O protocolo demonstra um método para coletar sangue de veias porta e veia cava inferior de camundongos sequencialmente para avaliar a produção e absorção de metabólitos microbianos intestinais.
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Artigo de método
Coleta sequencial de sangue da veia cava inferior seguida da veia porta para avaliar metabólitos microbianos intestinais em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sabe-se que os produtos microbianos intestinais atuam localmente no intestino e são absorvidos pela circulação, onde seus efeitos podem se estender a vários sistemas de órgãos distantes. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são uma classe de metabólitos produzidos por micróbios intestinais durante a fermentação de fibras alimentares não digeríveis. Eles agora são reconhecidos como contribuintes importantes para a forma como o microbioma intestinal influencia os sistemas de órgãos extra-intestinais por meio do intestino-pulmão, intestino-cérebro e outros eixos de órgãos intestinais em todo o hospedeiro. Os SCFAs são absorvidos do cólon, através do tecido intestinal, para a veia porta (PV). Eles então passam pelo fígado e são consumidos em vários órgãos, como cérebro, músculo, tecido adiposo e pulmões. Os AGCCs são mais facilmente medidos no material fecal expelido, no entanto, medições mais precisas foram obtidas a partir do conteúdo fecal intracolônico. Aqui, propomos que a amostragem de PV e plasma circulante sistêmico de um único indivíduo pode ser preferível para estudar a absorção, transporte e níveis sistêmicos de SCFAs em camundongos. Apresentamos uma nova técnica para amostragem eficiente de sangue da VP e veia cava inferior (VCI) que permite a coleta de volumes relativamente grandes de sangue das circulações portal e sistêmica. Isso é feito ligando o PV, permitindo assim a dilatação ou ampliação do PV à medida que ele se enche das veias mesentéricas que drenam para ele. Usando esse método, conseguimos melhorar a taxa de coleta bem-sucedida, bem como a quantidade total de sangue coletado (até 0,3 mL de VCI e 0,5 mL de PV).
Introdução
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são uma classe importante de metabólitos produzidos pela microbiota intestinal. Seus papéis críticos na interação entre o microbioma intestinal e outros órgãos distantes1 foram apoiados por pesquisas que descrevem como eles modulam a inflamação, sinalizam por meio de receptores dedicados e servem como substratos no metabolismo celular 2,3,4,5. Trabalhos recentes de nosso grupo propuseram que os SCFAs são reguladores inflamatórios in vivo do tônus imunológico pulmonar in vivo através do eixo intestino-pulmão 6,7. Relatórios adicionais descreveram sua influência funcional no metabolismo através do eixo intestino-cérebro 8,9. No geral, a influência dos SCFAs na fisiologia e patologia do hospedeiro está sob investigação ativa e intensa por vários grupos de pesquisa que abrangem uma ampla gama de processos de doenças.
Acetato (C2), propionato (C3) e butirato (C4) são os SCFAs primários e são gerados pela microbiota intestinal através da fermentação de fibra alimentar ingerível no ceco e no intestino grosso. Todos os três SCFAs também podem ser obtidos diretamente da dieta, e apenas o acetato também pode ser produzido por células de mamíferos. Os SCFAs são absorvidos no cólon e são parcialmente utilizados pelas células epiteliais intestinais (como fonte de energia, para modulação imunológica do tecido local e para apoiar a manutenção da barreira intestinal). Eles também são transportados para a veia porta através do sistema venoso mesentérico10. O butirato é consumido principalmente pelo epitélio intestinal, o propionato pelo fígado11,12 e o acetato tem sido relatado para atuar nos tecidos muscular e adiposo após entrar na circulação periférica13,14.
Uma avaliação abrangente da produção, absorção e atividade funcional do AGCC requer conhecimento dos níveis de AGCC no lúmen do cólon, na circulação portal e no sangue periférico. Isso pode ser feito por coleta de sangue da veia porta (VP) e circulação sistêmica simultânea ou sequencialmente no mesmo animal. Como os AGCC são voláteis15, medir seus níveis em pelotas fecais expelidas pode não refletir com precisão os níveis dentro do cólon. Além disso, em comparação com as medições do conteúdo do cólon, o nível de SCFAs presentes no PV pode refletir com mais precisão a soma líquida dos níveis de estado estacionário absorvidos pelo hospedeiro versus os níveis desiguais produzidos pelo microbioma intestinal em todo o comprimento do cólon11. Esses níveis de PV SCFA podem, portanto, ser mais relevantes e apropriados para estudar os efeitos dos SCFAs na fisiologia e patologia do hospedeiro além dos efeitos locais no intestino.
Para realizar a coleta coordenada e quase simultânea de PV e sangue circulante sistêmico, o diafragma deve permanecer intacto para manter a circulação sanguínea normal e apoiar a respiração espontânea. Portanto, a veia cava inferior (VCI) apresenta um local ideal para a obtenção de sangue de circulação sistêmica durante a coleta de sangue de VP. Este sangue da VCI também pode ser usado para outros fins, como medir citocinas circulantes para avaliar a inflamação sistêmica.
Atualmente, apenas alguns métodos de coleta de sangue da circulação sistêmica e da PV foram relatados em roedores maiores16,17. Os métodos convencionais, que requerem canulação de vasos em ratos, são tecnicamente difíceis de realizar em camundongos. Além disso, a quantidade máxima de sangue coletada por esses métodos geralmente não é superior a 0,3 mL18.
Neste artigo, apresentamos um novo método que simplifica o processo de coleta dupla de sangue da VCI de camundongo seguida de PV no mesmo animal. A característica única do método é a ligadura da VP perto do hilo hepático pouco antes da amostragem de sangue da VP. Essa abordagem pode expandir as dimensões do PV, melhorando significativamente a taxa de sucesso, bem como aumentando o volume máximo de sangue coletável em até 0,5 mL.
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Protocolo
Todas as etapas deste procedimento de não sobrevivência foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em São Francisco. O sexo e a linhagem do camundongo utilizados foram camundongos C57BL/6J machos (pesando 25-35 g e com idade entre 12 e 15 semanas). Fêmeas e/ou outras linhagens de camundongos padrão também podem ser usadas.
1. Anestesia
- Limpe a metade inferior do abdômen do camundongo com cotonetes de etanol a 70%. Administre anestesia administrando uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg / kg). Cetamina/xilazina ou isoflurano também podem ser usados. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar danos à córnea.
- Injete buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via intraperitoneal para analgesia.
NOTA: A buprenorfina é necessária devido à dor associada ao procedimento de laparotomia.
2. Laparotomia
- Coloque o mouse anestesiado na superfície cirúrgica (com uma almofada de aquecimento embaixo) na posição supina. Prenda todos os membros do mouse na placa cirúrgica com fita adesiva. Confirme se a profundidade apropriada da anestesia foi alcançada por pinça do dedo do pé sem reflexo de retirada do pedal.
- Levante a pele e faça uma incisão longitudinal com uma tesoura de dissecação ao longo da linha média do umbigo ao apêndice xifóide e caudalmente em direção à base do abdômen (órgão genital externo).
- Faça uma incisão semelhante no peritônio com uma tesoura de dissecação sem perfurar ou danificar os intestinos, o diafragma ou o fígado.
- Expanda o campo cirúrgico fazendo uma incisão transversal de comprimento total (estendendo a largura do abdômen) com uma tesoura em ambos os lados do umbigo.
- Mova os intestinos grosso e delgado para o lado direito do cirurgião usando uma gaze limpa embebida em PBS quente para expor a VCI abaixo.
3. Preparação de ligadura para PV
- Manipule suavemente os segmentos intestinais dentro do campo cirúrgico com um cotonete para localizar o PV na raiz do mesentério.
- Usando um microscópio de dissecação para visualizar os vasos e outras estruturas abdominais, passe cuidadosamente uma sutura de prolene 7-0 atrás da VP perto do hilo hepático (entre a veia duodenal e a veia esplênica)19 para que esteja pronto para a ligadura na etapa 5 (Figura 1).
NOTA: O uso de um microscópio a partir desta etapa não é obrigatório, mas melhora significativamente a taxa de sucesso geral do procedimento.
4. Coleta de amostras de sangue do IVC
- Insira a agulha 28G de 1/2 polegada de uma seringa de insulina heparinizada de 1 cc no VCI. Colete 0,2-0,3 mL de amostra de sangue.
NOTA: Se muito sangue for removido nesta etapa, isso resultará em volumes menores de sangue PV coletados na etapa 5. - Deixe a agulha dentro da VCI para evitar o sangramento que ocorreria com a remoção.
5. Coleta de amostra de sangue do VP
- Amarre suavemente a ligadura de prolene 7-0 ao redor do PV; o PV deve se expandir e dilatar à medida que é preenchido. Insira a agulha 28G de 1/2 polegada de outra seringa de insulina heparinizada de 1 cc no PV.
- Aspire lentamente para coletar até 0,3-0,5 mL de sangue do PV. O PV pode entrar em colapso, mas deve se expandir gradualmente com o reabastecimento de sangue do sistema venoso mesentérico.
6. Armazenamento da amostra
- Remova as agulhas da VCI e PV após a coleta de sangue.
- Transfira as amostras de sangue das seringas para tubos eppendorf heparinizados de 1,5 mL e coloque-as no gelo para posterior processamento em plasma para armazenamento e análise conforme necessário.
- Eutanásia do camundongo usando overdose de anestésico seguida de luxação cervical (de acordo com as diretrizes aprovadas pela UCSF IACUC).
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Resultados
Usando o método descrito acima, podemos coletar amostras de sangue do IVC e PV sequencialmente no mesmo camundongo com uma taxa de sucesso de mais de 95%. Os volumes médios de amostras de sangue coletadas são de 0,25 mL para a VCI e 0,35 mL para a VP.
Usando cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), medimos a concentração de SCFAs nas fezes, sangue PV e sangue IVC e, assim, fomos capazes de rastrear a absorção e o trânsito de acetato (C2), propionato (C3) e butirato (C4) do compart...
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Discussão
Este artigo descreve um método inovador in vivo para coleta quase simultânea de amostras de sangue sequencialmente da VCI e PV no mesmo camundongo experimental. Este método é útil para medir os níveis de produtos gerados pela microbiota intestinal, como SCFAs, que transitam pela circulação portal. O volume máximo médio de sangue que pode ser coletado durante um procedimento terminal em camundongos (pesando 25-30 g) é de aproximadamente 1 mL/camundongo, o que por sua vez represen...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
AP é financiado por um prêmio R01 do NIH / NHLBI (1R01HL146753). O DM é financiado por uma bolsa T32 do NIH e por um Trainee / Staff Pilot Awards do UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 Tribromoetanol, 97% (Avertin) | Sigma Aldrich | T48402-25G | Agente anestésico |
| Injeção de Cloridrato de Buprenorfina 0.3 mg/mL | PAR Farmacêutica | NDC 42023-179-05 | Agente Analgésico |
| Dressing Fórceps | Miltex | 6-100 | Dissecção |
| Fórceps Graefe | Roboz | RS-5136 | Dissecção |
| Hepatina sódica 1000 unidades USP/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 | Seringas/tubos de amostra de sangue heparinização |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Ligadura de veia portal |
| Tesoura F.S.T | 14058-11 | Dissecção | |
| Estudante Halsted-Mosquito Hemostats | F.S.T | 91308-12 | Dissecção |
| Fita cirúrgica | 3M Transpore | 1527-1 | Fixação de membros de camundongo |
| U-100 Seringa de Insulina 28G1/2 | EXEL | 26027 | Coleta de amostras de sangue |
Referências
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Reimpressões e permissões
