).
  6. Conecte a sonda do eletrodo de gravação a um sistema Intelligent Data Acquisition Controller (IDAC) ou outro sistema amplificador/digitalizador.
  7. Conecte este sistema IDAC ao computador na estação de trabalho.
  8. Aterre os manipuladores manuais e motorizados no mesmo local dentro da plataforma.
  9. Instale o software de aquisição apropriado para o sistema IDAC no computador. Certifique-se de que os drivers de aquisição digital sejam compatíveis com o sistema operacional (por exemplo, Windows XP-7, -8 ou -10) no computador.

7. Gravação de sensila gustativa

  1. Coloque a lâmina de preparação na platina do microscópio com uma objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 10x) na posição. Mova o palco até que o labelo esteja em foco no centro do campo de visão em objetivas de baixa e alta ampliação (por exemplo, 50x).
  2. Insira o eletrodo de referência no olho usando a objetiva de baixa ampliação. Para inserir o eletrodo de referência, mire no olho do lado da mosca oposto ao lado com o eletrodo de registro, por exemplo, se o eletrodo de registro estiver se aproximando da direita, coloque o eletrodo de referência no olho esquerdo. Utilize um micromanipulador manual para uma inserção precisa.
  3. Traga a ponta do capilar de estímulo de vidro em foco no centro do campo de view de objetivas de baixa e alta ampliação usando um micromanipulador motorizado (Figura 3).
  4. Em baixa ampliação, aproxime o eletrodo de gravação do labelo usando um segundo micromanipulador motorizado.
  5. Sob alta ampliação, insira o eletrodo de gravação na base de um sensillum gustativo usando o micromanipulador motorizado até que o som da atividade de disparo neuronal da saída de áudio do sistema IDAC seja ouvido.
  6. Uma vez estabelecido um sinal estável, comece a gravar o sinal usando o software que acompanha o sistema IDAC (Figura 4A-D). Para iniciar a gravação, pressione o botão Iniciar gravação.
  7. Traga a ponta do capilar de vidro de estímulo para cobrir a ponta do sensillum gustativo usando o manipulador motorizado.
  8. Para finalizar o estímulo, remova o capilar de estímulo de vidro do sensillum usando o manipulador motorizado.
  9. Marque o início e o fim da estimulação manualmente usando um pedal. O pedal é conectado ao IDAC, e sua comunicação com o software é facilitada através do IDAC para marcar o início/fim do estímulo.

8. Análise

  1. Use as diferentes funções do software que acompanha o sistema IDAC para classificar as populações de pico por amplitude (quando possível) e analisar a dinâmica da resposta.
    1. Para contar picos, clique com o botão esquerdo do mouse na gravação de interesse, abrindo uma janela para selecionar. Escolha Para picos, iniciando outra janela chamada Converter ondas em picos. Digite um nome no campo Novo e pressione o botão OK .
    2. Inserir o nome no campo Novo na etapa 8.1.1 leva à visualização do histograma de amplitude . Escolha a amplitude a ser contada e feche essa visualização. Clique com o botão esquerdo para adicionar um contador.
    3. Examine os picos manualmente para confirmar as conclusões com base na análise com software.
      NOTA: O software também permite a exportação de dados em diferentes formatos para posterior análise.

Resultados

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A Figura 4A mostra picos espontâneos que surgem de um sensillum. Eles se enquadram em duas classes com base na amplitude, com os picos maiores derivados do neurônio que é sensível a compostos amargos e os picos menores do neurônio que responde aos açúcares. A relação entre a amplitude do pico e a especificidade funcional foi corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39.

A Figura 4B mostra a resposta do neurônio sensível ao amargo do sensillum S5 ao odor de DEET; essa resposta ocorreu sem qualquer contato entre a solução de DEET e o sensillum. Um pico parece ser de amplitude intermediária e pode resultar da superposição de dois picos menores, um do neurônio do açúcar e outro do neurônio mecanossensorial.

A Figura 4C mostra a resposta ON que ocorre após o contato entre um estímulo amargo e o sensillum I1, seguida por uma resposta OFF que ocorre após o término do contato. Não que a magnitude da resposta OFF, medida em picos/s, seja maior do que a resposta ON.

A Figura 4D mostra uma resposta ON e OFF ao composto amargo berberina de um sensillum I1 de outra espécie de mosca, Drosophila virilis. Uma das vantagens dessa técnica é que ela pode ser realizada em outras espécies, incluindo mosquitos, sem a necessidade de introduzir transgenes nelas.

A Figura 4E ilustra dois problemas que podem ocorrer durante a gravação. Primeiro, se o labelo não estiver devidamente preso, ele pode se mover, produzindo espinhos do neurônio mecanossensorial do sensillum. Em segundo lugar, o eletrodo de gravação pode se desalojar do sensillum, muitas vezes como resultado do movimento do labelo. Nesse caso, o contato é perdido e o eletrodo deve ser reinserido para registrar os picos.

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Figura 1: Preparação da mosca para gravação de base. Uma ponta de pipeta aparada contendo uma mosca fêmea com o labelo firmemente colocado em uma lamínula de vidro. (A) Tanto a ponta da pipeta quanto a lamínula são mantidas firmemente em montes de argila. (B) Maior ampliação do labelo apoiado em uma lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Configuração do equipamento de eletrofisiologia. (A) Uma visão geral mostrando as posições de um micromanipulador manual para o eletrodo de referência, um micromanipulador motorizado para o capilar de estímulo de vidro e um micromanipulador motorizado para o eletrodo de registro. (B) Visão geral mostrando os suportes para o eletrodo de referência, capilar de estímulo de vidro e eletrodo de registro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: O labelo e a sensila. (A) O labelo sob um microscópio invertido. Close-up do labelo mostrando a sensila gustativa de um lobo do labelo. Ele também mostra o estímulo capilar de vidro próximo a uma das grandes sensilas conhecidas como L2 (Large type 2) e um eletrodo de gravação na base desta sensillum. (B) Acessibilidade da sensila labelar. O labelo mostrando sensilas que são facilmente acessíveis à gravação de base e sensilas que são menos acessíveis devido à sua posição na preparação que geralmente usamos. Abreviaturas: A = anterior; M = medial; P = posterior; L = lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Exemplo de traços de picos espontâneos, respostas de neurônios amargos e gravação abaixo do ideal. (A) Exemplo de traço de picos espontâneos. Os picos são de um neurônio sensível ao amargo (pontos vermelhos) e um neurônio sensível ao açúcar (pontos verdes) em um sensillum I1. No desenho do sensillum, os neurônios amargo, açúcar e mecanossensorial são coloridos de vermelho, verde e preto, respectivamente. (B) Exemplo de traço da resposta do neurônio amargo (pontos vermelhos) em um sensillum S5 ao vapor de 1 mM DEET. Observe que os picos de pequena amplitude são do neurônio do açúcar e dos neurônios mecanossensoriais, que neste exemplo são difíceis de distinguir pela amplitude. Abreviatura: DEET = N,N-dietil-meta-toluamida. (C) Exemplo de traço de respostas ON e OFF de um neurônio amargo em sensila I1 a 1 mM de benzoato de denatônio. Os picos são observados antes (disparo espontâneo), durante (resposta ON) e depois (resposta OFF) do contato com o estímulo. Abreviatura: DEN = benzoato de denatônio. (D) Exemplo de traço de respostas ON e OFF de um neurônio amargo em I1 sensilla de D. virilis a 0,5 mM de cloreto de berberina. Os picos são observados antes, durante e após o contato. Abreviatura: BER = cloreto de berberina. (E) Exemplo de traço de uma gravação abaixo do ideal. O contato foi perdido no meio do experimento devido ao movimento do labelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Em gravações de alguns tipos de sensilas, pode ser um desafio diferenciar os picos de diferentes neurônios. Por exemplo, os neurônios de açúcar e os neurônios mecanossensoriais das sensilas S e I produzem picos de amplitudes semelhantes, dificultando a distinção 4,14. Descobrimos que o uso de um eletrodo de gravação de tungstênio muito afiado reduz o disparo do neurônio mecanossensorial, assim como a colocação criteriosa do eletrodo de gravação. A inserção do eletrodo de registro no colar do soquete sensillum (ou seja, na base, mas não profundamente) geralmente resulta em estimulação mecanossensorial reduzida. Além disso, descobrimos que, se uma gravação tiver um alto nível de disparo do neurônio mecanossensorial, retirar o eletrodo de gravação e colocá-lo em uma posição diferente em relação ao sensillum geralmente leva a um nível mais baixo de disparo.

Garantir a estabilidade do eletrodo de registro durante os experimentos é outra questão crítica (consulte a Figura 4E). Distúrbios mecânicos ou mudanças na posição do eletrodo podem afetar adversamente a qualidade dos registros. Investir tempo e esforço em uma preparação completa, conforme especificado no protocolo descrito acima, é fundamental para evitar a frustração que pode resultar do movimento do labelo.

Notamos um outro problema que observamos com certos compostos que produzem respostas ON e OFF de I sensilla da classe I-a14. Às vezes, uma segunda entrega de um estímulo provoca a resposta OFF, mas não a ON. A razão para essa redução na resposta do NO é desconhecida.

Outro desafio encontrado na gravação de base é que nem todas as sensilas são facilmente acessíveis para gravação devido à sua posição no labelo. Das 31 sensilas labelares, apenas 26 são convenientes para registro, apresentando uma limitação à técnica, conforme ilustrado na Figura 3B. No entanto, em princípio, essas sensilas (I8, I9, I10, L9 e S10) podem ser acessíveis pela rotação do estágio XY mecânico do microscópio Olympus.

Por fim, enfatizamos a importância de investir esforços na preparação de moscas. Uma mosca bem preparada tem muito mais probabilidade de produzir gravações confiáveis e de alta qualidade ao longo do experimento. Além disso, a sacarose pode ser usada como controle positivo para garantir a qualidade do registro; provoca uma resposta de todas as sensilas labelares.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Zina Berman pelo apoio, a Lisa Baik pelos comentários sobre o manuscrito e a outros membros do laboratório Carlson pela discussão. Este trabalho foi apoiado pela concessão K01 do NIH DC020145 para HKMD; e o NIH concede R01 DC02174, R01 DC04729 e R01 DC011697 para J.R.C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MicroscópioOlympusBX51WIequipado com uma objetiva de 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) e oculares de 10X. 
Mesa AntivibraçãoTMC63-7590E
Micromanipuladores motorizadosHarvard Apparatus e Mä rzhä usuário MicromanipuladoresMicromanipulador PM 10 Micromanipulador
manual MicromanipuladoresMä rzhä usuário MicromanipuladoresMM33 Micromanipulador
Suportes magnéticosENCOModelo #625-0930
Referência  e gravação Suporte de eletrodoOckenfels Syntech GmbH
Suporte capilar de vidro stimulusOckenfels Syntech GmbH
Sonda universal de extremidade únicaOckenfels Syntech GmbH
CONTROLADOR DE AQUISIÇÃO USB DE 4 CANAIS, IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Computador pessoal Ockenfels Syntech GmbH55
Computador pessoalDellVostroVerifique a compatibilidade com o sistema de aquisição digital e software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Folha de alumínio e/ou gaiola de FaradayBlindagem de ruído eletromagnético
Capilares de vidro borosilicatoInstrumentos de Precisão Mundial1B100F-4
Extrator de PipetasSutter Instrument CompanyModelo P-97 Extrator
EstereomicroscópioOlympusVMZ 1x-4xPara preparação de moscas
p200 PontasGenéricas
Dicas para microcarregadeiras EppendorfE5242956003
Seringade
Clipes de crocodilo Transformadores
de potênciaSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BMontado a partir de pontas de pipeta P1000, tubo de plástico flexível e malha
ArgilaGenérico
Fórcepsgenérico
Tubo de PlásticoSaint GobainTygon S3™ E-3603
Frascos de cultura padrãoArchon ScientificNarrow 1 oz de poliestireno vails, cada um com 10 mL de meio de glicose, pré-carregado com tampões de acetato de celulose
Cloreto de berberina (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Benzoato de denatônio (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Dietil-m- toluamida (DEET)Sigma-AldrichCat# Rolamento 36542
Piezo Controladores de estímulo CS de Micropipetas Flamejante/Marrom de Pipeta 1 ml Genérico de modelagem

Referências

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